楚金雨，李紹梅，楊 戈，牟春燕

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070)

皮膚是人體最大的器官，由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成，并含有毛囊、汗腺、皮脂腺、指甲等附屬物，具有保護(hù)身體、維持水分、感覺冷暖等功能[1]。由于羊毛囊的形態(tài)發(fā)生類似于人的頭部毛囊，而綿羊的軀干皮膚所含有的毛囊和汗腺與人類腋窩皮膚的解剖結(jié)構(gòu)相似[2]，所以，綿羊可成為研究人類毛發(fā)生長的優(yōu)良動物模型。

毛囊是由上皮細(xì)胞和間充質(zhì)之間通過信號分子介導(dǎo)的一系列相互作用形成的[3]。成熟的毛囊包括真皮乳頭、外根鞘、內(nèi)根鞘、毛球、毛干等結(jié)構(gòu)[4]，且在發(fā)育形成的過程中通常伴隨著汗腺、皮脂腺和立毛肌的出現(xiàn)。立毛肌是一類平滑肌，由皮膚結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞分化形成[5]，位于表皮下方，始于毛囊底部隆起處，終止于真皮細(xì)胞外基質(zhì)[6]。在發(fā)育過程中，立毛肌與毛囊和交感神經(jīng)的關(guān)系十分密切。立毛肌附著于毛囊干細(xì)胞所在的毛囊隆起區(qū)域，交感神經(jīng)使立毛肌平滑肌細(xì)胞束化，交感神經(jīng)與立毛肌和毛囊一起形成三系單元(tri-lineage unit)[7-8]。Shwartz等[9]對小鼠皮膚的研究進(jìn)一步闡述了三系單元的作用機(jī)制：在發(fā)育過程中，毛囊干細(xì)胞會分泌音猬因子(Sonic hedgehog)指導(dǎo)立毛肌交感神經(jīng)小生境的形成，進(jìn)而控制成體毛囊再生。Torkamani等[10]研究發(fā)現(xiàn)，脫發(fā)患者的毛囊附著的立毛肌結(jié)構(gòu)殘缺，表明立毛肌可以影響成熟毛囊的完整性。也有研究表明，皮膚組織中立毛肌肌動蛋白的存在有利于毛囊調(diào)控毛干的運動[11]。除此之外，Sato等[12]研究表明，立毛肌在毛發(fā)移植中與毛囊的再生有關(guān)。可見立毛肌對皮膚其他附屬器官的發(fā)育過程起重要作用。

藏羊是我國特有的地方綿羊品種，近些年來，已經(jīng)有研究人員報道了關(guān)于胚胎期藏羊皮膚中毛囊、汗腺等皮膚附屬物發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制[13-15]，但目前還沒有關(guān)于調(diào)控藏羊胚胎期立毛肌發(fā)育分子機(jī)制的報道。本研究初步探索藏羊立毛肌發(fā)生及發(fā)育的過程，通過形態(tài)學(xué)變化明確立毛肌發(fā)生的關(guān)鍵時期，并通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析該時期的整體基因表達(dá)變化，探索影響立毛肌發(fā)生過程的動態(tài)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和潛在的候選基因。該結(jié)果將豐富有關(guān)立毛肌形態(tài)發(fā)生過程中組織學(xué)和分子變化的研究，為了解人類毛發(fā)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供參考，對了解皮膚生物學(xué)復(fù)雜性具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藏羊(西藏羊)取自青海當(dāng)?shù)赝涝讏觯杉?0只75～110日齡健康情況良好的藏羊胚胎并解剖背部皮膚，將樣品平均分為兩部分，一部分立即放在4 ℃用4%的多聚甲醛固定，另一部分凍存在液氮中[13-14]。

1.2 綿羊背部皮膚石蠟組織切片及HE染色

為了確定藏羊皮膚中立毛肌的發(fā)生階段，將藏羊不同胚齡背部皮膚樣品用梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并切成5 μm組織切片。然后將背部皮膚切片進(jìn)行脫蠟和HE(蘇木精和伊紅)染色，并用中性樹脂固定。對染色的皮膚切片進(jìn)行顯微鏡拍照記錄，根據(jù)形態(tài)學(xué)初步推斷樣品胚胎日齡。

