羅連響 黃芳芳 吳銳劍 黃宇戈（廣東醫(yī)科大學(xué)海洋醫(yī)藥研究院，湛江524023）

Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體是由天然免疫感受器NLRP3、接頭蛋白ASC和caspase-1前體組成的多聚蛋白復(fù)合物，其組裝可導(dǎo)致caspase-1的激活，活化的caspase-1隨后促進(jìn)IL-1β前體和IL-18前體裂解，從而產(chǎn)生成熟的、有功能的IL-1β和IL-18［1-3］。研究表明，NLRP3炎癥小體可被包括危險(xiǎn)相關(guān)分子模式（DAMPs）和病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）在內(nèi)的多種不同刺激所激活，并且這些刺激可能通過(guò)ROS產(chǎn)生、離子通量和溶酶體損傷三個(gè)過(guò)程激活NLRP3炎癥小體，但具體機(jī)制仍未明確［1］。目前，NLRP3炎癥小體已被報(bào)道與多種自身炎癥和自身免疫性疾病有關(guān)，包括痛風(fēng)、2型糖尿病、肥胖、骨關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化以及多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾?。?-11］。因此，尋找靶向NLRP3炎癥小體的抑制劑，可能是治療NL?RP3炎癥小體相關(guān)疾病的較好選擇。

楊梅素是一種常見(jiàn)的植物類(lèi)黃酮，廣泛存在于各種水果和蔬菜中，并具有多種重要的藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗癌以及鎮(zhèn)痛等［12-14］。目前，已有研究表明楊梅素能抑制NF-κB的激活和促炎細(xì)胞因子IL-1β的分泌［15-16］。這些發(fā)現(xiàn)促使我們研究楊梅素調(diào)控NLRP3炎癥小體激活的可能機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)楊梅素可抑制NLRP3炎癥小體的組裝以及調(diào)節(jié)線粒體ROS產(chǎn)生，并通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制NLRP3炎癥小體激活。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)楊梅素是治療NLRP3驅(qū)動(dòng)的疾病的一種潛在抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料THP-1細(xì)胞購(gòu)自American Type Culture Collection（ATCC）；iBMDM細(xì)胞由北京生命科學(xué)研究所邵峰院士贈(zèng)送；楊梅素購(gòu)自MedChemExpress；1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和0.25%Trypsin-EDTA（1×）購(gòu)自Gibco；抗IL-1β（p17）抗體、抗caspase-1抗體、抗NLRP3抗體、抗LC3抗體、抗AMPK抗體、抗P-AMPK抗體、抗mTOR抗體、抗P-mTOR抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology（CST）；抗SQSTM1/p62抗體、抗Beclin-1抗體購(gòu)自Abcam；DAPI、活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；Mito?ROSTM580購(gòu)自AAT Bioquest。二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)FORMA STERI-CYCLE i160）購(gòu)自美國(guó)Thermo Electron公司；超凈工作臺(tái)（型號(hào)SW-CJ-2D）購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；流式細(xì)胞儀（型號(hào)EPICS XLMCL）購(gòu)自美國(guó)BECKMAN COULTER公司；超分辨激光掃描共聚焦熒光顯微鏡（型號(hào)FV3000）購(gòu)自日本Olympus公司；化學(xué)發(fā)光成像儀（型號(hào)GelView 6000M）購(gòu)自廣州博鷺騰儀器儀表有限公司；微孔板分光光度計(jì)（型號(hào)EPOCH）購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及刺激iBMDM細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。THP-1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%青霉 素/鏈霉素的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

為誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化，將5×105個(gè)/ml iBMDM細(xì)胞和5×105個(gè)/ml THP-1細(xì)胞分別接種于12孔板中，過(guò)夜。第2天將每孔更換為500 μl含250 ng/ml LPS的培養(yǎng)基，并處理細(xì)胞4 h，4 h后加入楊梅素刺激30 min，最后用Nigericin（10μmol/L）刺激細(xì)胞30 min，以誘導(dǎo)典型的NLRP3炎癥小體活化。THP-1細(xì)胞在用LPS刺激前需先用50 nmol/L PMA誘導(dǎo)分化3 h。

