汪俊躍，戴建軍，張樹山，孫玲偉，吳彩鳳，張德福*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106；2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)試驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

豬精液冷凍技術(shù)的發(fā)展給養(yǎng)豬業(yè)提供了商業(yè)價(jià)值和運(yùn)輸保障。冷凍精液能克服時(shí)空限制，最大限度的提高養(yǎng)殖場(chǎng)精液利用率[1]。但豬精子富含多不飽和脂肪酸，在冷凍過(guò)程中易發(fā)生冷凍損傷，從而導(dǎo)致凍后質(zhì)量下降，這也是限制豬精液冷凍技術(shù)發(fā)展的主要因素之一[2]，因此，如何降低豬精子在冷凍中的損傷已成為目前研究的主要方向。卵黃作為一種常用的冷凍保護(hù)劑，已證實(shí)在動(dòng)物精液冷凍過(guò)程中，卵黃能附著在精子膜上增強(qiáng)精子抗冷休克能力，從而提高精子凍后質(zhì)量[3]。但卵黃中蛋白質(zhì)成分較為復(fù)雜，其所含的大量脂質(zhì)導(dǎo)致稀釋液粘度增加，未經(jīng)處理的卵黃中含有大顆粒物質(zhì)，可抑制精子呼吸并降低精子運(yùn)動(dòng)能力[4]。此外，卵黃作為動(dòng)物源成分，存在一定的生物安全性風(fēng)險(xiǎn)[5]，在卵黃保存精液過(guò)程中能對(duì)精子造成不可逆的損傷，因此，卵黃處理方式也在不斷更新。

高壓均質(zhì)技術(shù)是指在高強(qiáng)度的壓力和空氣剪切力作用下，使稀釋液在很短時(shí)間內(nèi)高速旋轉(zhuǎn)通過(guò)小孔，極大程度的降低稀釋液中大顆粒粒徑，并破壞溶液中微生物細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)和功能，使其失去或鈍化生物活性，以減少冷凍過(guò)程中對(duì)物質(zhì)的物理?yè)p傷[6-7]。利用高壓均質(zhì)處理的雞蛋卵黃溶液與普通雞蛋卵黃溶液不同，高壓均質(zhì)后雞蛋卵黃溶液粒徑減小，溶液穩(wěn)定性提高。作為一種動(dòng)態(tài)高壓的非熱加工技術(shù)，高壓均質(zhì)能短時(shí)間產(chǎn)生高壓并不改變?nèi)芤罕旧硇再|(zhì)[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高壓均質(zhì)處理后能提高雞蛋卵黃溶液的溶解性和穩(wěn)定性，減少其中的微生物含量[10-11]。但目前為止，仍缺乏高壓均質(zhì)處理后的雞蛋卵黃對(duì)豬冷凍精子凋亡水平影響的研究。

本試驗(yàn)通過(guò)高壓均質(zhì)雞蛋卵黃對(duì)豬精液冷凍保存效果的研究，比較冷凍后精子質(zhì)量、DNA完整性、線粒體膜電位變化(△Ψm)、細(xì)胞凋亡率水平、多種Caspase活性以及凋亡功能基因的表達(dá)水平，為進(jìn)一步提高豬精液冷凍效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與樣品

1.1.1 試驗(yàn)試劑 高壓均質(zhì)處理的卵黃加工于蘇州納米生物園；注射用青霉素鈉和硫酸鏈霉素購(gòu)于河北石家莊遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(綠色熒光)和JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；吖啶橙(AO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9原位熒光染色試劑購(gòu)于Bio Vision公司；RNA prep Pure Micro Kit和Fast Quant RT Kit 試劑盒購(gòu)于中國(guó)Tiangen公司。

