朱茂林 朱煌

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院眼科 200092

極低頻電磁場(extremely low frequency electro-magnetic fields，ELF-EMFs)輻射是一種頻率低于300 Hz的非電離輻射，各類電力傳輸系統(tǒng)、日常使用的各種電子設(shè)備均釋放出不同能量的ELF-EMFs[1-3]。日常生活中人們使用電子產(chǎn)品的時間越長，眼與ELF-EMFs接觸的時間和累積劑量也越大。在眼的生長發(fā)育過程中，眼部的成纖維細(xì)胞起著重要作用，鞏膜重塑、眼眶構(gòu)建、脈絡(luò)膜的發(fā)育與成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為有關(guān)，電子產(chǎn)品的過度使用可能會對成纖維細(xì)胞造成影響，從而促進眼部疾病的發(fā)生[4]。目前，ELF-EMFs對成纖維細(xì)胞行為的影響尚未明確。mRNA是一種重要的基因表達載體，承接著轉(zhuǎn)錄到翻譯的功能[5]。隨著技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展以及高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，可以使用生物信息學(xué)方法對不同樣本之間的生物學(xué)進程、分子功能和細(xì)胞組分進行分析[6]。本研究擬對成纖維細(xì)胞受ELF-EMFs干擾后基因的差異表達和一些關(guān)鍵信號通路及可能參與細(xì)胞輻射后應(yīng)激的差異基因mRNA表達量的變化進行分析和總結(jié)，為相關(guān)眼病的發(fā)病機制研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來源 NIH/3T3細(xì)胞系(FH0380)購于上海富衡生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖質(zhì)量濃度為4 500 mg/L)、澳洲胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetra acetic acid，EDTA)消化液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、青鏈霉素溶液、Trizol試劑、TruSeq鏈?zhǔn)絤RNA文庫制備試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)。Agilent2200生物分析儀(美國安捷倫公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 NIH/3T3細(xì)胞接種培養(yǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，以DMEM高糖培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。待細(xì)胞生長至80%～90%融合，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液在37 ℃培養(yǎng)箱中消化1 min，以1∶ 4比例傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。待細(xì)胞生長至70%～80%，更換培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為電磁輻射組和正常對照組，每組各3個生物學(xué)重復(fù)樣本。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果[7]設(shè)置輻射劑量和時間，電磁輻射組細(xì)胞置于0.2 mT、50 Hz的電磁輻射系統(tǒng)中，正常對照組置于同等條件未通電的相同線圈系統(tǒng)中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，提取RNA。

1.2.2ELF-EMFs輻射系統(tǒng)的建立 使用本課題組前期自制的磁場輻照系統(tǒng)[7]，由周長60 cm、高度8 cm、168匝的Helmholtz線圈和變壓器構(gòu)成，其中3個線圈相互串聯(lián)后疊放并與細(xì)胞培養(yǎng)箱外的變壓器相連。使線圈所在空間產(chǎn)生一個恒定、均勻的50 Hz正弦磁場輻照區(qū)，該輻射系統(tǒng)所產(chǎn)生的磁場用電磁輻射分析儀測定。在細(xì)胞受磁場輻照時，培養(yǎng)皿中心位于輻照系統(tǒng)的中心軸上。

1.2.3總RNA提取 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，電磁輻射組和正常對照組分別清除培養(yǎng)基，加入適量PBS快速沖洗細(xì)胞，用Trizol試劑抽提細(xì)胞中的總RNA，采用Agilent 2200檢測RNA質(zhì)量，質(zhì)檢合格的樣品用于進一步測序、生物學(xué)分析及實時熒光定量PCR檢測。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence引物名稱引物序列(5’-3’)片段長度(bp)MAPK12正向:CGCCGTGTACCAAGACCTG19反向:GAGGCGCAACTCTCTGTAGG20NTRK3正向:TCTTTGCCCAGCCAAGTGTAG21反向:TCCTTGAGATGTCCGTAATGTTG23AGTR2正向:CGCAACTGGCACCAATGAG19反向:AGGGAGGGTAGCCAAAAGGAG21VEGF正向:AGGAGTACCCCGACGAGATAGA22反向:CACATCTGCTGTGCTGTAGGAA22β-actin正向:CGTTGACATCCGTAAAGACC20反向:TCAGTAACAGTCCGCCTAGAAG22 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);MAPK:有絲分裂原激活的蛋白激酶;NTRK:神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體;AGTR:血管緊張素Ⅱ受體;VEGF:血管內(nèi)皮生長因子;β-actin:β-肌動蛋白 Note:PCR:polymerase chain reaction;MAPK:mitogen activated protein kinase;NTRK:neurotrophic receptor tyrosine kinase;AGTR:angiotensin Ⅱ receptor;VEGF:vascular endothelial growth factor