刺激結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清至1.5 ml EP管中，并將上清中的蛋白通過(guò)甲醇氯仿的方法抽提出來(lái)：首先將上清12 000 r/min離心5 min去除死細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至新的離心管中，每個(gè)離心管中加入等體積的甲醇和四分之一體積的氯仿，渦旋混勻，12 000 r/min室溫離心5 min。離心后的液體會(huì)分為3層，中間一層為蛋白層，將上層液體去掉，再加入等體積的甲醇，混勻后離心5 min，盡可能棄盡上清。然后55℃金屬浴干燥5 min。最后加入35μl 2×SDS上樣緩沖液，100℃金屬浴10 min。培養(yǎng)板上的細(xì)胞則加入40μl RIPA裂解液裂解10 min，12 000 r/min、4℃離心10 min，然后將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，最后加入10μl 5×SDS上樣緩沖液，100℃金屬浴5 min。

1.2.2 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平將收集的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，置于轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后分別孵育一抗抗體，4℃孵育過(guò)夜。第2天洗膜后加入稀釋?zhuān)?∶4 000）的二抗，室溫孵育1 h。二抗孵育完成后，顯影儀顯影。

1.2.3 免疫熒光法檢測(cè)ASC斑點(diǎn)形成提前1天將iBMDM細(xì)胞鋪于6孔板，在鋪細(xì)胞之前將無(wú)菌的方形蓋玻片放入6孔板。第2天進(jìn)行NLRP3炎癥小體活化刺激，收樣時(shí)吸掉培養(yǎng)基，用PBS洗3次，然后加入4%多聚甲醛（PFA）室溫固定20 min。棄掉PFA，PBS室溫浸洗3次，每次5 min。然后加500μl 0.5%Triton X-100（PBS配制）室溫破膜15 min，再用PBS浸洗3次，每次5 min。之后用山羊血清封閉0.5 h。去除封閉液后加入PBS浸洗3次，每次5 min。加入相應(yīng)的一抗稀釋液（5%BSA稀釋1∶300），靜置于4℃冰箱過(guò)夜。第2天回收一抗，加入PBS浸洗3次，每次5 min。然后加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗稀釋液（PBS稀釋1∶1 000）室溫避光1 h。再用PBS避光清洗3次，每次5 min。接著加入DAPI染色液（PBS稀釋1∶2 000）室溫避光10 min。去除DAPI并加入PBS避光清洗3次，每次5 min。最后，準(zhǔn)備好載玻片，并于每個(gè)樣品處加50μl抗淬滅封片液，將玻片倒扣于之封片液上，4℃避光保存。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，并拍照記錄結(jié)果。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體ROS的產(chǎn)生熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的形成。iBMDM以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在12孔板中。第2天進(jìn)行NLRP3炎癥小體活化刺激后，將細(xì)胞與終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA在37℃孵育30 min。最后用PBS清洗細(xì)胞，重懸細(xì)胞后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

熒光探針MitoROSTM580檢測(cè)線粒體ROS（mtROS）的形成。THP-1細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在12孔板中。進(jìn)行NLRP3炎癥小體活化刺激后，將細(xì)胞與1×MitoROSTM580在37℃孵育30 min。最后用PBS清洗細(xì)胞，重懸細(xì)胞后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為540 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用GraphPad Prism 8.3.0軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)信息。所有數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用雙尾t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 楊梅素阻斷THP-1細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活為了確定楊梅素（圖1A）能否抑制NLRP3炎癥小體活化，用Nigericin誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化，并觀察楊梅素對(duì)NLRP3炎癥小體活化導(dǎo)致的IL-1β（p17）分泌的影響。結(jié)果顯示，楊梅素能夠劑量依賴抑制培養(yǎng)上清液中IL-1β的分泌，而不影響細(xì)胞裂解物中的前體蛋白pro-IL-1β、pro-caspase-1和NL?RP3的表達(dá)（圖1B）。

