金曌 王飛 蘇慧 張峻 殷翹（武漢市第一醫(yī)院皮膚科，武漢430022）

銀屑病是一種全身炎癥性疾病，由環(huán)境刺激引發(fā)皮膚細(xì)胞、免疫細(xì)胞和多種生物信號(hào)分子遺傳程序化的病理相互作用［1］。1型（Th1）和17型（Th17）T輔助細(xì)胞由皮膚中抗原呈遞細(xì)胞分泌的IL-12和IL-23激活，通過(guò)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等多種細(xì)胞因子引發(fā)慢性炎癥，并改變皮膚表皮增生、分化、凋亡和新血管生成情況，從而導(dǎo)致銀屑病皮損［2］。研究顯示，微生物菌群改變可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)改變，從而誘發(fā)炎癥性疾?。?］。于堯等［4］發(fā)現(xiàn)，腸道菌群變化與皮膚炎癥存在相關(guān)性。王麗瑋等［5］研究指出，銀屑病患者存在腸道菌群改變，銀屑病發(fā)生與腸道菌群紊亂緊密相關(guān)。咪喹莫特是一種應(yīng)用廣泛的銀屑病動(dòng)物模型誘導(dǎo)劑，可激活免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)銀屑病皮損［6］。青霉素在感染性疾病治療中療效顯著，臨床研究顯示青霉素對(duì)銀屑病患者具有明確治療效果［7-8］。但青霉素對(duì)銀屑病作用的具體機(jī)制鮮有報(bào)道，故本研究以咪喹莫特誘導(dǎo)構(gòu)建銀屑病小鼠模型，探討青霉素對(duì)銀屑病的可能作用機(jī)制，為闡明銀屑病發(fā)病機(jī)制及提出新的治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料24只4~6周齡雌性BALB/c小鼠，體重20~25 g，無(wú)菌飼養(yǎng)于特定溫度和濕度，剃光所有小鼠背部毛發(fā)，在醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料和水，標(biāo)準(zhǔn)飼料蛋白、碳水化合物和脂肪占熱量攝入量的20%、70%和10%。實(shí)驗(yàn)按照《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。青霉素（華北制藥股份有限公司）；咪喹莫特軟膏（美國(guó)3M醫(yī)藥用品有限公司）；凡士林軟膏（廣州白云醫(yī)藥有限公司）；4%多聚甲醛（上海索寶生物科技有限公司）；蘇木精和伊紅染液（南京建成生物工程研究所）；ELISA試劑盒（美國(guó)cusabio公司）；糞便采樣盒（南京阿森泰科生物技術(shù)有限公司）；革蘭氏染色試劑盒（上海索寶生物科技有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理小鼠腹腔注射80 mg/kg戊巴比妥鈉，電動(dòng)剃須刀剔除其背部毛發(fā)，露出面積約2 cm×3 cm，隨機(jī)分為青霉素組（備皮后外涂5%咪喹莫特軟膏8 d誘導(dǎo)銀屑病模型，腹腔注射0.1 ml青霉素，初始劑量20 mg/ml，100 mg/kg，連續(xù)7 d）、模型組（備皮后外涂5%咪喹莫特軟膏8 d誘導(dǎo)銀屑病模型，腹腔注射0.1 ml生理鹽水至實(shí)驗(yàn)結(jié)束）和對(duì)照組（備皮后外涂凡士林軟膏8 d，腹腔注射等量生理鹽水至實(shí)驗(yàn)結(jié)束），每組8只。

1.2.2 皮損嚴(yán)重程度評(píng)分第1、2、4、7天，采用皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（psoriasis area and severity index，PASI）評(píng)價(jià)小鼠背部皮損嚴(yán)重程度，紅斑、鱗片和浸潤(rùn)情況評(píng)分，0分：無(wú)；1分：輕微；2分：中度；3分：嚴(yán)重；4分：非常嚴(yán)重。所有評(píng)分均由2名人員獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估，累積評(píng)分（紅斑+鱗屑+浸潤(rùn)）反映炎癥嚴(yán)重程度（0~12級(jí)）［9］。