1.1.2 精液采集 精液采自上海祥欣種公豬站，2歲杜洛克種公豬(n=5)，利用手握法收集中段濃縮部分的精液，15 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。選擇色澤正常、活力大于0.8的精液用于冷凍保存。試驗(yàn)前經(jīng)過(guò)多次預(yù)試驗(yàn)，利用5頭杜洛克公豬的混精，以排除個(gè)體差異。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基礎(chǔ)稀釋液(TCG)[12]的配制：稱取檸檬酸1.48 g、葡萄糖1.1 g和 TRIS 2.42 g，溶解后加入200 IU·mL-1雙抗、6 mL甘油，調(diào)節(jié)溶液pH為7.1，定容至100 mL。

試驗(yàn)組為基礎(chǔ)稀釋液中添加20%經(jīng)高壓均質(zhì)處理的雞蛋卵黃，以普通雞蛋卵黃為對(duì)照組，分別配制成冷凍Ⅰ液和冷凍Ⅱ液。冷凍-解凍后檢測(cè)豬精子各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 精液的冷凍解凍

1.3.1 預(yù)處理 采用兩步稀釋法。將采集的合格精液用等溫等量的預(yù)稀釋液進(jìn)行稀釋，經(jīng)1 h室溫平衡后17 ℃離心(800 g，10 min)，棄上清液；將配制好的冷凍Ⅰ液預(yù)冷后緩慢加入到離心后的沉積中，輕輕吹打搖勻后紗布包裹放入4 ℃冰箱平衡1.5～2 h。再等體積緩慢加入同步預(yù)冷過(guò)的Ⅱ液。選擇精子活率高于0.75，密度大于1.0×109個(gè)·mL-1的精液進(jìn)行冷凍。

1.3.2 精液冷凍 將灌裝封口的0.5 mL細(xì)管放入程序冷凍儀(Planer公司，型號(hào)：Kryo 560-16)中并設(shè)置冷凍程序進(jìn)行冷凍，待冷凍結(jié)束后迅速投入到液氮中保存。冷凍程序?yàn)椋赫{(diào)整恒溫箱溫度為6 ℃，以保證冷凍程序進(jìn)行的更快捷；設(shè)定從6 ℃降到4 ℃，以1 ℃/2 min進(jìn)行降溫；設(shè)定從4 ℃降到1 ℃， 以1.5 ℃/2 min進(jìn)行降溫；設(shè)定從1 ℃降到-140 ℃， 以30 ℃/4.8 min進(jìn)行降溫；設(shè)定-140 ℃保持1 0 min。

1.3.3 精液解凍 將冷凍保存的精液細(xì)管從液氮中迅速取出，放入60 ℃水浴鍋中解凍12 s，用稀釋液1∶10稀釋，37 ℃孵育10 min后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 精子質(zhì)量檢測(cè)

1.4.1 精子活力 取10 μL解凍后精液滴在預(yù)熱的精子計(jì)數(shù)板中，置于37 ℃恒溫載物臺(tái)上，使用精液自動(dòng)分析儀在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，記錄精子活力和活率。

1.4.2 DNA完整性 利用吖啶橙染色法檢測(cè)精子DNA完整性[13]。取解凍后0.1 mL樣品，加入0.9 mL PBS清洗3次后再用0.9 mL PBS重懸，取30 μL涂片并干燥，經(jīng)甲醛固定10 min后，均勻滴上30 μL AO染液，黑暗條件下37 ℃孵育30 min后在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)頭部發(fā)熒光精子百分率，每次計(jì)數(shù)精子不少于200個(gè)。

1.4.3 線粒體膜電位檢測(cè) 利用JC-1線粒體膜電位試劑盒對(duì)解凍后精子進(jìn)行線粒體膜電位檢測(cè)。37%條件下孵育20 min后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)算紅色(RITC)和綠色(FITC)精子比值(△Ψm)。每次計(jì)數(shù)精子不少于200個(gè)。