圖1 楊梅素阻斷THP-1細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活Fig.1 Myricetin blocks activation of NLRP3 inflamma?some in THP-1 cells

2.2 楊梅素抑制ASC斑點(diǎn)形成在NLRP3炎癥小體激活過(guò)程中伴隨著ASC斑點(diǎn)的形成，其是cas?pase-1激活和IL-1β分泌的關(guān)鍵事件［17-18］。為了解楊梅素是否可以減少ASC斑點(diǎn)的形成，本研究用免疫熒光法進(jìn)行了檢測(cè)。與楊梅素對(duì)IL-1β分泌的抑制作用一致，楊梅素顯著降低了Nigericin誘導(dǎo)的ASC斑點(diǎn)形成（圖2）。LPS和Nigericin處理后，iBM?DM細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)ASC齊聚，呈斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)（圖2，第3列），而楊梅素處理顯著減少了Nigericin誘導(dǎo)的ASC斑點(diǎn)的形成（圖2，第4列），表明楊梅素處理抑制了NLRP3炎癥小體的組裝。

圖2 免疫熒光法檢測(cè)ASC斑點(diǎn)形成Fig.2 Detection of ASC speck by immunofluorescence

2.3 楊梅素通過(guò)抑制ROS和mtROS的產(chǎn)生抑制NLRP3炎癥小體的激活一些細(xì)胞事件被認(rèn)為是NLRP3炎癥小體激活的上游事件，包括ROS和mtROS的產(chǎn)生［19］。為了確定楊梅素是否通過(guò)影響ROS以及mtROS產(chǎn)生從而影響NLRP3炎癥小體活化，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，楊梅素處理可抑制iBMDM細(xì)胞內(nèi)ROS以及THP-1細(xì)胞中mtROS的產(chǎn)生（圖3），表明楊梅素可通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體激活的上游事件中ROS和mtROS的產(chǎn)生從而影響NLRP3炎癥小體活化。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS和mtROS的形成Fig.3 Detection of ROS and mtROS formation by flow cy?tometry

2.4 楊梅素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制NLRP3炎癥小體的激活為了探索楊梅素抑制NLRP3炎癥小體激活和ROS產(chǎn)生的機(jī)制，本研究對(duì)參與清除ROS的信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)楊梅素處理增加了THP-1細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、P62、Beclin-1的產(chǎn)生，而不影響AMPK和mTOR的磷酸化（圖4）。LC3Ⅱ是自噬發(fā)生的標(biāo)志［20］，因此，本研究結(jié)果表明楊梅素可通過(guò)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞自噬抑制NLRP3炎癥小體的激活。

圖4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞裂解物中AMPK、P-AMPK、mTOR、P-mTOR、P62、Beclin-1和LC3的表達(dá)Fig.4 Western blot was used to detect expressions of AMPK，P-AMPK，mTOR，P-mTOR，P62，Beclin-1 and LC3 in cell lysates

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)楊梅素是一種NLRP3炎癥小體激活抑制劑，在人和小鼠的巨噬細(xì)胞中都具有顯著的抗炎活性，可抑制NLRP3炎癥小體的組裝以及ROS的產(chǎn)生，并通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來(lái)抑制NLRP3炎癥小體的激活（圖5）。此外，楊梅素是一種常見(jiàn)的植物類(lèi)黃酮，是蔬菜、茶和水果等多種人類(lèi)食物的關(guān)鍵成分之一，具有較高的安全性［12］。因此，本研究結(jié)果揭示了楊梅素作為潛在的抑制劑用于治療NL?RP3炎癥性疾病的新用途。

