陳子琦 沈暘 胡國華 柯霞洪 蘇玲 康厚墉

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，重慶400016）

顆粒物（PM）是我國現(xiàn)代社會最嚴重的環(huán)境問題之一［1］。PM2.5是指空氣動力學(xué)直徑≤2.5μm的細顆粒物，是中國空氣污染的主要成分，且平均濃度具有空間自相關(guān)性［2-3］。PM2.5表面可吸附各種有毒物質(zhì)，進入呼吸道后主要沉積于氣管支氣管區(qū)域，對人體各器官造成不同程度損傷。PM2.5的致毒性是顆粒物和吸附的有毒污染物的綜合作用，如生物成分（內(nèi)毒素、花粉、真菌孢子、病毒和細菌）、顆粒物、多環(huán)芳烴（PAHs）、揮發(fā)性有機化合物（VOCs）和重金屬［4］。大量研究顯示，PM2.5暴露與多種呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及代謝系統(tǒng)疾病有關(guān)，如氣道過敏性疾病、急性呼吸道感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、糖代謝異常、血壓異常等［5-7］。國內(nèi)一項研究證明，低濃度PM2.5暴露可增加65歲及以上老年人死亡風(fēng)險［8］。OGINO等［9］研究表明，PM2.5可誘導(dǎo)小鼠哮喘樣氣道炎癥，鼻內(nèi)滴注PM2.5懸液可誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥反應(yīng)。此外，WANG等［10］研 究 發(fā) 現(xiàn)，PM2.5短 期 暴 露 可 誘 導(dǎo)BALB/c小鼠急性呼吸道炎癥。

芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋超家族中的PAS亞家族，是配體依賴的多功能轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞內(nèi)外環(huán)境變化檢測，感知生物節(jié)律變化和氧化還原電位，在正常細胞發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用［11］。AhR配體（如二噁英、二噁英類化合物、TCDD、PAH和PM）可激活細胞內(nèi)AhR，AhR解離易位至細胞核，與AhR核轉(zhuǎn)位蛋白（ARNT）形成二聚體轉(zhuǎn)錄因子。最近研究發(fā)現(xiàn)，AhR可與環(huán)境毒物相互作用影響機體免疫應(yīng)答［12］。因此，本研究假設(shè)AhR可能有助于調(diào)節(jié)PM2.5誘導(dǎo)的炎癥中的免疫反應(yīng)，并在環(huán)境因素與炎癥性氣道疾病間起橋梁作用。

細菌溶解產(chǎn)物（broncho-vaxom，BV）是一種由8種細菌（金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、化膿性鏈球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、臭氧克雷伯菌、綠色鏈球菌和肺炎雙球菌）組成的細菌溶解物，已被證明可增強免疫應(yīng)答，對先天性免疫和后天性免疫反應(yīng)具有多種調(diào)節(jié)作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，BV可在黏膜相關(guān)淋巴組織中誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，進而抑制Th2誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，降低過敏原特異性IgE濃度，增加IL-10分泌［14］。同時，BV可有效治療和預(yù)防上呼吸道反復(fù)感染、哮喘、COPD、慢性支氣管炎、急性鼻竇炎、過敏性鼻炎、過敏性皮炎［15-17］。因此，課題組推測BV可能是預(yù)防和治療PM2.5相關(guān)炎癥疾病的新方法。為更好地了解PM2.5暴露及BV治療對小鼠氣道炎癥的作用及機制，本研究旨在探究正常健康小鼠暴露于城市交通相關(guān)PM2.5是否會導(dǎo)致氣道炎癥，吸入PM2.5是否通過AhR途徑參與氣道炎癥性疾病發(fā)病過程，BV可能是否通過調(diào)節(jié)免疫失衡減輕PM2.5誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級BALB/c雌性小鼠30只，6~8周齡，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心代養(yǎng)室，21~24℃，50%~60%相對濕度。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)動物保護與倫理委員會批準。ELISA試劑盒（eBioscience，SanDiego，CA）；反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen）；抗AhR（Sigma-15 Aldrich，USA）；抗β-肌動蛋白（Beyotime）。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5收集采用重慶市環(huán)境監(jiān)測中心的Thermo Scientific TEOM1405-D顆粒監(jiān)測儀收集2018年12月至2019年9月大氣PM2.5樣品，采樣地點為重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院3號樓樓頂，周邊為交通繁忙的十字路口且無大型工業(yè)工廠。PM2.5收集于預(yù)先稱好重量的石英纖維過濾膜，每24 h更換1次過濾膜，換下的石英纖維濾膜在60℃烘箱中干燥6 h后稱重。將含有PM2.5的濾膜切成2 cm×1 cm小塊，浸入100 ml去離子蒸餾水中，超聲振蕩2 h，振蕩液用12層無菌紗布進行過濾，將濾液進行真空冷凍干燥并稱重。無菌生理鹽水配制不同濃度PM2.5混懸液，高壓滅菌，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動物實驗方案30只小鼠隨機分為對照組、PM2.5暴露組和BV干預(yù)組，每組10只。第1~15天，對照組氣管滴注生理鹽水，1次/d，PM2.5暴露組和BV干預(yù)組氣管滴注PM2.5懸浮液（8 mg/kg），1次/d；第16~90天，對照組和PM2.5暴露組口服給予生理鹽水，0.2 ml/（只·d），BV干預(yù)組口服給予BV溶液（50 mg/ml），0.2 ml/（只·d）。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果和文獻，本研究采用暴露式氣管滴注法染毒［18-20］。末次干預(yù)后24 h內(nèi)處死小鼠，取血、氣管及肺組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HE染色4%多聚甲醛處理小鼠氣管組織，石蠟包埋切片（4~5μm），HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.2.4 ELISA檢測血清細胞因子水平小鼠心臟取血，4℃、1 500 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。按特異性ELISA試劑盒說明檢測血清中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17和IL-33水平，結(jié)果以pg/ml表示。