1.3 綿羊背部皮膚組織轉(zhuǎn)錄組測序

挑選藏羊胚齡大約在75和85 d(E75和E85)各3個背部皮膚組織樣品，使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)分別從6個樣品中提取總RNA，并使用帶有Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(美國加利福尼亞州安捷倫科技公司)的RNA Nano 6000分析試劑盒評估RNA完整性。按照制造商的程序，使用用于Illumina的NEBNext9 UltraTM RNA文庫制備試劑盒(美國NEB)，在Novogene(中國北京)構(gòu)建測序文庫，利用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)評估文庫質(zhì)量，在Illumina Hiseq平臺(Hiseq X ten)上進(jìn)行150個堿基對配對末端序列的測序。

1.4 綿羊背部皮膚組織轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)的上游處理均在服務(wù)器中進(jìn)行，利用fastqc和trimglore軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的質(zhì)控和過濾；通過Hisat2[16](版本:2.1.0)軟件將clean reads映射到藏羊參考基因組(版本：Oarv3.1)；用Samtools軟件對比對結(jié)果進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換、排序；使用Htseq[17]軟件對clean reads 進(jìn)行計數(shù)；用Stringtie[18](版本：1.3.5)軟件計算每個基因的FPKM值。使用R語言(版本：3.6.3)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組下游數(shù)據(jù)分析；用DESeq2軟件包進(jìn)行基因表達(dá)量差異分析[19]。對于生物學(xué)重復(fù)，將P<0.05和|log2(fold change)|≥1設(shè)置為差異表達(dá)基因的閾值，獲得差異表達(dá)的基因。使用bioDBnet網(wǎng)站進(jìn)行基因ID的轉(zhuǎn)換。因為藏羊是非模式生物，先用AnnotationHub R包獲取綿羊注釋文件，再使用 clusterProfiler[20]R包對DEGs進(jìn)行GO富集分析，差異表達(dá)基因顯著富集于校正后P<0.05的GO條目，使用KOBAS[21]網(wǎng)站進(jìn)行KEGG通路中差異表達(dá)基因的富集分析。使用Cytoscape StringApp軟件[22]實現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的可視化。

1.5 差異表達(dá)基因?qū)崟r熒光定量PCR驗證

1.5.1 引物的設(shè)計與合成 隨機(jī)選出6個差異表達(dá)基因，以羊的GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)驗證。利用NCBI網(wǎng)站中的primer-BLAST在線工具設(shè)計引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 RT-qPCR引物序列信息

1.5.2 熒光定量PCR 每個時期的樣本設(shè)置3個技術(shù)性重復(fù)(n=3)。按照Vazyme公司的產(chǎn)品ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix說明書對目的基因進(jìn)行RT-qPCR檢測。反應(yīng)體系為：cDNA 6.6 μL，酶Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.45 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延申30 s，40個循環(huán)；65～95 ℃，每5 s增加0.5 ℃，5 min制作熔解曲線。用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件收集處理數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCT方法對mRNA進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析，并用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 藏羊背部皮膚中立毛肌的形態(tài)發(fā)生及發(fā)育

本試驗選擇西藏地毯羊(一種典型的粗羊毛綿羊)為研究對象，詳細(xì)研究皮膚中立毛肌的發(fā)生過程。通過組織學(xué)HE染色觀察到立毛肌從無到有直至結(jié)構(gòu)完整的3個時期(圖1A～C)。根據(jù)Rogers[2]的描述確定TF2a(約E75，圖1A，T代表藏羊)和TF3a(約E85，圖1B)為立毛肌開始形成的關(guān)鍵時期。

A.TF2a(E75)皮膚組織切片圖：沒有觀察到明顯的立毛??；B.TF3a(E85)皮膚組織切片圖：顯示形成早期立毛??；C.TF4(E100)皮膚組織切片圖：顯示立毛肌的延伸。B、C圖紅色虛線內(nèi)標(biāo)識部位為立毛肌A. TF2a (E75) skin tissue section image: no obvious arrector pili muscle; B. TF3a (E85) skin tissue section image: the early formation of arrector pili muscle; C. TF4 (E100) skin tissue section image： the down-growth of arrector pili muscle. In B, C figures,the parts in the red dashed line are the arrector pili muscle圖1 藏羊胚胎期皮膚組織切片顯示立毛肌的早期形態(tài)發(fā)生過程圖Fig.1 The histological identification of arrector pili muscle development in Tibetan sheep skin during embryo period