圖5 楊梅素抑制NLRP3炎癥小體激活示意圖Fig.5 Schematic diagram illustrates inhibitory effect of Myricetin on NLRP3 inflammasome activation

NLRP3炎癥小體的活化需要兩個(gè)不可或缺的信號(hào)。第一個(gè)信號(hào)（也稱為啟動(dòng)信號(hào)）通過(guò)激活NFκB通路誘導(dǎo)pro-IL-1β的表達(dá)［21］，第二個(gè)信號(hào)觸發(fā)NLRP3炎癥小體組裝，導(dǎo)致caspase-1的激活和隨后的IL-1β成熟［22］。目前，研究已表明楊梅素主要基于對(duì)NF-κB通路的抑制作用來(lái)發(fā)揮抗炎活性［15-16］，該通路可被第一個(gè)信號(hào)所激活。然而，本研究結(jié)果表明，抑制NLRP3炎癥小體的激活對(duì)楊梅素發(fā)揮抗炎活性也起著重要作用。ASC寡聚在NLRP3炎癥小體激活過(guò)程中是必不可少的，而楊梅素可通過(guò)抑制ASC寡聚從而影響NLRP3炎癥小體的組裝和激活。

先前的研究表明，楊梅素是一種強(qiáng)效的抗氧化劑，而ROS的產(chǎn)生是最早發(fā)現(xiàn)的NLRP3炎癥小體激活的共同信號(hào)通路之一［12，23］。因此，本研究重點(diǎn)研究了楊梅素是否通過(guò)調(diào)控ROS的產(chǎn)生來(lái)影響NL?RP3炎癥小體激活。結(jié)果表明，楊梅素可抑制ROS的產(chǎn)生從而抑制NLRP3炎癥小體活化。線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源，各種應(yīng)激條件，包括代謝率增加、缺氧或膜損傷，均可顯著誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生ROS［24］。因此，進(jìn)一步研究了楊梅素對(duì)mtROS生成的影響，發(fā)現(xiàn)楊梅素可通過(guò)抑制mtROS的產(chǎn)生抑制NLRP3炎癥小體激活。NAKAHIRA等［25］的研究也表明，LPS和ATP對(duì)caspase-1的激活取決于ROS和mtROS的生成。

炎癥小體是一種先天免疫結(jié)構(gòu)，主要在髓系細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）中被激活，并誘導(dǎo)依賴性細(xì)胞因子的產(chǎn)生以保護(hù)宿主免受微生物感染［26］。然而，炎癥小體經(jīng)常被宿主來(lái)源的刺激因子和環(huán)境刺激物錯(cuò)誤地激活，引起大量的炎癥因子釋放，從而導(dǎo)致炎癥性疾病的發(fā)展。自噬是細(xì)胞內(nèi)回收和清除受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器以及破壞細(xì)胞內(nèi)病原體的重要過(guò)程［27］。有研究表明，NLRP3炎癥小體的活性受到自噬的負(fù)調(diào)控，自噬可以通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活［25，28-29］。一方面，自噬可清除受損的細(xì)胞器，如線粒體，導(dǎo)致線粒體來(lái)源的DAMPs釋放減少，從而抑制炎癥小體激活［27］。另一方面，自噬可促進(jìn)炎癥小體成分的降解，從而抑制炎癥小體的激活［27］。而這一過(guò)程主要依賴于p62，在巨噬細(xì)胞中刺激NLRP3炎癥小體后，ASC被p62識(shí)別，NL?RP3炎癥小體組分（包括NLRP3和ASC）與自噬體共定位，表明NLRP3炎癥小體可以被自噬體吞噬和降解［30］。本研究發(fā)現(xiàn)楊梅素可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬從而抑制NLRP3炎癥小體的激活，但其具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

綜上，本研究結(jié)果證實(shí)了楊梅素對(duì)巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活的抑制作用，并且考慮到楊梅素在臨床上的高安全性和低成本，提示楊梅素具有治療NLRP3炎癥性疾病的潛力。