1.2.3 組織病理學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，切除背部剃毛皮膚，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋24~36 h，切片（4μm），HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 血清免疫細(xì)胞因子水平檢測(cè)第7天采集3組小鼠血漿，室溫下10 000 r/min離心5 min，去上清，分離淋巴細(xì)胞，400 r/min離心20 min，收集第2層淋巴細(xì)胞，PBS稀釋?zhuān)?jì)數(shù)；每管加入2×106個(gè)細(xì)胞，加入熒光抗體冰上孵育20 min，PBS清洗2遍，離心，PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)血清CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）陽(yáng)性細(xì)胞百分比（%）。

1.2.5 血清炎癥細(xì)胞因子水平檢測(cè)血清收集同1.2.4，采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23水平。

1.2.6 腸道菌群檢測(cè)第7天收集3組小鼠糞便，一部分用于乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及腸桿菌檢測(cè)，將稀釋后的標(biāo)本接種至培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，采用革蘭氏染色試劑盒進(jìn)行菌種涂片染色鑒定，根據(jù)革蘭氏染色和細(xì)菌形態(tài)特征判斷目的菌：乳酸桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，多數(shù)菌種菌體較大，為直行或微彎行；雙歧桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體長(zhǎng)短、形態(tài)不一，多有分叉；腸球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌種菌體為圓形或橢圓形；腸桿菌為革蘭氏陰性菌，中等大小，端圓，長(zhǎng)短不一。計(jì)算菌落數(shù)，CFU/g=菌落數(shù)×稀釋濃度×100，結(jié)果以對(duì)數(shù)形式表示。剩余小鼠糞便標(biāo)本用于微生物16s rRNA測(cè)序，由上海生工公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BALB/c小鼠皮損變化情況對(duì)照組小鼠背部皮膚無(wú)明顯變化；模型組小鼠第2天起背部皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗片和浸潤(rùn)，并逐漸明顯，第7天皮膚表現(xiàn)與人斑塊型銀屑病相似，病理可見(jiàn)皮膚明顯角化、棘突及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。青霉素組小鼠背部皮膚可見(jiàn)少量紅斑和薄鱗片，無(wú)明顯浸潤(rùn)，皮膚病理變化明顯減輕。模型組小鼠第2、4、7天PASI評(píng)分明顯高于對(duì)照組（P<0.05），青霉素組第2、4、7天PASI評(píng)分明顯低于模型組（P<0.05，表1、圖1）。

圖1 各組小鼠第7天背部皮損情況、組織病理學(xué)染色情況及PASI評(píng)分（×400）Fig.1 Back skin lesions，histopathological staining at 7 d and PASI score of mice in each group（×400）

表1 各組小鼠PASI評(píng)分（±s，n=8，分）Tab.1 PASI score of mice in each group（±s，n=8，score）

表1 各組小鼠PASI評(píng)分（±s，n=8，分）Tab.1 PASI score of mice in each group（±s，n=8，score）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

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2.2 各組小鼠血清免疫細(xì)胞因子水平模型組小鼠CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分比明顯低于對(duì)照組（P<0.05），CD11c+DCs百分比明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；青霉素組CD4+T細(xì)胞百分比明顯高于模型組（P<0.05），CD11c+DCs百分比明顯低于模型組（P<0.05），CD8+T細(xì)胞百分比與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2）。

圖2 各組小鼠免疫細(xì)胞因子水平Fig.2 Immune cytokines levels of mice in each group

2.3 各組小鼠血清炎癥細(xì)胞因子水平模型組小鼠IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；青霉素組IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23水平明顯低于模型組（P<0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠血清炎癥細(xì)胞因子水平Fig.3 Serum inflammatory cytokines levels of mice in each group