1.2.5 RT-qPCR檢測AhR mRNA表達采用TRIzol提取液提取肺組織樣本總RNA，隨機六聚體引物和RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用ABI Prism 7500 PCR系統(tǒng)和SYBR Premix-Taq染料進行實時熒光PCR，檢測mRNA表達。AhR F：5'-TCCCTTATGAGTGCCTTGA-3'，R：5'-GTCTGATTTCCTCGTGTTTC-3'。PCR反應(yīng)按以下步驟重復(fù)2次：50℃2 min，90℃10 min，95℃15 s，循環(huán)50次，60℃1 min。比較Ct法計算mRNA相對表達，以β-actin為內(nèi)參，無模板樣品為陰性對照。

1.2.6 Western blot檢測AhR蛋白表達溶解肺組織，提取蛋白，進行Western blot實驗，采用抗AhR或抗β-肌動蛋白進行一抗孵育，采用ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑盒測定膜中蛋白免疫反應(yīng)性，醫(yī)用膠片中暴露。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用Medcalc15.2.2軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）。數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時采用Mann-Whitney秩和檢驗，正態(tài)分布資料以±s表示，偏態(tài)分布資料以“中位數(shù)和四分位數(shù)間距”表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5及BV對小鼠氣道炎癥的影響小鼠氣管黏膜HE染色如圖1所示，與對照組相比，PM2.5和BV干預(yù)組氣管黏膜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤明顯增加，且BV干預(yù)組炎癥細胞浸潤輕于PM2.5暴露組，淋巴細胞數(shù)明顯少于PM2.5暴露組。

圖1 各組小鼠氣管HE染色（×400）Fig.1 HE staining of trachea of mice in each group（×400）

2.2 PM2.5及BV對小鼠血清細胞因子表達的影響ELISA檢測血清中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17和IL-33水平，如表1所示，PM2.5暴露組小鼠IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-33水平較對照組顯著升高（P<0.05），IL-10水平顯著降低（P<0.05）；IFN-γ與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.134）。BV干預(yù)組小鼠IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-33水平較PM2.5組降低（P<0.05）；BV干預(yù)組IL-10水平較PM2.5組顯著升高（P=0.012），BV干預(yù)組IFN-γ水平與PM2.5組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.353）。

表1 各組小鼠血清中細胞因子表達（±s，pg/ml）Tab.1 Cytokine expressions in serum of mice in each group（±s，pg/ml）

表1 各組小鼠血清中細胞因子表達（±s，pg/ml）Tab.1 Cytokine expressions in serum of mice in each group（±s，pg/ml）

Note：1）P<0.05 vs control；2）P<0.05 vs PM2.5.

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2.3 PM2.5及BV對小鼠肺組織中AhR表達的影響檢測小鼠肺組織AhR mRNA和蛋白表達，PM2.5暴露組AhR mRNA表達（1.861 2±0.086 2）較對照組（1.115 0±0.070 9）顯著增加（P<0.001），PM2.5暴露組AhR蛋白表達（0.890 2±0.092 8）較對照組（0.381 5±0.034 9）顯著增加（P=0.001）。BV干預(yù)組AhR mRNA和蛋白表達均較PM2.5暴露組顯著降低（P<0.001，圖2）。

圖2 各組小鼠肺組織AhR mRNA、蛋白表達Fig.2 Expressions of AhR mRNA and protein in lung tis?sue of mice in each group

