張玉薇 婁桂予 楊科 陽琳 朱青 雷博

1河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所 河南省遺傳性疾病功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450003；2河南省人民醫(yī)院 河南省眼科研究所 河南省立眼科醫(yī)院，鄭州 450003

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一類常見的遺傳性眼病，全球患病率為1/7 000～1/3 000，其在中國的患病率約為1/4 000[1-2]。RP患者多在兒童和青少年時(shí)期發(fā)病，主要表現(xiàn)為夜盲、進(jìn)行性視野缺損、視力下降和視網(wǎng)膜骨細(xì)胞樣色素沉著，其病理過程為視桿細(xì)胞首先出現(xiàn)進(jìn)行性變性，進(jìn)而視錐細(xì)胞受累，最終導(dǎo)致視桿和視錐細(xì)胞及色素上皮功能喪失[3]。RP的診斷主要依據(jù)眼底、視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)和視野檢查，特殊情況可考慮光相干斷層掃描檢查。臨床上尚無控制RP進(jìn)展及治療RP的有效方法，明確病因、植入前進(jìn)行分子診斷、降低攜帶致病突變患兒的出生率是降低RP患病率的有效方法。RP具有高度遺傳異質(zhì)性，目前已鑒定的致病基因約有96個(gè)(https://sph.uth.edu/retnet/)。RP的遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X染色體連鎖遺傳，少數(shù)患者可表現(xiàn)為雙基因遺傳及線粒體遺傳[4]。由于RP表現(xiàn)出高度的遺傳異質(zhì)性和臨床表型多樣性，鑒定RP患者的致病基因?qū)τ谡_的分類和診斷至關(guān)重要[5-6]。本研究擬對常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)一家系的致病基因和臨床表型進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用家系調(diào)查研究，收集2019年11月于河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所進(jìn)行遺傳咨詢的來自河南省東部地區(qū)的漢族RP一家系，納入該家系4代20名成員，包括9例患者和11名表型正常者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[批文號：HNEECKY-2019(15號)]，所有受檢者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1臨床檢查 采用標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)視力表(i.Polatest，德國Carl Zeiss AG公司)測定視力，免擴(kuò)瞳眼底照相機(jī)(VISUCAM-200，德國Carl Zeiss AG公司)檢查眼底，眼電生理診斷系統(tǒng)(RET1-Port 21 compact，德國羅蘭公司)檢查視網(wǎng)膜功能，視野分析儀(840，德國Carl Zeiss AG公司)檢查視野。

1.2.2基因檢測 采集先證者及家系成員外周靜脈血各2 ml，置于EDTA抗凝管，混勻后按照DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)步驟提取DNA，Qubit?2.0(美國Life Technologies公司)對DNA定量。采用高通量測序儀(Ion Torrent PGM，美國ABI公司)進(jìn)行基因檢測。

1.2.2.1Ion AmpliSeq引物包建庫及靶向測序 采用Ion AmpliSeq Designer(https://www.ampliseq.com)設(shè)計(jì)覆蓋43個(gè)RP基因外顯子區(qū)域，包含1 187個(gè)擴(kuò)增子的AmpliSeq引物包，并由美國Life Technologies公司合成。按照Ion AmpliSeq Library Kit 2.0建庫試劑盒(美國Life Technologies公司)流程對先證者進(jìn)行靶向外顯子建庫，Qubit-dsDNA-HS試劑盒(美國Life Technologies公司)對制備的文庫進(jìn)行定量檢測，高通量測序儀測序。采用Ion Torrent Suite v5.6系統(tǒng)進(jìn)行Ion Torrent數(shù)據(jù)質(zhì)控、序列比對及單核苷酸變異(single nucleotide variations，SNVs)和插入缺失(inserts and deletions，indels)變異檢測。質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)顯示，靶向外顯子平均覆蓋度為99.94%，平均測序深度為300×。得到的SNVs和indels經(jīng)dbSNP 138數(shù)據(jù)庫過濾后，檢索HGMD、NCBI等數(shù)據(jù)庫匹配已報(bào)道的致病位點(diǎn)。對發(fā)現(xiàn)的可疑致病突變采用Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2.2PCR反應(yīng)及Sanger法測序 根據(jù)變異序列采用primer blast在線(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物有限公司合成。擴(kuò)增含有變異的外顯子，對PCR片段進(jìn)行純化和測序。序列數(shù)據(jù)文件采用SeqMan Pro軟件8.1.4版(DNASTAR)分析。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 采用在線軟件(http://www.mutationtaster.org/、http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/和https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測變異位點(diǎn)蛋白功能及空間結(jié)構(gòu)。采用ClustalW2多重比對程序?qū)θ?Genbank：NP_000530.1)、牛(Genbank：NP_001014890.1)、家犬(Genbank：NP_001008277.1)、黑猩猩(Genbank：XP_516740.2)、貓(Genbank：NP_001009242.1)及小鼠(Genbank：NP_663358.1)視紫紅質(zhì)(rhodopsin，RHO)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。根據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南判斷變異位點(diǎn)致病性[7]。

