方萌 趙晗池 晴佳（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，武漢430056）

宮頸癌（cervical cancer，CC）是世界上第四大最常見(jiàn)的女性癌癥。近年來(lái)，其發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)［1］。盡管已經(jīng)證實(shí)CC是由HR-HPV（HPV16和18）持續(xù)感染引起的［2］。然而，CC的高復(fù)發(fā)率和異質(zhì)性導(dǎo)致其預(yù)后較差。因此，開發(fā)新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)記非常迫切。MicroRNA（miRNA）的異常表達(dá)被認(rèn)為是各種癌癥發(fā)展的關(guān)鍵因素［3］。作為miR?NA家族的成員，miR-141-3p影響多種癌癥進(jìn)展，并且在CC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［4-5］。已有研究報(bào)道m(xù)iR-141-3p通過(guò)靶向單個(gè)基因影響CC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲［6］。但在CC的預(yù)后預(yù)測(cè)方面，基于預(yù)后模型的多基因簽名比單基因的準(zhǔn)確度更高?？紤]到免疫微環(huán)境對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵作用，深入簽名基因的免疫浸潤(rùn)有可能幫助改善CC的預(yù)后預(yù)測(cè)。先前研究尚未探索miR-141-3p的靶基因與免疫微環(huán)境之間的相關(guān)性。因此，全面分析miR-141-3p的靶基因與總體生存率之間的相關(guān)性，建立可靠的免疫相關(guān)的多基因簽名以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)CC病人的生存至關(guān)重要。機(jī)器學(xué)習(xí)在快速、準(zhǔn)確的確定基因標(biāo)記物中起到了重要作用［7-9］。并且，諾謨圖比普通的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型擁有更好的預(yù)后預(yù)測(cè)能力。在以往的研究中，已結(jié)合實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)方法來(lái)研究肝癌與其他疾病的預(yù)后標(biāo)記物與免疫調(diào)節(jié)分子機(jī)制［10-12］。本文通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-141-3p在CC中的預(yù)后性能。使用WGCNA、COX回歸、LASSO COX回歸建立并驗(yàn)證了與免疫浸潤(rùn)相關(guān)的多基因簽名與諾謨圖，以預(yù)測(cè)患者的生存。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理CC（TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中簡(jiǎn)寫為CESC）的mRNA，miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)可從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下載。表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換和歸一化處理，排除無(wú)隨訪消息或<1 d的時(shí)間臨床數(shù)據(jù)。

1.2 miR-141-3p靶基因的篩選使用miRWalk2.0（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mir?walk2/）中的12個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（Microt4，miRWalk，mirbridge，miRanda，miRDB，miRMap，Pictar2，PITA，MiRNAMap，RNAhybrid，RNA22和Targetscan）來(lái)確定miR-141-3p的靶基因。然后，使用R語(yǔ)言中的“l(fā)imma”程序包分析CESC數(shù)據(jù)。以FDR<0.01，|log2FC|≥2為閾值篩選差異表達(dá)基因（DEGs）。最后，通過(guò)Venn Plot分析DEGs與預(yù)測(cè)基因之間的重疊基因（候選基因）。

1.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析通過(guò)R軟件中的“WGCNA”軟件包分析候選基因的表達(dá)和臨床文件。通過(guò)計(jì)算基因?qū)χg的Pearson相關(guān)性，模塊特征基因與性狀（包括疾病狀態(tài)）的相關(guān)性，確定與預(yù)后相關(guān)的基因模塊。

1.4 基于LASSO COX回歸的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型通過(guò)單變量Cox回歸分析探討了每個(gè)模塊基因?qū)傮w生存的影響。將P<0.05和與生存相關(guān)的模塊基因整合到機(jī)器學(xué)習(xí)算法（LASSO回歸）中，以鑒定預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)特征。使用R包“timeROC”繪制tROC曲線，預(yù)測(cè)1年、3年和5年總體生存。

1.5 基于支持向量機(jī)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)基于支持向量機(jī)的CIBERSORT算法用于計(jì)算每個(gè)患者中22個(gè)免疫細(xì)胞的比例。通過(guò)wilcoxon檢驗(yàn)評(píng)估了高危和低?；颊咧g免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的差異（P<0.05）。TIMER用于分析簽名基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。