3 討論

PM2.5是我國空氣污染的主要成分，其表面可吸附各種有毒物質(zhì)，與多種呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及代謝系統(tǒng)疾病有關(guān)。AhR是配體依賴的多功能轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞內(nèi)外環(huán)境變化檢測，最近研究發(fā)現(xiàn)，AhR可與環(huán)境毒物產(chǎn)生相互作用，影響機體免疫反應(yīng)［12］。BV目前已被證明可增強免疫反應(yīng)，對先天性免疫和后天性免疫應(yīng)答具有多種調(diào)節(jié)作用［13］。因此，本研究旨在從AhR信號通路激活致Th免疫失衡的角度，探討PM2.5暴露及BV治療對小鼠氣道炎癥的作用及機制。

OGINO等［21］研究提示，PM2.5暴露后小鼠出現(xiàn)相關(guān)氣道炎癥反應(yīng)和免疫紊亂，主要表現(xiàn)為顆粒物暴露后小鼠IL-4、IL-5和IL-13表達增強，而IL-4、IL-5和IL-13是過敏性氣道炎癥的重要募集因子，在介導(dǎo)Th1/Th2細胞免疫失衡中起重要作用。同時，Th17和Th2型免疫反應(yīng)上調(diào)在過敏性氣道炎癥病理生理過程中起重要作用，某些具有酶活性的變應(yīng)原可誘導(dǎo)上皮細胞產(chǎn)生細胞因子和趨化因子，從而促進Th2反應(yīng)。隨著輔助性T（Th）細胞新亞群（Th17細胞和Treg細胞）的發(fā)現(xiàn)，研究證實Th17細胞可調(diào)節(jié)Th2反應(yīng)和嗜酸性粒細胞活化等多個靶點，在氣道炎癥中發(fā)揮重要作用。本研究中PM2.5暴露后小鼠出現(xiàn)氣道黏膜炎癥細胞浸潤及Th細胞相關(guān)細胞因子失衡，包括Th17相關(guān)細胞因子IL-17和Th2相關(guān)細胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-33表達增加，提示Th17和Th2細胞介導(dǎo)的免疫平衡在PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥中起重要作用。

AhR作為一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，在樹突狀細胞（DC）表面高表達，可與環(huán)境中及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物結(jié)合，調(diào)節(jié)DC分化、成熟及功能，調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)。DC細胞是Th細胞網(wǎng)絡(luò)失衡促發(fā)細胞因子分泌失衡的核心“閥門”，是前所知功能最強的抗原提呈細胞（APC），是決定naive T細胞向Th1、Th2、Th17和Treg分化的細胞［22］。因此，AhR在調(diào)控細胞免疫平衡中可能發(fā)揮重要作用。同時，AhR對環(huán)境刺激敏感，已被證明是多環(huán)芳香烴、二噁英等環(huán)境有機污染物致癌、致畸的重要介導(dǎo)者和傳感器。本團隊研究表明，過敏性鼻炎中，AhR配體ITE（噻唑-4-羧酸甲酯AhR激動劑）可通過抑制Th17細胞分化及抑制IL-17產(chǎn)生顯著降低炎癥反應(yīng)［23］。AhR不僅可介導(dǎo)環(huán)境污染物毒性作用，還在炎癥、纖維化、腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、生長發(fā)育及維持生理穩(wěn)態(tài)等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。AhR信號通路是環(huán)境因素誘導(dǎo)機體疾病的關(guān)鍵機制之一，本研究在PM2.5暴露小鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)AhR mRNA和蛋白表達顯著增加且血清中Th細胞相關(guān)細胞因子失衡，因此推測AhR在PM2.5暴露和炎癥性氣道疾病間起橋梁作用，PM2.5可通過激活A(yù)hR信號通路誘導(dǎo)氣道炎癥和介導(dǎo)Th1/Th2和Th17/Treg免疫失衡。

BV目前已用于復(fù)發(fā)性呼吸道感染、哮喘、COPD、慢性支氣管炎、過敏性鼻炎、鼻竇炎等其他呼吸系統(tǒng)疾病治療，在黏膜相關(guān)淋巴組織內(nèi)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。哮喘小鼠模型中，口服BV有利于調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，減輕小鼠哮喘模型氣道炎癥，有效預(yù)防支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展［24］。此外，口服BV可增加氣道黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg含量，并減弱氣道高反應(yīng)性［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥BV干預(yù)，IL-17表達顯著減少，IL-10表達顯著增多，AhR表達顯著下調(diào)，提示BV可能通過AhR相關(guān)通路調(diào)節(jié)Th細胞間免疫平衡，有望成為PM2.5相關(guān)氣道炎癥性疾病治療的新靶點。

綜上所述，城市交通相關(guān)PM2.5可誘導(dǎo)正常健康小鼠氣道炎癥及血清中Th相關(guān)細胞因子失衡，且PM2.5可能通過AhR信號通路參與氣道炎癥發(fā)生發(fā)展，而BV可通過AhR信號通路調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)減輕PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥，為PM2.5相關(guān)氣道炎癥疾病治療提供新靶點。