2 結(jié)果

2.1 家系患者臨床特點(diǎn)

該家系4代共有9例RP患者，符合常染色體顯性遺傳方式(圖1)。先證者，男，26歲，自幼雙眼夜盲，視力右眼0.25，左眼0.5。雙眼視網(wǎng)膜有骨細(xì)胞樣色素沉著，視網(wǎng)膜血管變細(xì)，視盤顏色變淡(圖2)；全視野ERG檢查結(jié)果顯示，暗適應(yīng)a波和b波峰值降低；明適應(yīng)a波和b波峰值重度降低；暗適應(yīng)震蕩電位重度下降；明適應(yīng)3 ERG a、b波均重度下降；明適應(yīng)30 Hz閃爍ERG右眼振幅中度下降，左眼振幅輕度下降(圖3)。家系成員患者的共同表現(xiàn)為7～10歲開始出現(xiàn)夜盲，約50歲時(shí)周邊視力完全喪失。

2.2 靶向基因高通量測序

該家系檢測到RHO基因(NM_000539.3)5號外顯子中的1個(gè)雜合錯(cuò)義變異c.982delC(p.L328fs)。經(jīng)Mutation taster軟件預(yù)測，該變異導(dǎo)致編碼序列第328位氨基酸處的亮氨酸缺失并發(fā)生移碼，改變了包括第328位氨基酸以后的21個(gè)氨基酸，造成終止密碼子改變，使編碼區(qū)由348個(gè)氨基酸增加到358個(gè)氨基酸，預(yù)測變異可導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(圖4)。

2.3 RHO基因c.982delC變異Sanger測序驗(yàn)證及致病性分析

臨床診斷為RP的患者(Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅲ3、Ⅲ5、Ⅲ8、Ⅳ1、Ⅳ2和Ⅳ5)均檢測到了c.982delC變異，無癥狀成員未檢測到該位點(diǎn)變異。RHO基因編碼RHO蛋白的多個(gè)同源序列比對分析表明，6個(gè)不同物種之間第328位亮氨酸殘基(p.L328)均保守(圖5)。根據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南判斷：(1)缺失移碼變異屬于非常強(qiáng)的致病性證據(jù)(PVS1)；(2)該變異在ExAC和千人基因組數(shù)據(jù)庫中均未被收錄，屬于中等致病性證據(jù)(PM2)；(3)HGMD(CM973326)和Retina International數(shù)據(jù)庫(http://www.retina-international.org)曾報(bào)告RHO基因編碼第328氨基酸的堿基錯(cuò)義致病變異，其中Leu(密碼子：GAG)被Pro取代，屬于中等致病性證據(jù)(PM5)；(4)家系多個(gè)患者中檢測到此變異，變異與疾病在家系中共分離，屬于支持致病性證據(jù)(PP1)；(5)Mutation taster軟件預(yù)測該缺失移碼變異偏向致病性，屬于支持致病性證據(jù)(PP3)；(6)家系患病成員臨床表型符合RP，屬于支持致病性證據(jù)(PP4)。綜上，該變異具有1個(gè)非常強(qiáng)的致病性證據(jù)PVS1，2個(gè)中等致病證據(jù)PM2，3個(gè)支持致病證據(jù)PP1、PP3、PP4，屬于致病性變異。

