蘇韞 李春波 龔紅霞 薛軒 李婷婷 牛世偉（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州730000）

胃癌是胃腸道最嚴(yán)重的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)分別居于第五位和第三位［1］。臨床上胃癌的治療方式以手術(shù)為主，化療為輔。然而化療不僅毒副反應(yīng)明顯，還會降低機(jī)體免疫力，影響化療進(jìn)程［2］。目前，中醫(yī)藥輔助治療胃癌被廣泛關(guān)注，其在防治腫瘤方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢。

中醫(yī)將胃癌歸屬于“胃痛”“反胃”“噎嗝”“癥瘕積聚”等范疇［3］。中醫(yī)認(rèn)為，胃癌患者大多脾胃不和，健運(yùn)失常，且歷經(jīng)手術(shù)及化療，脾胃失調(diào)，氣血虧虛，肝腎虧損，累及骨髓。治療應(yīng)以補(bǔ)益氣血、健脾和胃、滋補(bǔ)肝腎為先［4-5］。歸芪白術(shù)方是由明朝朱棣等著的《普濟(jì)方》中的“黃芪湯”加白術(shù)而成。黃芪湯主治一切瘡腫疼痛，并結(jié)合胃癌術(shù)后化療氣滯血瘀、脾虛濕困病證特點(diǎn)，具有攻補(bǔ)兼顧、扶正祛邪的特點(diǎn)，諸藥共奏健脾益氣、化瘀疏肝、潤腸通便功效。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，歸芪白術(shù)方輔助治療不僅對胃癌患者的血清腫瘤標(biāo)志物、免疫炎癥因子及生活質(zhì)量具有明顯改善作用，可以升高患者機(jī)體白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、中性粒細(xì)胞（neu?trophil，Neu）、淋巴細(xì)胞（lymphocyte，Lym）、紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）和血小板（platelet，PLT），減輕化療藥物對機(jī)體腫瘤免疫應(yīng)答帶來的影響，還可改變患者腸道菌群及血清環(huán)狀RNA（circRNA）的表達(dá)［6-7］。

胃癌是一個(gè)多種因素綜合作用的過程，其中炎癥是其重要的一環(huán)。長期的慢性炎癥可損傷胃黏膜，進(jìn)而發(fā)展成胃癌［8］。IL-17是一種前炎癥細(xì)胞因子，也是炎癥反應(yīng)的微調(diào)因子。通過與IL-17受體（IL-17R）特異性結(jié)合，促進(jìn)多種細(xì)胞生成并釋放出炎癥因子。NF-κB信號通路作為重要的炎癥信號通路，激活后參與機(jī)體感染、炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理過程，且與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］。因此，研究IL-17/NF-κB信號通路對于胃癌的機(jī)制探討具有理論意義。本實(shí)驗(yàn)通過IL-17/NF-κB信號通路，研究歸芪白術(shù)方含藥血清對胃癌MKN-45細(xì)胞增殖的影響，探討歸芪白術(shù)方輔助治療胃癌的作用機(jī)制，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑胃癌MKN-45細(xì)胞，傳至4~5代；雄性SD大鼠25只，體重180~220 g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。符合甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會指導(dǎo)原則與要求。動(dòng)物合格許可證號：SYXK（甘）2015-0005。DMEM培養(yǎng)基，0.25%胰酶，胎牛血清，細(xì)胞增殖檢測（CCK-8）試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒，RIPA裂解液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，4×蛋白上樣緩沖液購于北京索萊寶生物科技有限公司；單克隆抗體（IL-17、IKK-β、p-NF-κBp65）購于GeneTex公司；IL-6、NF-κBp65購于Immunoway公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司；黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、白芍、大黃（酒）、陳皮、甘草，均購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。