2.2 藏羊背部皮膚組織轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量分析

取兩個時期(TF2a、TF3a)，每個時期3個樣品，共6個藏羊背部皮膚組織樣品進(jìn)行RNA測序。將數(shù)據(jù)上傳于服務(wù)器中進(jìn)行質(zhì)控、比對、計數(shù)。每個樣品產(chǎn)生超過12G的原始數(shù)據(jù)，測序結(jié)果如表2所示，其中Q30數(shù)據(jù)基本都在90%以上，表明測序數(shù)據(jù)滿足后續(xù)分析的條件。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測分析

2.3 藏羊背部皮膚組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異基因表達(dá)分析

利用R軟件包DESeq2進(jìn)行差異分析得到初步差異分析的結(jié)果。設(shè)置篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)為|log2(fold change)|≥1 和P<0.05，得到的差異基因結(jié)果如圖2所示，共獲得1 159個差異表達(dá)基因，其中900個基因上調(diào)表達(dá)，259個基因下調(diào)表達(dá)。

虛線左上側(cè)代表顯著下調(diào)基因，虛線右上側(cè)代表顯著上調(diào)基因。TF2a代表E75；TF3a代表E85The upper left side of the dotted line represents significantly down-regulated genes, and the upper right side of the dotted line represents significantly up-regulated genes. TF2a stands for E75； TF3a stands for E85圖2 立毛肌早期形態(tài)發(fā)生期藏羊皮膚中差異表達(dá)基因火山圖(立毛肌雛形 vs. 無立毛肌)Fig.2 Volcano map of differentially expressed genes in Tibetan sheep skin during early morphogenesis of arrector pili muscle (the germ of arrector pili muscle vs. no arrector pili muscle)

2.4 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

對1 159個差異基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，一共顯著富集到71個GO條目，包括29個生物學(xué)過程(BP)，27個細(xì)胞組分(CC)，15個生物學(xué)功能(MF)。前30條顯著富集到的GO條目如圖3A所示，在生物學(xué)過程中，差異基因顯著富集到肽生物合成過程(peptide biosynthetic process，35個基因)、酰胺生物合成過程(amide biosynthetic process，38個基因)、翻譯(translation，34個基因)。在生物學(xué)功能歸類中，差異基因顯著富集到結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity，40個基因)。所有富集條目大部分都與轉(zhuǎn)錄和翻譯過程緊密相關(guān)，表明細(xì)胞在此時期的活動，如細(xì)胞增殖和分化等非?；钴S，此時期可能為器官發(fā)育形成的重要時期。

在KEGG富集分析中，共顯著富集到28條信號通路，其中圖3B列出了前20個顯著富集到的通路，顯著富集到的通路為代謝途徑(metabolic pathways，77個基因)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路(neurotrophin signaling pathway，11個基因)、ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction，9個基因)等。

2.5 RT-qPCR驗證

對隨機(jī)選取的6個差異基因進(jìn)行RT-qPCR驗證，結(jié)果如圖4所示，2個基因(MATN4、LAMB3)上調(diào)表達(dá)，4個基因(JUN、CNTFR、NOTCH3、COL4A2)下調(diào)表達(dá)，6個基因在立毛肌發(fā)育的2個時期(TF3avs. TF2a)的藏羊皮膚組織中表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。進(jìn)一步表明測序結(jié)果具有可靠性。

2.6 調(diào)控立毛肌發(fā)生的候選基因篩選

立毛肌發(fā)生的初期伴隨著毛囊的成熟和汗腺的出現(xiàn)，這些器官的協(xié)同變化表明，一些參與調(diào)控毛囊或腺體發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子也可能會對立毛肌的發(fā)育有影響。本研究富集到了與管發(fā)育、腺體發(fā)育、肌肉發(fā)育、干細(xì)胞發(fā)育以及皮膚發(fā)育相關(guān)的GO條目中共23個非冗余差異基因，見表3。這些條目均屬于生物學(xué)過程類別。