1.2.4文庫構(gòu)建質(zhì)檢和測序 采用TruSeq鏈?zhǔn)絤RNA文庫制備試劑盒為每個RNA樣品構(gòu)建cDNA文庫。將RNA溶于無酶水中，用Oligo dT磁珠、RNA結(jié)合緩沖液、洗滌液及Tris進行重懸和清洗，得到純化后的mRNA，并將其片段化為200～500 bp。以切割的RNA片段為模版，進行第1鏈和第2鏈cDNA合成。dUTP混合物用于第2鏈cDNA合成，可去除第2鏈。將該cDNA片段末端修復(fù)，并加上polyA尾。純化連接的cDNA產(chǎn)物，并用尿嘧啶DNA糖基化酶處理以除去第2鏈cDNA。通過PCR富集純化的第1鏈cDNA以創(chuàng)建cDNA文庫。選出合格的片段后，擴增15個循環(huán)，再次純化得到最終文庫。采用Agilent 2200對構(gòu)建的文庫進行質(zhì)檢。本文庫中，300 bp≤庫主峰長≤600 bp，質(zhì)量濃度≥2 ng/μl，峰型單一，沒有雜峰，符合后續(xù)上機要求。采用基于Illumina HiSeqXTen測序平臺的第2代高通量測序技術(shù)，對這些文庫進行150 bp的配對末端測序。

1.2.5培養(yǎng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組基因表達量測定 將高通量測序數(shù)據(jù)的基因組比對結(jié)果轉(zhuǎn)換為基因表達量，根據(jù)RNA Mapping結(jié)果和基因組注釋文件，將電磁輻射組和正常對照組的6個樣本采用HTSeq算法統(tǒng)計每個基因的表達情況。將測序序列(clean data)比對到測序物種(NCBI Taxonomy ID：10090)對應(yīng)的參考基因組(mm10)上，確定測序序列在基因組上的定位情況。采用RPKM(Reads Per Kilobase Million Reads)及FPKM(Fragments Per Kilobase Million Reads)對基因的表達值進行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.6差異基因分析及篩選 采用EdgeR算法過濾差異表達的基因，經(jīng)過顯著分析和錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)分析后，遵循以下標(biāo)準(zhǔn)對mRNA進行篩選：表達差異倍數(shù)log2Fold Change>0.585或<-0.585，F(xiàn)DR<0.05。通過差異基因篩選結(jié)果中的差異倍數(shù)以及差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性結(jié)果，在火山圖中對基因表達的差異分布情況進行展示，獲得顯著差異基因的數(shù)量、顯著上/下調(diào)基因的數(shù)量及差異程度信息。采用基因表達聚類圖直觀呈現(xiàn)多樣本多個基因的全局表達量變化，表達多樣本或多基因表達量的聚類關(guān)系。

1.2.7基因功能注釋和相關(guān)通路分析 基于數(shù)據(jù)庫，將分析得到的差異基因分別從生物學(xué)進程、分子功能和細(xì)胞組分3個層面進行基因本體論(Gene Ontology，GO)注釋，得到基因參與的所有GO，采用Fisher檢驗計算每個GO的顯著性水平(P值)，從而篩選出差異基因富集的顯著性GO。關(guān)注P值<0.05的相關(guān)基因。將篩選出的差異基因基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫進行通路注釋，得到差異基因參與的所有通路條目，采用Fisher檢驗計算Pathway的顯著性水平(P值)，從而篩選出差異基因富集的顯著性通路條目。