1.6 基因集富集分析通過(guò)“clusterprofiler”軟件包（Perm=1 000，minGSSize=100和P.value=0.01）分析了高危和低危患者之間的信號(hào)通路多樣性?！發(fā)imma”程序包用于計(jì)算基因的logFC值。

2 結(jié)果

2.1 miR-141-3p的臨床價(jià)值miR-141-3p在腫瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)（P=0.003 2，圖1A）。ROC曲線表明miR-141-3p的表達(dá)可以很好地將腫瘤與正常樣品區(qū)分開（AUC=0.871 19，圖1B）。以303個(gè)腫瘤組織中miR-141-3p的平均值作為臨界值，將所有患者分為低表達(dá)和高表達(dá)患者。排除生存時(shí)間缺或生存時(shí)間為0的情況得到的患者樣本為280個(gè)。生存分析結(jié)果表明，miR-141-3p的低表達(dá)可顯著改善患者的預(yù)后，而高表達(dá)對(duì)應(yīng)不良的預(yù)后（P=0.022 0，圖1C）。tROC曲線分析表明，miR-141-3p對(duì)患者的預(yù)后具有很強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力。1年、3年和5年的AUC分別為0.762、0.715和0.741（圖1D）。

圖1 miR-141-3p的臨床價(jià)值Fig.1 Clinical value of miR-141-3p

2.2 鑒定預(yù)后相關(guān)基因模塊miR-141-3p靶基因包含1 485個(gè)交集基因（圖2A）。選擇軟閾值=5以符合無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)法則（圖2B）?；诨蚝蜆颖緮?shù)據(jù)的層次聚類建立的網(wǎng)絡(luò)熱圖（圖2C）。在9個(gè)模塊和多個(gè)臨床表型參數(shù)的相關(guān)分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)黃色模塊同時(shí)與T.stage（cor=0.28，P=1e-06），N.stage（cor=-0.23，P=5e-05）和AJCC階段（cor=0.22，P=2e-04）具有很強(qiáng)的相關(guān)性（圖2D）。因此，確定黃色模塊為與CC預(yù)后相關(guān)的功能性miR-141-3p下游基因集。

圖2 WGCNA分析Fig.2 WGCNA analysis

2.3 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型與諾謨圖隨機(jī)將280例CC患者的樣本分為訓(xùn)練集（n=140）和驗(yàn)證集（n=140）。通過(guò)單變量COX回歸確定了與訓(xùn)練集中的患者OS顯著相關(guān)的31個(gè)基因（P<0.05）。利用LASSO回歸進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)果，最后有5個(gè)靶標(biāo)顯著影響患者的生存率（表1，圖3A）?；贚ASSO COX分析的結(jié)果，建立了5個(gè)靶標(biāo)簽名風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型。模型公式為：RS=0.012 1×FOXA1+0.007 7×DMBX1+0.149 3×TMEM98+0.014 2×RHPN1+0.026 4×SRMS基 于 訓(xùn)練集的生存分析表明，與高風(fēng)險(xiǎn)相比，低風(fēng)險(xiǎn)可以顯著改善患者的預(yù)后（P=0.000 54）。tROC曲線分析表明，該風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型具有顯著的預(yù)后預(yù)測(cè)效果，其1年、3年和5年AUC分別為0.810、0.821和0.679（圖3B）。此外，基于驗(yàn)證集K-M曲線分析（P=0.000 86）和tROC分析也證實(shí)了上述結(jié)果（圖3C）。

表1 與OS相關(guān)的5個(gè)預(yù)后靶標(biāo)Tab.1 5 prognostic targets related to OS

圖3 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型構(gòu)建與驗(yàn)證Fig.3 Risk prediction model construction and verification

通過(guò)單變量和多變量COX回歸評(píng)估了患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和多種臨床特征。分析顯示，在訓(xùn)練和驗(yàn)證組中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和AJCC分期與患者的OS顯著相關(guān)（表2）。通過(guò)組合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和AJCC分期而建立的諾謨圖（C-index=0.83，圖4A）在預(yù)測(cè)患者生存率方面明顯優(yōu)于單獨(dú)使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（C-index=0.77）和AJCC分期（C-index=0.70）。基于訓(xùn)練集的研究發(fā)現(xiàn)。1年、3年和5年OS預(yù)測(cè)表明，由諾謨圖預(yù)測(cè)的生存率與最佳預(yù)測(cè)性能非常匹配（圖4B）。與以上結(jié)果一致，諾謨圖（C-index=0.68，圖4C）與預(yù)后因素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（C-index=0.67）和AJCC分期（C-index=0.56）相比，具有更好的預(yù)后和預(yù)測(cè)能力（驗(yàn)證集）。同時(shí)，校準(zhǔn)曲線還驗(yàn)證了驗(yàn)證集中諾謨圖的預(yù)后預(yù)測(cè)性能（圖4D）。