1.1.2 主要儀器蛋白印跡電泳儀、CFX 96型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀、VELOCITY 18R型臺式高速冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀、P100+型超微量分光光度計(jì)、Chemi Doc XRS凝膠成像分析系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 歸芪白術(shù)方藥液制備歸芪白術(shù)方由黃芪20 g、當(dāng)歸10 g、白術(shù)10 g、白芍10 g、大黃（酒）6 g、陳皮6 g、甘草6 g組成。先用冷水浸泡中藥30 min，再加入1 000 ml蒸餾水中煎煮，大火燒開后用小火煮30 min，過濾藥液留存，把前后2次藥液合并濃縮至生藥質(zhì)量濃度6.12 g/ml，使用時(shí)倍比稀釋。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 歸芪白術(shù)方含藥血清的制備及分組將25只雄性SD大鼠隨機(jī)分為歸芪白術(shù)方高、中、低劑量組、空白組和陽性藥組。參考李康樂［10］、林德榮［11］、余婧萍［12］等的給藥方法制備歸芪白術(shù)方含藥血清。設(shè)置歸芪白術(shù)方高、中、低劑量分別為6.12 g/ml、3.06 g/ml、1.53 g/ml，空白組給予生理鹽水灌胃3 d，每天上午下午各灌胃1次，每次3 ml；陽性藥組按照奧沙利鉑濃度15 mg/kg腹腔注射，每天2次。第3天最后1次灌胃、注射結(jié)束1 h，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，離心后取血清，濾膜過濾，56℃水浴滅活，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖將對數(shù)期生長的細(xì)胞接種到96孔板中，每孔約1 000個(gè)細(xì)胞。歸芪白術(shù)方高、中、低劑量組分別在完全培養(yǎng)基中加入相應(yīng)10%含藥血清，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后更換完全培養(yǎng)基100μl，每孔加入CCK-8 10μl，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，全波長酶標(biāo)儀450 nm處測吸光度（A），計(jì)算平均值，細(xì)胞増殖抑制率（%）=［（A空白組-A加藥組）/A空白組］×100%。

1.2.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)各組分別在完全培養(yǎng)基中加入相應(yīng)10%含藥血清，干預(yù)細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〉攘康鞍走M(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，TBST洗膜10 min×3次，按照說明書使用要求加入一抗稀釋液，于4℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次后，加入二抗稀釋液在室溫下?lián)u床孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次后曝光。使用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值計(jì)算，與內(nèi)參比較，分析相對蛋白表達(dá)。

1.2.5 Real-time PCR檢測相關(guān)mRNA表達(dá)各組分別在完全培養(yǎng)基中加入相應(yīng)10%含藥血清，干預(yù)細(xì)胞48 h，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 min，變性95℃10 s，退火60℃20 s，延伸72℃20 s，共循環(huán)40次。運(yùn)用相對表達(dá)量2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物由蘭州科寶生物工程大連科技有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析。若方差齊采用LSD進(jìn)行組間多重比較；若方差不齊采用Dunnett-T3進(jìn)行組間多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 歸芪白術(shù)方含藥血清對MKN-45細(xì)胞增殖的影響歸芪白術(shù)方含藥血清分別干預(yù)MKN-45細(xì)胞24 h、48 h、72 h，與空白組比較，歸芪白術(shù)方含藥血清高、中、低劑量組吸光度值均下降，抑制率均上升，且隨濃度及時(shí)間增加，各組細(xì)胞生長均受到抑制（P<0.05）。結(jié)果表明歸芪白術(shù)方含藥血清能抑制MKN-45細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間和劑量依賴性增加。見表2。

表2 歸芪白術(shù)方含藥血清對MKN-45細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.2 Effect of serum containing Guiqibaizhufang on MKN-45 cell proliferation（±s）

表2 歸芪白術(shù)方含藥血清對MKN-45細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.2 Effect of serum containing Guiqibaizhufang on MKN-45 cell proliferation（±s）

Note：Compared with blank group，1）P<0.05.