1.2.8實時熒光定量PCR法檢測差異基因的表達 按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將獲取的cDNA分別加入各引物的反應(yīng)體系中進行實時熒光定量PCR，有絲分裂原激活的蛋白激酶12(mitogen activated protein kinase 12，MAPK12)、神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體3型(neurotrophic tyrosine kinase receptor type 3，NTRK3)、2型血管緊張素Ⅱ受體(angiotensin Ⅱ receptor type 2，AGTR2)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、β-肌動蛋白(β-actin)PCR引物序列見表1，反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸34 s，循環(huán)40次。擴增后進行熔解曲線分析。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計算各目的基因mRNA相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)K-S檢驗證實呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。本次分析選用的差異篩選算法為EdgeR。EdgeR是基于負(fù)二項分布的統(tǒng)計方法，采用TMM算法進行標(biāo)準(zhǔn)化，采用多組實驗的精確統(tǒng)計模型進行基因差異表達鑒定的算法。以FDR<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗。2個組各個樣本基因表達水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA對比

比對到小鼠參考基因組的reads數(shù)占比(Mapped Rate)均高于90%，在本實驗結(jié)果中，未見存在顯著異常的染色體富集，未受到污染，結(jié)果可靠性良好。

2.2 轉(zhuǎn)錄組表達量的分析

根據(jù)基因在樣本中FPKM密度分布圖和FPKM分布箱線圖可見測序樣本中以中等表達的基因為主，低表達和高表達的基因占比很少，整體基因表達狀況良好。電磁輻射組和正常對照組各自3個樣本間的相關(guān)系數(shù)(r)在0.95～1.00(圖1)。

圖1 ELF-EMFs作用后2個組的轉(zhuǎn)錄組表達量 A：基因的FPKM密度分布圖 B：基因的FPKM分布箱線圖 C：樣本間基因表達水平相關(guān)性 顏色深淺代表Pearson相關(guān)性系數(shù)的高低，顏色越深，相關(guān)性越好Figure 1 Transcriptome expression levels of the two groups after exposure to ELF-EMFs A：FPKM density distribution map of genes B：Gene FPKM distribution boxplot C：Correlation matrix showing correlation coefficients between samples Deeper color represented higher correlation FPKM：Fragments Per Kilobase Million Reads

2.3 電磁輻射組與正常對照組中基因表達差異分析

在本次轉(zhuǎn)錄組測序中，共鑒定出17 980個基因，篩選出遵循表達差異倍數(shù)的共140個顯著差異基因，其中120個差異基因上調(diào)，差異較大的上調(diào)基因有Neat1、ND6、MAPK12、Tle2等，多與氨基酸轉(zhuǎn)運、NADH-泛醌氧化還原酶鏈、溶質(zhì)載體家族、細(xì)胞黏附分子等功能活動相關(guān)；20個下調(diào)的基因多與泛素蛋白連接酶、選擇素、真核翻譯延伸因子等功能活動相關(guān)(圖2)。樣本的雙向類聚分析結(jié)果可見電磁輻射組與正常對照組的相關(guān)性和均一性較好(圖3)。

圖2 ELF-EMFs作用后2個組差異基因火山圖 虛線是差異基因篩選采用的閾值，虛線之外為顯著差異基因；紅色代表顯著上調(diào)的差異基因，藍色代表顯著下調(diào)的差異基因，灰色代表非顯著差異的基因 FDR：錯誤發(fā)現(xiàn)率；FC：差異倍數(shù) 圖3 ELF-EMFs作用后2個組基因表達聚類圖 每個格子表示每個基因在不同樣本中的RPKM值。紅色代表該基因在中位數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化后，相對于中位數(shù)值的表達較高；綠色代表基因相對于中位數(shù)值的表達較低；顏色越深，越接近黑色代表越接近中位數(shù)值 圖4 ELF-EMFs作用后相關(guān)通路富集圖 VEGF：血管內(nèi)皮生長因子；NOD：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶Figure 2 Volcano plots displaying differentially expressed genes between the two groups after exposure to ELF-EMFs The dashed line was the threshold used for differentially expressed genes screening，and beyond the dashed line was the significantly differentially expressed genes;color red represented the significantly up-regulated genes，and color blue represented the significantly down-regulated genes，and color gray represented non-significantly differentially expressed genes FDR：false discovery rate;FC：fold change Figure 3 Gene expression cluster diagram of the two groups after exposure to ELF-EMFs Each grid represented the RPKM value of each gene in different samples.Color red meant that the gene expression was higher than that of median after median normalization，and color green meant that the expression of the gene was lower than that of median after median normalization.The darker the color，the closer it was to color black，and the closer it was to median Figure 4 Enrichment map of related pathways after exposure to ELF-EMFs VEGF：vascular endothelial growth factor;NOD：nucleotide-binding oligomerization domain;MAPK：mitogen-activated protein kinase