表2 預(yù)后信息的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analyses of prognostic informations

圖4 建立預(yù)后模型的諾謨圖Fig.4 Establishment of nomogram of prognostic model

2.4 低危和高危人群免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和GSEA通路差異基于CIBERSORT的280個(gè)腫瘤樣品中22個(gè)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)率（圖5A、B）。CD4+T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞M0和M2是腫瘤微環(huán)境中3個(gè)最豐富的免疫細(xì)胞。有趣的是，巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤(rùn)率最大，約占免疫細(xì)胞的65%。在TCGA訓(xùn)練集中，高危和低?；颊咧g存在5種類型（P<0.05）的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異（圖5C）。根據(jù)TCGA驗(yàn)證集，在不同風(fēng)險(xiǎn)組中存在6種類型（P<0.05）的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異（圖5D）。并且通過(guò)TIMER獲得了預(yù)后標(biāo)志介導(dǎo)的免疫浸潤(rùn)變化（圖6）。結(jié)果表明，樹突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)與5個(gè)基因在預(yù)后標(biāo)志物中的表達(dá)顯著相關(guān)?；谌蚪MGSEA分析，在高危和低?；颊咧蝎@得了6條重要的KEGG通路（圖7）。

圖5 基于CIBERSORT算法分析22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)Fig.5 Analysis of 22 immune cells infiltration according to CIBERSORT algorithm

圖6 基于TIMER的5種預(yù)后基因表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between 5 prognostic gene expression and tumor infiltrating immune cells based on TIMER

圖7 GSEA獲得了高危組和低危組間存在差異的6條通路Fig.7 GSEA obtained 6 pathways with differences be?tween high-risk group and low-risk group

3 討論

首先通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)集挖掘了miR-141-3p的臨床價(jià)值。結(jié)果表明，miR-141-3p在CC組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，與LI等［6］的研究一致。miR-141-3p高表達(dá)水平表明CC患者生存期較差。tROC曲線表明，miR-141-3p的表達(dá)對(duì)患者的預(yù)后具有強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力。然后，對(duì)miR-141-3p的潛在靶標(biāo)進(jìn)行了全面分析。WGCNA指出目標(biāo)基因模塊與T.Stage，N.stage和AJCC階段顯著相關(guān)。

越來(lái)越多的研究表明，基因標(biāo)記在預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后中起著重要的作用［13-15］。迄今為止，還未有研究通過(guò)將WGCNA和LASSO Cox回歸方法相結(jié)合以鑒定miR-141-3p的預(yù)后靶基因標(biāo)志物來(lái)提高CC預(yù)后的預(yù)測(cè)。在本次研究中，通過(guò)對(duì)miR-141-3p的候選基因進(jìn)行了WGCNA和LASSO Cox回歸確定了5個(gè)與預(yù)后相關(guān)的靶基因。在以前的報(bào)道中，F(xiàn)OXA1、DMBX1、TMEM98、RHPN1和SRMS與CC細(xì)胞遷移發(fā)展顯著相關(guān)［16-20］。

作為一種機(jī)器學(xué)習(xí)算法，LASSO COX已有大量研究［21-23］。對(duì)于生存數(shù)據(jù)，最常用的統(tǒng)計(jì)模型是Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型［24］。而其他傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)算法如隨機(jī)森林、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、貝葉斯算法并沒(méi)有專門開始針對(duì)生存數(shù)據(jù)的模塊。本研究的重點(diǎn)是預(yù)測(cè)CC患者的總體生存。作為機(jī)器學(xué)習(xí)算法的LAS?SO COX算法能夠識(shí)別潛在的風(fēng)險(xiǎn)因素，評(píng)估預(yù)測(cè)、擬合優(yōu)度，以及結(jié)果的臨床相關(guān)性［25］。故本文采用LASSO COX回歸作為機(jī)器學(xué)習(xí)算法。LASSO COX模型的優(yōu)點(diǎn)在于可以直接解釋患病風(fēng)險(xiǎn)和生存之間的關(guān)系。另一方面，機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)是無(wú)假設(shè)和數(shù)據(jù)自適應(yīng)，這意味著它們可以有效地用于對(duì)復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行建模。當(dāng)然，LASSO COX算法也存在一定的局限。例如，該算法要求輸入數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚恚⑶矣?jì)算過(guò)程中會(huì)對(duì)參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以避免算法性能下降［26］。