1.4.4 精子凋亡檢測(cè) 利用一步法TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)精子進(jìn)行凋亡檢測(cè)。樣品經(jīng)多聚甲醛(4%)固定30 min后，利用PBS清洗3次，并加入含有Triton X-100(0.1%)的PBS重懸。室溫孵育5 min后，用PBS清洗2次。加入50 μL TUNEL檢測(cè)液并37 ℃避光孵育60 min。然后利用PBS洗滌2次 并用250 μL PBS重懸。利用熒光顯微鏡觀察，計(jì)算綠色熒光精子數(shù)，每次計(jì)數(shù)精子不少于200個(gè)。

1.4.5 精子Caspase原位熒光染色 取解凍后精子樣品分別進(jìn)行Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9原位熒光染色。37 ℃孵育20 min，利用PBS清洗3次并在熒光顯微鏡下觀察。每次計(jì)數(shù)精子不少于200個(gè)。

1.4.6 精子總RNA提取 取解凍后精子樣品，加等量Trizol裂解，利用RNA prep Pure Micro Kit試劑盒進(jìn)行總RNA提取，檢測(cè)OD值(OD260 nm/OD280 nm)為1.8～2.0之間，樣品存放于-80 ℃低溫柜。所有操作均需在低溫柜或冰上進(jìn)行。

1.4.7 逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR 精子總RNA樣品經(jīng)Fast Quant RT Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，從NCBI獲取豬精子有關(guān)基因的cDNA序列(Bcl-2-F、Bax、TNF-α、Caspase-8、Caspase-9、P53)并設(shè)計(jì)引物。利用所獲得的豬相關(guān)基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建20 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 變性5 s，退火34 s， 72 ℃延伸 30 s，40個(gè)循環(huán)，完成反應(yīng)。相對(duì)基因表達(dá)量利用2-△△CT算法(△△CT=[(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)處理組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對(duì)照組])，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。cDNA序列引物見表1。所有操作均需在低溫柜或冰上進(jìn)行。

表1 qRT-PCR所需引物信息

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次，每次每組至少解凍2支 細(xì)管。本試驗(yàn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 高壓均質(zhì)雞蛋卵黃對(duì)豬精子凍后質(zhì)量的影響

如圖1和表2所示，經(jīng)高壓均質(zhì)處理后，豬精子凍后活力、活率和頂體完整率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，為87.64%、87.14%和66.61%，較對(duì)照組分別提高了12.58%、5.82%和12.48%。

2.2 高壓均質(zhì)雞蛋卵黃對(duì)豬精子凍后凋亡水平的影響

由表3和圖2、圖3可見，經(jīng)高壓均質(zhì)雞蛋卵黃處理后線粒體膜電位和DNA完整率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，分別為0.74和61.76%。冷凍后精子經(jīng)JC-1染色后均呈紅綠色熒光，圖2中經(jīng)高壓均質(zhì)雞蛋卵黃處理后精子綠色熒光(高亮部分)較對(duì)照組減少。經(jīng)高壓均質(zhì)雞蛋卵黃處理后精子凋亡水平顯著降低(P<0.05)，為37.74%，較對(duì)照組下降4.33%。

表2 凍后豬精子質(zhì)量

2.3 高壓均質(zhì)雞蛋卵黃對(duì)豬精子凍后Caspase水平的影響

由表4和圖4可知，對(duì)照組熒光強(qiáng)度均高于試驗(yàn)組，解凍后豬精子Caspase水平對(duì)照組明顯高于試驗(yàn)組(P<0.05)。試驗(yàn)組的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性為17.15、11.19和15.18，較對(duì)照組分別減少6.17、2.18和3.51(P<0.05)。