3 討論

RP是常見的眼科遺傳病，在已發(fā)現(xiàn)的96個(gè)致病基因中，有30個(gè)基因表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，基因檢測是對ADRP進(jìn)行分子診斷的重要依據(jù)。二代測序技術(shù)是目前臨床上用于檢測基因變異的一種可行、省時(shí)的方法[8]。本研究采用引物包靶向擴(kuò)增高通量測序的方法，與全外顯子測序相比，本方法適用于單種疾病，有較高的性價(jià)比，分析有針對性，且操作快捷、簡單。對于涉及幾十種基因的RP，靶向包測序的方法更加適用。

本研究在該家系中檢測到了RHO基因c.982delC雜合變異。RHO基因編碼含有348個(gè)氨基酸的RHO蛋白，RHO是G蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員之一，RHO蛋白C端第310～349位氨基酸可與11-順-視黃醛形成功能性發(fā)色。當(dāng)光子照射到RHO時(shí)，11-順-視黃醛異構(gòu)化，在視桿細(xì)胞中啟動(dòng)光轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)[9]，在將光能轉(zhuǎn)換為電能的光轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用。C端變異影響RHO在高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，并損害光感受器外段的正常功能[10]。RHO蛋白C端的重要靶向序列VXPX-COOH也控制著視桿細(xì)胞外段的感光功能，其基序VXPX的缺失會(huì)導(dǎo)致RP[11-12]。該家系中RHO基因的c.982delC移碼變異改變了高度保守的氨基酸殘基328～349區(qū)域，其中包括VXPX基序，該變異很可能通過破壞RHO蛋白的正常光轉(zhuǎn)導(dǎo)功能而致病。

RHO錯(cuò)義變異是RP中較常見的變異類型，在中國人群中RHO變異占所有RP病例的1.30%～5.65%，占ADRP的8.11%～15.00%[13]，而在高加索人群中，RHO變異占ADRP的16%～26%。在一項(xiàng)對200名西班牙RP先證者的研究中發(fā)現(xiàn)，27個(gè)RHO變異中有25個(gè)是錯(cuò)義變異[14]。在另外一項(xiàng)涉及中國248名RP先證者的研究中，檢出的錯(cuò)義變異占RHO變異的87.5%(7/8)[15]。HGMD和Retina International數(shù)據(jù)庫曾收錄RHO基因編碼第328位氨基酸的堿基錯(cuò)義變異，其中Leu(密碼子：GAG)被Pro取代。截至目前，RHO基因的c.982delC(p.L328fs)移碼變異未在大的家系中被報(bào)道。Sullivan等[16]在散發(fā)病例中檢測到該變異，但未對該變異的致病性進(jìn)行詳細(xì)說明。另一項(xiàng)研究試圖用高通量細(xì)胞學(xué)方法來篩選RHO在細(xì)胞中的表達(dá)以分析該變異的致病性，但并未得到確切的結(jié)果[17]。本研究為首次在中國漢族RP家系中對該變異進(jìn)行驗(yàn)證。

RHO變異導(dǎo)致的RP有一定的基因型和表型的相關(guān)性。RHO中的錯(cuò)義變異與象限型RP相關(guān)[18]。RHO蛋白COOH末端序列的變異與早發(fā)性侵襲性RP相關(guān)[19]。本研究中RP家系的臨床表現(xiàn)與之前報(bào)道的相似，即患者青少年時(shí)期即出現(xiàn)夜盲，在50多歲時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重視力損害，包括中心視力喪失。本家系患病成員雖然攜帶有相同的致病突變位點(diǎn)，但由于個(gè)體差異，臨床表現(xiàn)也不盡相同，如視力、視野等。先證者的主要目的是進(jìn)行遺傳咨詢，我們?yōu)樵撓茸C者找到了高度可疑的致病突變。以此為基礎(chǔ)，本課題組正在構(gòu)建小鼠動(dòng)物模型，以進(jìn)一步探索該突變的致病機(jī)制。

綜上所述，本研究通過對中國漢族ADRP一家系的研究證實(shí)了RHO基因c.982delC雜合變異的致病性，該突變在中國漢族家系中首次報(bào)道。本研究為指導(dǎo)該家系成員的優(yōu)生優(yōu)育提供了分子診斷依據(jù)，并且該發(fā)現(xiàn)豐富了RP致病突變數(shù)據(jù)庫信息，為深入研究RP的致病機(jī)制提供了新的線索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突