徐兵 李勇 劉明 劉永輝（南華大學附屬第三醫(yī)院泌尿外科，衡陽421900）

膀胱癌是一種泌尿系統(tǒng)腫瘤，位居全球男性最常見癌癥的第7位，四分之三的病例發(fā)生于男性，但近年來，其在女性中的發(fā)病率和死亡率也呈明顯上升趨勢［1-2］。膀胱癌具有易轉(zhuǎn)移、易復發(fā)特點，轉(zhuǎn)移性膀胱癌一直以來都是臨床上難以解決的問題，死亡率較高［3］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchy?mal transition，EMT）是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性過程，在膀胱癌進展中發(fā)揮重要作用［4］。因此，調(diào)控EMT，抑制膀胱癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，將為膀胱癌的治療提供更多可能。三結(jié)構(gòu)域蛋白31（tripar?tite motif containing 31，TRIM31）是含trip基因序列蛋白家族的一員，具有E3泛素連接酶活性，廣泛參與機體生物學和病理過程。TRIM31在多種癌癥中表達上調(diào)，且過度表達可促進腫瘤細胞的惡性行為，增強腫瘤的侵襲能力［5-6］。蔡坤等［7］發(fā)現(xiàn)，沉默胰腺癌細胞中TRIM31的表達可抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。有研究顯示，TRIM31是正常人與膀胱癌患者間的差異表達基因之一，在膀胱癌中呈高表達［8］。但關(guān)于TRIM31在膀胱癌中的作用，對膀胱癌細胞遷移、侵襲及EMT的影響卻鮮有報道，故本研究通過體外實驗，觀察沉默TRIM31基因表達對膀胱癌細胞遷移和侵襲的影響，并初步闡明其作用機制，以期為臨床靶向治療膀胱癌提供更多理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人膀胱癌細胞系5637和T24均購自中國科學院細胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine?NAiMAX、TRIzol購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；SYBR Green PCR試劑盒購自美國KAPA Biosystems公司；Matri?gel膠購自美國BD公司；小鼠抗人TRIM31多克隆抗體、兔抗人β-連環(huán)蛋白（β-catenin）多克隆抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）多克隆抗體、兔抗人MMP-9多克隆抗體、兔抗人波形蛋白（Vimentin）多克隆抗體、兔抗人上皮鈣依賴黏附蛋白（E-cadherin）單克隆抗體、兔抗人Snail1多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體和山羊抗小鼠IgG抗體均購自英國Abcam公司；化學發(fā)光試劑、PVDF膜購自美國Milli?pore公司；TRIM31 siRNA和陰性對照片段（NC）由北京華大基因設(shè)計合成；倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡公司；熒光定量PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司；Transwell培養(yǎng)小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染從液氮罐中取出人膀胱癌5637和T24細胞，37℃水浴融化凍存液，1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入1 ml DMEM重懸細胞沉淀。轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再加入4 ml含10%胎牛血清的新鮮DMEM，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的5637和T24細胞，以2×105個/孔分別接種于6孔板，待細胞融合度達到80%時，將細胞分為對照組、siRNA-NC組和siRNATRIM31組，采用Lipofectamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑將TRIM31 siRNA和NC分別轉(zhuǎn)染至細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞沉淀檢測TRIM31 mRNA和蛋白表達水平，以驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中TRIM31 mRNA表達水平取各組細胞沉淀，TRIzol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，利用SYBR Green PCR試劑盒進行PCR擴增檢測。反應(yīng)條件：94℃2 min；98℃變性10 s，54℃退火15 s，68℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃7 min。以下為引物序列，TRIM31 F：5'-GTCTTGTGCAGAAGTGAAGAGTT-3'，R：5'-TCACAAAACCAAGCCCGGAT-3'；GAPDH F：5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'，R：5'-AGTAC-TTGCGCTCAGGAGGA-3'。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-??Ct方法計算TRIM31 mRNA相對表達量。

1.2.3 Transwell檢測細胞遷移與侵襲消化轉(zhuǎn)染后的細胞，用不含血清的DMEM饑餓處理12 h。制作單細胞懸液，稀釋至濃度為1×105個/ml，接種于Transwell小室，每小室含0.5 ml細胞懸液，下層24孔板中加入0.75 ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入1 ml 4%甲醛固定10 min，再加入1 ml 0.5%結(jié)晶紫溶液染色30 min。PBS洗滌3次，室溫晾干，擦去Transwell小室中沒有遷移的細胞，于顯微鏡下隨機取5個視野觀察細胞遷移情況并計數(shù)。侵襲實驗時，需在Transwell小室上室底部鋪設(shè)Matrigel膠，其他步驟與遷移實驗一致。