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2.2 歸芪白術(shù)方含藥血清對MKN-45細(xì)胞中IL-17、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKK-β和IL-6蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果表明，與空白組比較，陽性藥組和歸芪白術(shù)方高、中、低劑量含藥血清組IL-17、NFκBp65、p-NF-κBp65、IKK-β和IL-6蛋白表達(dá)均減少（P<0.05），其中，歸芪白術(shù)方含藥血清中、高劑量組較為明顯，見圖1、表3。

表3 IL-17、IL-6、IKK-β、NF-κBp65及p-NF-κBp65的表達(dá)（±s）Tab.3 Expression of IL-17，IL-6，IKK-β，NF-κBp65 and p-NF-κBp65（±s）

表3 IL-17、IL-6、IKK-β、NF-κBp65及p-NF-κBp65的表達(dá)（±s）Tab.3 Expression of IL-17，IL-6，IKK-β，NF-κBp65 and p-NF-κBp65（±s）

Note：Compared with blank group，1）P<0.05.

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圖1 IL-17、IL-6、NF-κBp65、pNF-κBp65、IKKβ在各組中的表達(dá)Fig.1 Expressions of IL-17，IL-6，NF-κBp65，pNF-κBp65，IKK-β in each group

2.3 歸芪白術(shù)方含藥血清對MKN-45細(xì)胞中IL-17、NF-κBp65、IKK-β和IL-6 mRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與空白組比較，陽性藥組和歸芪白術(shù)方高、中、低劑量含藥血清組IL-17、NF-κBp65、IKK-β和IL-6 mRNA表達(dá)明顯均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4、圖2。

表4 IL-17、IL-6、IKK-β及NF-κBp65 mRNA的相對定量表達(dá)Tab.4 Relative quantitative expression of IL-17，IL-6，IKK-β and NF-κBp65 mRNA

圖2 IL-17、IL-6、IKK-β及NF-κBp65 mRNA在各組細(xì)胞的相對定量表達(dá)Fig.2 Relative quantitative expression of IL-17，IL-6，IKK-β and NF-κBp65 mRNA in cells of each group

3 討論

慢性胃炎被認(rèn)為是胃癌的關(guān)鍵因素之一。近年來，隨著炎癥與腫瘤的深入研究，慢性胃炎的“炎-癌轉(zhuǎn)化”模式已成為研究的熱點(diǎn)［13-14］。因此有效地抑制慢性胃炎向胃癌的進(jìn)展是關(guān)鍵所在。IL-17是近幾年新發(fā)現(xiàn)的促炎細(xì)胞因子［15-16］。由輔助性T細(xì)胞（Th17）特異性分泌，主要表達(dá)在激活的CD4+T淋巴細(xì)胞［17］。IL-17可誘導(dǎo)早期免疫介質(zhì)的分泌，使炎癥細(xì)胞聚集到損傷部位。IL-17在胃癌發(fā)生發(fā)展的過程中起促進(jìn)的作用。研究發(fā)現(xiàn)胃癌組血清IL-17水平明顯高于健康對照組［18］。陳錦霞等［19］研究表明IL-17在胃癌組織中表達(dá)顯著增高。前期本課題組研究也同樣表明，不論是胃癌患者的血清中還是癌組織中IL-17的含量均明顯升高［20］。當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，IL-17可與細(xì)胞表面的IL-17R特異性結(jié)合，激活I(lǐng)κB激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B ki?nase，IκK），從而導(dǎo)致IκB蛋白磷酸化、泛素化，然后IκB蛋白被降解，NF-κB二聚體得以釋放，NF-κB二聚體通過各種翻譯后的修飾作用而被進(jìn)一步激活，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與目的基因結(jié)合，以促進(jìn)目的基因的轉(zhuǎn)錄，參與多種病理生理過程的調(diào)控，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管生成，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用［21］。研究表明IL-17通過NF-κB途徑上調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá)來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲［22］。宋靜靜等［23］研究發(fā)現(xiàn)IL-17可明顯促進(jìn)SGC7901細(xì)胞分泌IL-6和IL-8，并且通路蛋白NF-κB的表達(dá)水平及其磷酸化水平均明顯升高，表明IL-17可能通過激活NF-κB信號通路來促進(jìn)IL-6和IL-8的分泌，改變腫瘤的炎性微環(huán)境，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展。前期本課題組通過實(shí)驗(yàn)檢測了胃癌患者與健康對照組血清免疫因子IL-6、IL-17、IL-8的表達(dá)水平及胃癌患者胃癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)離癌組織的正常胃組織中NF-κB通路相關(guān)蛋白NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKK-β、IL-6的表達(dá)水平，結(jié)果顯示IL-17、IL-6、IL-8在胃癌患者血清中的表達(dá)水平較健康人群高；胃癌組織中IL-17、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKK-β、IL-6蛋白表達(dá)較高［20］。表明IL-17可通過NF-κB信號通路分泌IL-6及IL-8，使其發(fā)生轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生，從而參與胃癌的免疫調(diào)控以及促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。