KEGG富集分析得到了可能與立毛肌發(fā)育有關(guān)的通路基因(表4)。這些通路包括粘著斑(focal adhesion)信號通路、Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、Notch信號通路(Notch signaling pathway)、TGF-β信號通路(TGF-beta signaling pathway)和鈣離子信號通路(calcium signaling pathway)。

通過篩選GO和KGEE富集到的條目以及信號通路，共得到47個非冗余的差異基因(圖5A)，并對其進(jìn)行了蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析。共有29個基因之間有互作關(guān)系，其中有16個上調(diào)基因，13個下調(diào)基因。這些基因構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，例如，Wnt信號通路中的LEF1基因參與到肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育和腺體發(fā)育等生物學(xué)過程；粘著斑信號通路中的JUN基因參與到腺體發(fā)育以及管發(fā)育等生物學(xué)過程(圖5B)。

3 討 論

組織切片結(jié)果展示出立毛肌發(fā)育過程中3個比較重要的發(fā)育時期的動態(tài)變化。根據(jù)已有文獻(xiàn)的描述[2]以及試驗觀察[13-14]，推測藏羊TF2a和TF3a兩個時期分別對應(yīng)E75和E85左右，TF4則對應(yīng)E100左右的胚齡。其中，E75和E85左右時期立毛肌分別處于未發(fā)育和發(fā)育初期階段，在E100左右時立毛肌已經(jīng)發(fā)育較為成熟。因此，E75和E85藏羊立毛肌組織形態(tài)學(xué)的明顯差異為后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析提供了基礎(chǔ)。

KEGG富集分析得到了候選信號通路。粘著斑通路(focal adhesion)可以與肌動蛋白細(xì)胞骨架途徑協(xié)同調(diào)節(jié)平滑肌的遷移[23]，粘著斑是連接細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)的一種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是信號傳導(dǎo)過程中許多信號分子組裝的平臺[24]，差異基因在該信號通路富集表明，在立毛肌細(xì)胞形成后向真皮外基質(zhì)方向擴(kuò)展的過程中，該信號通路中某些基因的表達(dá)可能促進(jìn)了立毛肌細(xì)胞的分化與形態(tài)的變化。Wnt分泌型糖脂蛋白家族介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路在胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)過程中起著調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移和極性等重要作用[25]，它被證明是調(diào)節(jié)癌癥的重要信號通路之一[26-27]，Wnt信號通路還廣泛參與到皮膚組織與毛囊等器官的發(fā)育過程并調(diào)節(jié)該程中的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[28-29]。Notch信號通路是一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)途徑，參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和細(xì)胞命運等過程，該途徑不僅參與皮膚組織器官的發(fā)育，而且與人類皮膚疾病的發(fā)生密切相關(guān)[30]，另外它也參與了腸道平滑肌的發(fā)育[31]。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β) 信號通路在動物中高度保守，被認(rèn)為是多細(xì)胞動物進(jìn)化初期最早出現(xiàn)的信號通路之一，其在胚胎期可以介導(dǎo)組織特異性的分化和增殖等活動[32]，TGF-β 信號通路在調(diào)節(jié)肌肉的生長和重塑方面也起著重要作用[33]。Ca2+信號通路則是促進(jìn)肌肉形成、肌肉動態(tài)平衡和再生的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分[34]。上述信號通路被富集表明，TF2a到TF3a時期這一發(fā)育過程中與肌肉發(fā)育相關(guān)的基因活躍表達(dá)，各種信號通路之間的相互通訊參與了肌肉細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)，立毛肌展現(xiàn)出的顯著形態(tài)變化也證實了這一點。