2.4 基因功能分析及與ELF-EMFs有關(guān)的通路篩選

通過GO分析，從生物學(xué)進程來看，差異基因富集在翻譯的延長、活性氧生物合成過程的調(diào)控、生長板軟骨細(xì)胞發(fā)育、黑色素生物合成過程的調(diào)節(jié)、醛固酮分泌等方面；從分子功能來看，差異基因富集在三重密碼子-氨基酸銜接子活性、1，2-二羥基萘雙加氧酶活性等方面；從細(xì)胞組分來看，差異基因富集在陽離子通道配合物、線粒體丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、血小板α顆粒膜、纖維狀膠原三聚體等方面。KEGG分析顯示差異基因主要涉及55條通路，其中富集顯著的10條通路集中于氨?；?tRNA的生物合成、血小板活化、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等，與細(xì)胞的生物合成密切相關(guān)(圖4)。在以上通路中，結(jié)合GO分析，Col27a1、MAPK12、NTRK3、B4galnt1、AGTR2等基因改變明顯，其中MAPK12和AGTR2在多條通路中均有涉及，這2個基因在ELF-EMFs作用后改變顯著。

2.5 2個組MAPK12、NTRK3、AGTR2和VEGF mRNA相對表達量比較

電磁輻射組MAPK12、NTRK3、AGTR2和VEGF mRNA的相對表達量均明顯高于正常對照組，2個組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.540、6.309、13.710、3.078，均P<0.05)(表2)。

表2 2個組MAPK12、NTRK3、AGTR2和VEGF mRNA相對表達量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of the relative expression levels of MAPK12,NTRK3,AGTR2 and VEGF mRNA between the two groups(mean±SD)組別樣本量不同基因mRNA相對表達量MAPK12NTRK3AGTR2VEGF正常對照組31.011±0.1901.011±0.1801.007±0.1501.008±0.153電磁輻射組32.389±0.0032.481±0.3502.354±0.0811.559±0.110t值12.5406.30913.7103.078P值<0.05<0.05<0.05<0.05 注:(獨立樣本t檢驗) MAPK:有絲分裂原激活的蛋白激酶;NTRK:神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體;AGTR:血管緊張素Ⅱ受體;VEGF:血管內(nèi)皮生長因子 Note:(Independent-samples t test) MAPK:mitogen activated protein kinase;NTRK:neurotrophic tyrosine kinase receptor;AGTR:angiotensin Ⅱ receptor;VEGF:vascular endothelial growth factor

3 討論

基因調(diào)控貫穿整個眼部的生長發(fā)育過程，能夠精確調(diào)控細(xì)胞功能的變化。日常生活中，我們接觸電磁輻射的頻率變高，累積劑量增大。電子產(chǎn)品使用時間變長，會使眼長期暴露在這些設(shè)備所發(fā)出的ELF-EMFs中[8]，關(guān)于ELF-EMFs的安全更加受到關(guān)注。近年來，國際上從多個角度進行了大量關(guān)于人體和動物的調(diào)查及試驗，研究ELF-EMFs對神經(jīng)、免疫、生殖等系統(tǒng)功能的影響[9-11]。也有多項研究發(fā)現(xiàn)ELF-EMFs對眼部健康有著不可忽略的影響[12-13]。