中醫(yī)將胃癌歸屬于“胃痛”“反胃”“噎嗝”“癥瘕積聚”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為胃癌的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，其中正氣不足為根本原因，復(fù)加邪氣阻滯機(jī)體，產(chǎn)生氣滯、痰凝、熱毒、血瘀等病理變化，日久釀為癌毒［24］。這與《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“正氣存內(nèi)，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”的觀點(diǎn)一致。故“扶正”是治療胃癌的根本，以補(bǔ)氣健脾為主。歸芪白術(shù)方根據(jù)明?朱棣等《普濟(jì)方》等醫(yī)著“黃芪湯”化裁而來，由黃芪、白術(shù)、當(dāng)歸、白芍、陳皮、酒大黃、甘草7味藥組成，7味藥均歸脾經(jīng)，具有健脾益脾的功效。馬榕［25］對近10年間中醫(yī)治療胃癌術(shù)后方藥文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，高頻用藥頻次分布前10位依次是甘草、茯苓、白術(shù)、黨參、陳皮、黃芪、白芍、半夏、當(dāng)歸、白花蛇舌草。同時(shí)，大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、陳皮相關(guān)組方、單藥及其有效成分，對胃癌等荷瘤小鼠或相關(guān)細(xì)胞株具有顯著抗瘤作用［26-27］。

目前，中藥復(fù)方含藥血清干預(yù)腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究愈來愈多，孫振等［28］研究表明軟堅(jiān)護(hù)肝片含藥血清能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗腫瘤作用。益肺飲含藥血清對肺癌A549細(xì)胞具有明顯的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡的作用［29］。柴胡疏肝散含藥血清可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞VEGF釋放，有效抑制MCF-7細(xì)胞增殖活性［30］。郭雋馥等［31］研究表明益氣健脾方藥四君子湯的含藥血清能夠有效抑制胃癌MGC803細(xì)胞的增殖能力并提高其凋亡率。林德榮等［11］研究表明扶正抑瘤湯含藥血清可以抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。黃麗萍等［26］研究發(fā)現(xiàn)加味七方胃痛顆粒能抑制SGC 7901的增殖并促進(jìn)其凋亡，可能通過下調(diào)胃癌細(xì)胞TFF3、ERK/NF-κB蛋白的表達(dá)水平，從而起到抗癌作用。

本研究嚴(yán)格按照參考文獻(xiàn)制備含藥血清，干預(yù)胃癌MKN-45細(xì)胞，通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，歸芪白術(shù)方含藥血清可以明顯抑制MKN-45細(xì)胞的增殖，進(jìn)而影響MKN-45細(xì)胞的生長。歸芪白術(shù)方含藥血清干預(yù)下，與空白組比較，歸芪白術(shù)方含藥血清高、中、低劑量組光度值均下降，抑制率均上升，且隨濃度及時(shí)間增加，各組細(xì)胞生長均受到抑制。歸芪白術(shù)方含藥血清高、中、低劑量組IL-17、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKK-β和IL-6蛋白表達(dá)降低；IL-17、NF-κBp65、IKK-β和IL-6 mRNA表達(dá)明顯均下降；其中以中、高劑量較為明顯。表明歸芪白術(shù)方含藥血清能抑制MKN-45細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間和劑量依賴性增加，其機(jī)制可能與IL-17/NF-κB信號通路有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)基于IL-17/NF-κB信號通路探討歸芪白術(shù)方治療胃癌的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)支持。但是，胃癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多條通路、多靶點(diǎn)的共同作用，本課題組將在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，探索新方法，進(jìn)一步完善其機(jī)制。