2.4 各組小鼠腸道菌群數(shù)比較模型組小鼠乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及腸桿菌數(shù)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；青霉素組乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)明顯少于模型組（P<0.05），腸球菌、腸桿菌數(shù)明顯多于模型組（P<0.05，圖4）。

圖4 各組小鼠腸道菌群數(shù)Fig.4 Intestinal flora quantity of mice in each group

2.5 各組小鼠腸道菌群OTU數(shù)及多樣性比較模型組小鼠OTU、Chao1、ACE、Shannon及Simpson值與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；青霉素組OTU、Chao1、ACE、Shannon值明顯低于模型組（P<0.05），Simpson值明顯高于模型組（P<0.05，表2）。

表2 各組小鼠腸道菌群OTU數(shù)及多樣性比較（±s，n=8）Tab.2 OTU number and diversity of intestinal flora of mice in each group（±s，n=8）

表2 各組小鼠腸道菌群OTU數(shù)及多樣性比較（±s，n=8）Tab.2 OTU number and diversity of intestinal flora of mice in each group（±s，n=8）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

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2.6 各組小鼠腸道菌群門(mén)水平相對(duì)豐度比較模型組小鼠放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)及擬桿菌門(mén)比例與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；青霉素組放線菌門(mén)、變形菌門(mén)比例明顯高于模型組（P<0.05），厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)比例明顯低于模型組（P<0.05，表3、圖5）。

圖5 各組BALB/c小鼠腸道菌群門(mén)水平相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of intestinal flora phylum level of BALB/c mice in each group

表3 各組小鼠腸道菌群門(mén)水平相對(duì)豐度比較（±s，n=8，%）Tab.3 Comparison of relative abundance of intestinal flora phylum level of mice in each group（±s，n=8，%）

表3 各組小鼠腸道菌群門(mén)水平相對(duì)豐度比較（±s，n=8，%）Tab.3 Comparison of relative abundance of intestinal flora phylum level of mice in each group（±s，n=8，%）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

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2.7 各組小鼠腸道菌群細(xì)菌屬比例比較模型組與對(duì)照組小鼠副擬桿菌屬、糞芽孢菌屬相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；青霉素組副擬桿菌屬、糞芽孢菌屬比例明顯高于模型組（P<0.05，圖6）。

圖6 各組小鼠腸道菌群細(xì)菌屬比例Fig.6 Proportions of intestinal flora bacterial genera of mice in each group

3 討論

銀屑病是一種病因不明的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病是遺傳、環(huán)境和免疫學(xué)因素共同作用的結(jié)果［10］。最新研究表明，免疫細(xì)胞（尤其是T細(xì)胞、DCs）與角質(zhì)形成細(xì)胞在推動(dòng)炎癥過(guò)程中起重要作用，且這些炎癥過(guò)程參與銀屑病發(fā)展［11］。目前研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞在人銀屑病皮損過(guò)程中明顯增多［12］。T細(xì)胞激活的細(xì)胞因子信號(hào)通路是銀屑病炎癥反應(yīng)的重要組成部分［13］。IL-23/IL-17軸失調(diào)參與以及其他炎癥細(xì)胞因子（如IL-1、IL-36和IL-22）過(guò)量產(chǎn)生在人類(lèi)銀屑病發(fā)病途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用［14］。既往研究表明，長(zhǎng)時(shí)間（5~7 d）采用TLR7激動(dòng)劑咪喹莫特可誘發(fā)銀屑病樣皮膚炎癥［15-16］。研究顯示，咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣炎癥明顯可反映人類(lèi)斑塊型銀屑病特點(diǎn)，包括皮膚紅斑和鱗屑形成、表皮增厚、角質(zhì)形成細(xì)胞分化改變、新血管生成和免疫細(xì)胞皮膚浸潤(rùn)［17］。本研究采用咪喹莫特成功誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型。