BP、MF、CC分別代表生物學(xué)過程、生物學(xué)功能、細(xì)胞組分BP, MF, and CC represent biological process, molecular function, and cellular component, respectively圖3 立毛肌早期形態(tài)發(fā)生期差異表達(dá)基因富集分析中前30個GO條目(A)與前20條KEGG通路圖(B)(TF3a vs. TF2a)Fig.3 Representation of top 30 GO terms(A) and top 20 KEGG pathways(B) in the enrichment analysis of differentially expressed genes in early morphogenesis of arrector pili muscle(TF3a vs. TF2a)

*. P<0.05圖4 RT-qPCR檢測6個差異表達(dá)基因在藏羊皮膚組織中的表達(dá)模式(TF3a vs. TF2a)Fig.4 RT-qPCR verification of expression tendency of 6 differentially expressed genes in Tibetan sheep skin(TF3a vs. TF2a)

表3 參與立毛肌發(fā)育的候選GO條目及基因

表4 參與立毛肌發(fā)育的候選信號通路及基因

在47個候選差異表達(dá)基因中，有研究表明一些基因與肌肉發(fā)育相關(guān)。其中，SPP1在立毛肌發(fā)生期間高表達(dá)，有文獻(xiàn)報道SPP1與人類肌肉炎癥以及肌肉再生有關(guān)[35]，它也可能參與調(diào)控雞成肌細(xì)胞的增殖發(fā)育過程[36]，表明SPP1可能會在立毛肌發(fā)生早期誘導(dǎo)肌肉發(fā)育。BAMBI基因在立毛肌發(fā)生期間表達(dá)量顯著上調(diào)，Yao等[37]的研究也證明，BAMBI蛋白在肌肉生長和再生期間富集在細(xì)胞膜上，這表明BAMBI介導(dǎo)的重要信號通路可能是肌肉生長和再生的重要組成部分。同樣，作為表達(dá)量顯著上調(diào)的TNNI3基因，在動物心肌形成過程中發(fā)揮著重要的作用，是影響肌纖維類型的一種肌小節(jié)基因，它的突變常常會引發(fā)肥厚型心肌病的發(fā)生[38]，該基因的高表達(dá)也暗示了其可能與立毛肌的發(fā)育密切相關(guān)。HOX基因家族是胚胎發(fā)生過程中調(diào)控干細(xì)胞和組織模式的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，本研究結(jié)果表明，HOXA9基因在E85天時顯著下調(diào)，這與Schw?rer等[39]的試驗結(jié)果一致，敲低HOXA9基因的小鼠呈現(xiàn)肌纖維顯著增加，通過抑制HOXA9基因的表達(dá)可以使肌肉再生，表明HOXA9基因的下調(diào)促進(jìn)了肌肉干細(xì)胞的分化。SOX15基因在E85天時顯著上調(diào)，Lee等[40]的研究表明，SOX15基因?qū)∪獾脑偕兄匾淖饔茫琒avage等[41]的研究顯示，SOX15基因可能是早期肌肉前體細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子，它的表達(dá)對肌肉發(fā)生是正向調(diào)控作用，表明SOX15在E85天時的上調(diào)可能促進(jìn)立毛肌的發(fā)生過程。因此，推測SPP1、BAMBI、TNNI3、HOXA9、SOX15為影響藏羊立毛肌發(fā)生的候選基因。

黑色代表表達(dá)量上調(diào)的基因；淺灰色代表表達(dá)量下調(diào)的基因Black signal represents genes with up-regulated expression; Light gray signal represents genes with down-regulated expression圖5 差異表達(dá)基因聚類熱圖(A)及網(wǎng)絡(luò)互作圖(B)Fig.5 Heat map of clustering (A) and protein-protein network interaction (B)of differentially expressed genes

4 結(jié) 論

本研究利用組織切片和HE染色技術(shù)推測出藏羊胚胎期立毛肌發(fā)生的關(guān)鍵時期為E75～E85，通過皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，得到1 159個差異表達(dá)基因，其中有47個可能參與到肌肉發(fā)育過程，進(jìn)一步篩選得到5個與立毛肌發(fā)育顯著相關(guān)的候選基因，分別為SPP1、BAMBI、TNNI3、HOXA9、SOX15。該結(jié)果為進(jìn)一步闡述藏羊立毛肌發(fā)生的分子作用機(jī)制以及皮膚調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。