1.2.4 免疫熒光染色觀察β-catenin蛋白核轉(zhuǎn)位水平用胰酶消化各組細胞，制成單細胞懸液，以2×105個/孔接種于6孔板（孔內(nèi)加入玻片），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗后，加入0.5%Triton X-100通透20 min，加入5%封閉液封閉1 h。PBS清洗，加入兔抗β-catenin抗體稀釋液（1∶500），37℃孵育1 h。PBS洗滌3次，加入經(jīng)熒光標記的二抗稀釋液，37℃孵 育30 min，PBS洗滌3次，滴加DAPI避光孵 育10 min，PBS洗滌3次，再滴加抗熒光淬滅封片液，取一塊干凈的載玻片，吸取多余的液體，細胞面朝下貼于載玻片上，顯微鏡觀察染色情況。

1.2.5 Western blot檢測細胞中蛋白表達水平取各組細胞沉淀，采用RIPA裂解液提取細胞蛋白，經(jīng)BCA法測蛋白濃度后，取20μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳分離。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，37℃封閉1 h。加入一抗稀釋液TRIM31（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、MMP-2（1∶2 000）、MMP-9（1∶1 000）、Vimentin（1∶2 000）、E-cadherin（1∶1 000）、Snail1（1∶500）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育過夜。PBS清洗3次，加入二抗稀釋液［經(jīng)HRP標記的IgG（1∶10 000）］，室溫孵育1 h，PBS清洗3次。加入化學發(fā)光試劑，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析各蛋白條帶灰度值，計算蛋白質(zhì)相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 siRNA沉默膀胱癌細胞中TRIM31基因表達

qRT-PCR（圖1A）和Western blot（圖1B）檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，siRNA-NC組T24細胞和5637細胞中的TRIM31mRNA及蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與siRNA-NC組相比，siRNATRIM31組T24細胞和5637細胞中的TRIM31mRNA及蛋白表達水平均降低（P<0.01），證實本研究成功獲得TRIM31基因沉默的膀胱癌細胞株。

圖1 TRIM31基因沉默對T24和5637細胞中TRIM31 mRNA和蛋白表達的影響Fig.1 Effect of silencing TRIM31 gene on mRNA and pro?tein expressions of TRIM31 in T24 and 5637 cells

2.2 沉默TRIM31基因?qū)Π螂装┘毎w移與侵襲的影響Transwell檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，siRNA-NC組T24和5637細胞遷移和侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM31組T24和5637細胞遷移和侵襲細胞數(shù)減少（P<0.01，圖2、3）。Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，siRNA-NC組T24和5637細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM31組T24和5637細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯降低（P<0.01，圖4）。

圖2 TRIM31基因沉默對T24和5637細胞的遷移的影響（×200）Fig.2 Effect of silencing TRIM31 gene on migration of T24 and 5637 cells（×200）

圖4 TRIM31基因沉默對T24和5637細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響Fig.4 Effect of silencing TRIM31 gene on protein expres?sions of MMP-2 and MMP-9 in T24 and 5637 cells

2.3 沉默TRIM31基因?qū)Π螂装┘毎?catenin蛋白核轉(zhuǎn)位的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組和siRNA-NC組T24和5637細胞中β-catenin蛋白熒光在細胞核中高密度聚集，在細胞質(zhì)中也有大量表達；而siRNA-TRIM31組T24和5637細胞中β-catenin蛋白熒光在細胞核和細胞質(zhì)中均較弱（圖5）。

圖3 TRIM31基因沉默對T24和5637細胞的侵襲的影響（×200）Fig.3 Effect of silencing TRIM31 gene on invasion of T24 and 5637 cells（×200）

圖5 免疫熒光染色觀察T24和5637細胞中β-catenin蛋白定位（×400）Fig.5 Location of β-catenin protein in T24 and 5637 cells was observed by immunofluorescence（×400）

2.4 沉默TRIM31基因?qū)Π螂装┘毎鸈MT相關(guān)蛋白及Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的影響與對照組相比，siRNA-NC組T24和5637細胞中βcatenin、Snail1、Vimentin和E-cadherin蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與siRNA-NC組相比，siR?NA-TRIM31組T24和5637細胞中β-catenin、Snail1和Vimentin蛋白表達水平降低（P<0.01），而E-cad?herin蛋白表達水平升高（P<0.01，圖6）。