2.4 高壓均質(zhì)雞蛋卵黃對(duì)豬精子凍后凋亡功能基因表達(dá)的影響

通過(guò)qRT-PCR得到相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平如圖5。以GAPDH為內(nèi)參基因，不同基因表達(dá)量不同，對(duì)照組的Bax、TNF-α、Caspase-8、Caspase-9和P53基因表達(dá)量均高于試驗(yàn)組，其中Bax、TNF-α和Caspase-9基因表達(dá)均顯著高于試驗(yàn)組(P<0.05)；Caspase-8、P53基因表達(dá)水平較高于試驗(yàn)組(P>0.05)。相較于對(duì)照組，試驗(yàn)組的Bcl-2基因表達(dá)量升高(P>0.05)。

圖1 冷凍后豬精子頂體完整性(400×)Fig.1 The sperm acrosome integrity after cryopreservation(400×)

表3 凍后豬精子凋亡水平

A.對(duì)照組JC-1染色；B.高壓均質(zhì)組的JC-1染色A. The JC-1 staining of frozen sperms in control group; B. The JC-1 staining of frozen sperms in the high pressure homogeneous group圖2 冷凍后豬精子的JC-1染色(400×)Fig.2 The JC-1 staining of frozen porcine sperms(400×)

3 討 論

本研究從冷凍后精子活力、DNA完整性、線粒體膜電位和凋亡情況著手，同時(shí)檢測(cè)Caspase活性和相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，表明高壓均質(zhì)雞蛋卵黃能降低豬精子冷凍細(xì)胞凋亡水平。

A.對(duì)照組TUNEL染色；B.高壓均質(zhì)組的TUNEL染色A. The TUNEL staining of frozen sperms in control group; B. The TUNEL staining of frozen sperms in the high pressure homogeneous group圖3 冷凍后豬精子TUNEL染色(400×)Fig.3 The TUNEL staining of frozen porcine sperms(400×)

表4 凍后豬精子Caspase水平

本試驗(yàn)中，高壓均質(zhì)處理雞蛋卵黃能有效提高豬精子凍后的活力和DNA完整性(P<0.05)。豬精子凍后活力是精子質(zhì)量最直觀的表現(xiàn)，DNA完整性是精卵是否能正常結(jié)合的保證。精子保存時(shí)間長(zhǎng)短和冷凍過(guò)程中是否遭受物理?yè)p傷都會(huì)造成精子DNA完整性被破壞，導(dǎo)致精子質(zhì)量下降[14-15]。這與本試驗(yàn)相似，未經(jīng)處理的雞蛋卵黃會(huì)殘存不溶性大顆粒，精子在冷凍過(guò)程中對(duì)物理沖擊、冷沖擊和滲透應(yīng)力等幾個(gè)因素造成的損傷沒有過(guò)強(qiáng)的抵抗力，而經(jīng)過(guò)高壓均質(zhì)處理的雞蛋卵黃溶液粒徑減小且精子質(zhì)量提高，推測(cè)可更好地促進(jìn)卵黃中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的融合，降低卵黃自身存在的微生物對(duì)精液冷凍后影響，從而有效提高豬凍精質(zhì)量。

精子獲能是指精子經(jīng)過(guò)一系列生理活動(dòng)最終達(dá)到具有受精能力的狀態(tài)，線粒體是維持精子生命活動(dòng)的直接能量來(lái)源[16-19]。線粒體膜電位下降是精子細(xì)胞狀態(tài)改變的主要標(biāo)志之一。呂松潔等[20]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍后山羊精子內(nèi)線粒體膜電位降低會(huì)導(dǎo)致精子解凍后活力下降。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高壓均質(zhì)后雞蛋卵黃能更好保護(hù)豬精子，降低凍后線粒體膜電位的改變程度，保護(hù)線粒體功能完整性。