青霉素是治療感染性疾病的抗生素，研究證明，青霉素可用于銀屑病治療，且患者耐受性良好［18-20］。但青霉素對(duì)銀屑病的治療作用機(jī)制尚未闡明。本研究采用青霉素局部治療，可明顯減輕咪喹莫特誘導(dǎo)的BALB/c小鼠炎癥反應(yīng)，顯著降低PASI評(píng)分，表明青霉素治療銀屑病可能通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用。銀屑病是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性免疫性皮膚病［21］。本研究顯示，與對(duì)照組相比，模型組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分比明顯低于對(duì)照組，CD11c+DCs百分比明顯高于對(duì)照組，與模型組相比，青霉素組CD4+T細(xì)胞百分比明顯高于模型組，CD11c+DCs百分比明顯低于模型組，表明青霉素可能通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞及CD11c+DCs調(diào)節(jié)銀屑病樣小鼠免疫功能。雖然CD8+T細(xì)胞是銀屑病的重要參與者，但本研究中CD8+T細(xì)胞百分比無(wú)明顯變化，可能與小鼠銀屑病致病機(jī)理與人銀屑病致病機(jī)理不同有關(guān)。

近年研究指出，微生物群在多種生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其受環(huán)境和飲食因素影響，可維持效應(yīng)T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡以及誘導(dǎo)免疫球蛋白A釋放，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答［22］。此外，微生物群除對(duì)胃腸道有影響，還可影響其他器官和組織，腸道菌群失調(diào)在部分情況下與皮膚慢性炎癥性疾?。ㄈ玢y屑病）有關(guān)［23］。抗生素治療可在短時(shí)間內(nèi)改變腸道菌群組成，降低其腸道菌群多樣性［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組和對(duì)照組腸道菌群數(shù)無(wú)明顯差異，而青霉素組乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)明顯少于模型組，腸球菌、腸桿菌數(shù)明顯多于模型組，表明青霉素可改變銀屑病小鼠腸道菌群組成，增強(qiáng)其免疫功能。OTU代表物種豐富度，Chao1、ACE均代表物種總數(shù)，Shannon、Simpson代表菌群多樣性，Shannon越高，Simpson越低，菌群多樣性越高。進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果顯示，青霉素組OTU、Chao1、ACE、Shannon值明顯低于模型組，Simpson值明顯高于模型組，且青霉素組放線菌門(mén)、變形菌門(mén)比例明顯高于模型組，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)比例明顯低于模型組，另外，副擬桿菌屬、糞芽孢菌屬比例明顯高于模型組，表明腹腔注射青霉素治療，銀屑病小鼠腸道菌群明顯改變，生物多樣性明顯降低。HUANG等［25］研究指出，阿奇霉素可通過(guò)減少溶酶體酸化及破壞TLR成熟和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的DCs激活，并對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣炎癥具有明顯改善作用，可能是治療銀屑病的潛在藥物。另一項(xiàng)研究指出，IL-17抑制劑和IL-12/23抑制劑可改善銀屑病患者腸道微生物群組成［26］。因此，青霉素可能通過(guò)降低生物多樣性調(diào)節(jié)腸道免疫，從而改善免疫耐受與炎癥平衡，最終促進(jìn)疾病轉(zhuǎn)歸，但尚缺乏更多證據(jù)支持，尤其是青霉素的用藥方式是否影響其對(duì)腸道菌群的作用有待進(jìn)一步研究，后續(xù)還需進(jìn)行更多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為探索青霉素治療銀屑病的可能分子機(jī)制提供更多有價(jià)值的參考。

綜上所述，青霉素可通過(guò)改變腸道菌群組成降低腸道微生物多樣性，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞因子及相關(guān)因子表達(dá)，減輕銀屑病小鼠皮膚炎癥，從而改善皮損狀況，有助于進(jìn)一步闡明銀屑病發(fā)病機(jī)理，為銀屑病治療提供新參考。