近年來，美國模式培養(yǎng)物集存庫對人胚胎眼鞏膜成纖維細(xì)胞存在部分爭議，而小鼠成纖維細(xì)胞與眼部多種成纖維細(xì)胞有著較類似的生物學(xué)功能，故在本研究中使用小鼠成纖維細(xì)胞作為替代。本研究共檢測到17 980個基因，140個有顯著差異的基因，其中上調(diào)表達基因120個，下調(diào)表達基因20個。從GO生物學(xué)進程中可發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要富集在細(xì)胞代謝過程和生物調(diào)控等方面；從GO細(xì)胞組分來看，大部分的差異表達基因富集在生物合成和分泌等方面；從GO的分子功能來看，差異表達基因主要富集在生物合成相關(guān)酶活性等方面。KEGG分析結(jié)果顯示，差異基因涉及的通路中，血小板活化、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)最為顯著，提示ELF-EMFs調(diào)控小鼠成纖維細(xì)胞可能涉及以上相關(guān)通路的變化，MAPK12、AGTR2、VEGF基因在以上通路中改變顯著?，F(xiàn)階段普遍認(rèn)為，AGTR2在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中起著非常重要的作用，該基因除了在高血壓和左心室肥厚重塑中作為重要的研究靶點之外[14-16]，以AGTR2為靶標(biāo)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)的拮抗劑在糖尿病視網(wǎng)膜病變中有助于漸進改變視網(wǎng)膜細(xì)胞的環(huán)境，從而保護視網(wǎng)膜[17]。在通過激光光凝視網(wǎng)膜血管疾病的治療中，AGTR2是抑制VEGF誘導(dǎo)血管生成的候選靶標(biāo)[18]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，選擇性激活A(yù)GTR2可以顯著阻斷血管緊張素Ⅱ、脂多糖和過氧化氫誘導(dǎo)的核因子-κB激活和炎性細(xì)胞因子的表達，所以選擇性激活A(yù)GTR2可能是視網(wǎng)膜疾病治療的新途徑[19]，為眼科疾病的治療提供了新的靶標(biāo)。

但在本研究中，經(jīng)過ELF-EMFs處理后，AGTR2和VEGF的表達均顯著上調(diào)。VEGF作為眼部疾病發(fā)生的重要基因，在年齡相關(guān)性黃斑變性、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變等眼部疾病的發(fā)生過程中有重要作用。VEGF表達水平升高提示ELF-EMFs對成纖維細(xì)胞的影響可能引發(fā)眼部各類疾病的發(fā)生。

MAPK家族控制大量的細(xì)胞過程，是真核生物對環(huán)境應(yīng)激和炎癥應(yīng)答的保守機制之一。MAPK12能夠通過生長因子、促細(xì)胞分裂劑、激素、細(xì)胞因子等外部刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生特定細(xì)胞應(yīng)激，從而應(yīng)對各種外部刺激，對于眼部外傷、年齡相關(guān)性黃斑變性、角膜內(nèi)皮細(xì)胞增生有著重要作用[20-22]。

成纖維細(xì)胞是機體完成生物學(xué)功能的重要組成細(xì)胞，是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，具有膠原形成、蛋白分泌、創(chuàng)傷修復(fù)等功能。在免疫耐受、組織修復(fù)等過程中有著重要作用[23-24]。在機體受到損傷時，傷口自然愈合是通過細(xì)胞外基質(zhì)沉積引起的組織纖維化進行的，但過度纖維化會引起一些不良反應(yīng)，甚至?xí)l(fā)一些新的疾病，如系統(tǒng)性硬化[25]。翼狀胬肉的形成也與過度纖維化有著密切關(guān)系[26]，通過藥物處理，可抑制成纖維細(xì)胞的增生并促進細(xì)胞凋亡，從而防治復(fù)發(fā)性翼狀胬肉[27]。成纖維細(xì)胞的多種功能在眼部疾病的發(fā)展過程中具有重要作用。雖然過度纖維化會影響角膜損傷后的修復(fù)[28]，并與角膜上皮基底膜有著密切的關(guān)系[29]；但是在最新的一項研究中發(fā)現(xiàn)，角膜上皮清創(chuàng)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使角膜基質(zhì)細(xì)胞衰老，表現(xiàn)出非纖維化的表型，可能參與角膜纖維化的自我限制[30]。

本研究通過對轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進行統(tǒng)計，全面分析了ELF-EMFs對小鼠成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，為進一步的機制研究提供了方向。但本次測序僅為轉(zhuǎn)錄組測序，無法對非編碼RNA的調(diào)控進行分析和預(yù)測，后續(xù)實驗可進一步對電磁輻射后細(xì)胞進行全轉(zhuǎn)錄組測序，得到更加全面的結(jié)果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MAPK12、AGTR2和VEGF基因?qū)τ贓LF-EMFs作用后成纖維細(xì)胞應(yīng)激有重要作用，這3個差異表達基因可能影響或參與了成纖維細(xì)胞損傷修復(fù)的過程，可作為探討ELF-EMFs對眼部病變影響的候選靶標(biāo)，其具體的作用機制仍需進一步實驗探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突