對(duì)很多哺乳動(dòng)物精子冷凍研究發(fā)現(xiàn)，凋亡精子的比例升高會(huì)導(dǎo)致精子受精能力的降低。凋亡現(xiàn)象主要表現(xiàn)為精子運(yùn)動(dòng)能力喪失、線粒體膜電位降低、Caspase活化水平提高和DNA氧化損傷等[21-24]。本試驗(yàn)對(duì)豬精子冷凍后進(jìn)行TUNEL檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)處理的雞蛋卵黃試驗(yàn)組豬精液熒光比例顯著低于對(duì)照組，表明精子凋亡率下降，DNA完整率增高。雖然冷凍后精子凋亡的具體機(jī)制還尚無(wú)定論，但有試驗(yàn)表明，線粒體功能受損是精子細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的重要因素之一[25-27]，線粒體功能受損導(dǎo)致無(wú)法有效清除精子細(xì)胞內(nèi)多余的自由基;同時(shí)線粒體膜電位下降，Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)展開，從而致使精子凋亡。

精子細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)將原本無(wú)活性的Caspase被激活。Caspase原位熒光染色被用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。Brugnon等[28]認(rèn)為，凋亡精子內(nèi)Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性顯著升高,與本研究結(jié)果類似。本試驗(yàn)中，高壓均質(zhì)的雞蛋卵黃試驗(yàn)組冷凍后精子內(nèi)Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性明顯降低，抑制了精子凋亡的發(fā)生。

熒光表示具有Caspase活性，活性高的熒光強(qiáng)The fluorescence indicates Caspase activity, high activity show strong fluorescence圖4 冷凍后豬精子Caspase 活性(400×)Fig.4 Caspase activity of frozen porcine sperms(400×)

*. P<0.05圖5 凋亡相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果Fig.5 Apoptosis related gene expression results

本試驗(yàn)中，高壓均質(zhì)的雞蛋卵黃組相較于對(duì)照組，Bax、P53、TNF-α、Caspase-8和Caspase-9水平降低，Bcl-2水平升高。試驗(yàn)結(jié)果與Jeremy等[29]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明凋亡細(xì)胞中凋亡促進(jìn)基因的增多和凋亡抑制基因的減少，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自身維持穩(wěn)定性，由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)性死亡的過(guò)程[30]，Bax、P53、TNF-α、Caspase-8和Caspase-9等為細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因，Bcl-2為細(xì)胞凋亡抑制基因。都在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[31-33]。P53作為細(xì)胞中重要調(diào)控因子，具有控制細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和DNA修復(fù)的作用[34]。TNF-α能促進(jìn)壞死細(xì)胞發(fā)生凋亡，是死亡受體重要因子[35]。Bax能拮抗Bcl-2的細(xì)胞凋亡抑制作用，寡聚體的Bax還能刺激細(xì)胞色素C釋放和Caspase蛋白酶家族的級(jí)聯(lián)激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[36-37]。Caspase級(jí)聯(lián)激活作為細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，上游Caspase-9經(jīng)細(xì)胞色素C激活并放大下游Caspase-3和Caspase-8表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[33, 38-39]。本研究中，試驗(yàn)組線粒體膜電位降低，且細(xì)胞Caspase水平下降，細(xì)胞凋亡水平較對(duì)照組有所降低，預(yù)示了精子線粒體凋亡的發(fā)生同時(shí)也促進(jìn)了精子細(xì)胞的凋亡過(guò)程。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組精子細(xì)胞內(nèi)Bax、P53、TNF-α、Caspase-8和Caspase-9基因表達(dá)量明顯降低，Bcl-2基因表達(dá)量上升，這可能是精子細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，多種凋亡途徑均參與介導(dǎo)，多條通路聯(lián)合擴(kuò)大了精子細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳遞。證明經(jīng)高壓均質(zhì)后雞蛋卵黃能有效保護(hù)精子細(xì)胞，減少冷凍后精子細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)率，提高凍后精子質(zhì)量。至于能否通過(guò)添加凋亡通路抑制劑來(lái)減少凍后精子發(fā)生凋亡的水平仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，經(jīng)高壓均質(zhì)后的雞蛋卵黃能提高冷凍后精子活力、DNA完整性；降低線粒體膜電位和凋亡水平，同時(shí)降低精子細(xì)胞內(nèi)Caspase活性和促凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。