研究表明，多基因簽名在預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后中起著至關(guān)重要的作用。LIANG等［27］提出了一種3-miRNA簽名，用于CC的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)。XIE等［28］還確定了1個(gè)8基因簽名來(lái)預(yù)測(cè)CC患者的預(yù)后。此外，LI等［29］使用組蛋白家族基因簽名來(lái)預(yù)測(cè)CC患者的生存。同樣，DING等［30］提出了1個(gè)3基因簽名，以通過(guò)Cox回歸改善CC的生存預(yù)測(cè)。先前的研究使用單變量Cox回歸分析方法來(lái)預(yù)測(cè)CC患者的生存。但當(dāng)前對(duì)CC預(yù)后簽名的研究用到的算法不夠深入，對(duì)簽名基因的免疫浸潤(rùn)角色也極少關(guān)注。本文通過(guò)結(jié)合WGCNA、LASSO Cox回歸以及支持向量機(jī)算法得到的5個(gè)基因簽名和諾謨圖，有效改善了CC預(yù)后的預(yù)測(cè)。WGCNA使用無(wú)監(jiān)督聚類來(lái)識(shí)別基因模塊，默認(rèn)方法是分層聚類。分層聚類是一種用于確定多維空間中相似數(shù)據(jù)點(diǎn)聚類的常用方法，它可以使用動(dòng)態(tài)樹切割方法來(lái)確定模塊［31-32］。動(dòng)態(tài)樹切割方法成功地識(shí)別了使用靜態(tài)切割方法無(wú)法識(shí)別的分支，產(chǎn)生預(yù)后相關(guān)的基因簇。為了結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)單變量COX回歸分析基因簇以獲得與總體生存相關(guān)的基因，利用LASSO COX算法則解決了肝癌從高維數(shù)據(jù)獲得的預(yù)測(cè)模型可能具有過(guò)擬合的風(fēng)險(xiǎn)，構(gòu)建了預(yù)后的特征?；陲L(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床特征，通過(guò)多變量COX回歸建立了諾謨圖。而研究結(jié)果也證實(shí)，諾謨圖在預(yù)測(cè)患者生存率方面明顯優(yōu)于單獨(dú)使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（C-index=0.77）和AJCC分期（C-index=0.70）。因而，基于預(yù)后簽名的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分顯示出生存預(yù)測(cè)具備潛在優(yōu)勢(shì)。

確定5個(gè)基因的特征后，構(gòu)建5個(gè)基因的預(yù)后模型并研究其預(yù)后價(jià)值。發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練組和驗(yàn)證組的高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)水平的預(yù)后顯著不同。所有高危人群的OS均低于低危人群。tROC分析表明5個(gè)基因簽名具有很強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力。腫瘤的進(jìn)展不僅受腫瘤本身特征的影響，而且還受腫瘤微環(huán)境的影響。值得注意的是本實(shí)驗(yàn)的預(yù)后標(biāo)志與腫瘤微環(huán)境的免疫浸潤(rùn)水平顯著相關(guān)。根據(jù)CIBERSORT分析，發(fā)現(xiàn)在不同的風(fēng)險(xiǎn)組中，B細(xì)胞，漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞M1、M2具有較大的豐度差異。此外，GSEA還揭示了高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組相比有6種不同的免疫狀態(tài)。因此，研究結(jié)果可為CC患者更好的治療提供依據(jù)。

總之，綜合運(yùn)用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、COX回歸、LASSO回歸算法，開發(fā)并驗(yàn)證了基于miR-141-3p的預(yù)后靶基因的新型5個(gè)基因簽名（FOXA1、DMBX1、TMEM98、RHPN1和SRMS），并進(jìn)行了預(yù)后分析。結(jié)果顯示，與免疫浸潤(rùn)相關(guān)的5個(gè)基因簽名可以顯著改善CC患者的預(yù)后。因此，本次研究提出的5個(gè)基因簽名與諾謨圖有潛力為CC患者提供預(yù)后評(píng)估工具。