圖6 Western blot檢 測T24和5637細 胞 中β-catenin、Snail1、Vimentin和E-cadherin蛋白表達水平Fig.6 Expressions of β-catenin，Snail1，Vimentin and Ecadherin in T24 and 5637 cells were detected by Western blot

3 討論

EMT發(fā)生在多種生理和病理條件下，由一組保守的誘導信號、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和下游效應(yīng)器驅(qū)動而成［9］。良性腫瘤向侵襲性增強表型進展的過程很大程度依賴于EMT的激活，調(diào)控EMT過程對腫瘤的治療及控制轉(zhuǎn)移具有重要作用［9-10］。膀胱癌是男性最常見的癌癥之一，抑制膀胱癌細胞的遷移、侵襲和EMT成為治療膀胱癌的新策略之一［11］。EMT相關(guān)標記蛋白包括E-cadherin、Vimentin和Snail1等［12］。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)上皮質(zhì)性標志物（E-cadherin），下調(diào)間質(zhì)性標志物（Vimentin）可抑制腫瘤細胞的侵襲能力［13］。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，多種信號通路可通過誘導EMT轉(zhuǎn)錄因子（如Snail1）的表達而觸發(fā)EMT，最終促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥，當Snail1表達被抑制后則無法執(zhí)行下游的信號傳導，從而調(diào)控EMT過程［14］。SALEHI等［15］認為Snail1在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可作為浸潤性膀胱癌靶向治療的潛在靶點，當沉默膀胱癌細胞中Snail1表達時，Vimentin、MMPs均表達下調(diào)，E-cadherin表達上調(diào)，細胞遷移能力減弱。本實驗中Transwell檢測結(jié)果顯示，當下調(diào)膀胱癌T24和5637細胞中TRIM31表達時，發(fā)生遷移與侵襲的T24細胞和5637細胞數(shù)量均明顯少于對照組和空載組，說明沉默TRIM31表達可抑制膀胱癌細胞的遷移與侵襲能力。進一步檢測EMT相關(guān)蛋白表達水平，結(jié)果顯示，與對照組或空載組相比，TRIM31干擾組T24細胞和5637細胞中Vimentin與Snail1蛋白表達水平明顯降低，E-cadherin表達水平明顯升高，提示沉默膀胱癌細胞中TRIM31表達，可抑制腫瘤細胞EMT過程，從而影響膀胱癌細胞的遷移與侵襲能力。

Wnt/β-catenin信號通路可作為誘發(fā)EMT的因素之一，是EMT過程中重要的信號通路之一，抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的EMT，進而降低腫瘤的侵襲性［16-17］。β-catenin是介導細胞膜到細胞核間信號傳導的中心分子，當βcatenin從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核時，激活下游靶基因（Snail1、MMP-2、MMP-9等）。ZHANG等［18］研究結(jié)果顯示，沉默膀胱癌細胞中β-catenin的表達，可通過Wnt/β-catenin信號通路逆轉(zhuǎn)EMT，進而抑制膀胱癌細胞的轉(zhuǎn)移與侵襲。SHI等［19］研究也發(fā)現(xiàn)抑制Wnt/β-catenin信號通路后，MMP-2和MMP-9表達降低，影響EMT的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除TRIM31基因可抑制急性髓系白血病細胞Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而調(diào)控細胞的增殖、凋亡和耐藥性［20］。本實驗結(jié)果與上述研究發(fā)現(xiàn)基本一致，TRIM31基因在膀胱癌細胞中亦可調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的激活，當沉默T24細胞和5637細胞中TRIM31基因的表達，β-catenin表達減少，下游靶基因Snail1、MMP-2和MMP-9的表達也明顯減少。本研究結(jié)果提示，抑制膀胱癌細胞中TRIM31基因的表達可抑制Wnt/β-catenin信號通路以及下游靶基因的表達水平，進而調(diào)控膀胱癌細胞EMT。

綜上所述，沉默TRIM31可抑制膀胱癌細胞的遷移與侵襲，其作用機制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制膀胱癌細胞的EMT過程有關(guān)，推測TRIM31可能是膀胱癌治療的潛在靶點。本研究結(jié)果為膀胱癌靶向治療奠定了一定的實驗基礎(chǔ)，后續(xù)還將進一步從體內(nèi)實驗進行驗證。