鐘甜 郭璐 蔣才玉 彭夏瑩 鄒俊

（四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，成都610072）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是臨床上常 見的具有高死亡率的急危重癥，其特征在于肺泡的彌漫性損傷，導致內(nèi)皮和肺泡上皮屏障破壞，從而導致微血管通透性升高，引發(fā)通透性肺水腫，嚴重階段發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征。嚴重的敗血癥、創(chuàng)傷、電擊和吸入有害氣體等多種因素都可能導致ALI［1］。盡管醫(yī)療技術和監(jiān)護技術逐步發(fā)展，ALI患者的死亡率仍然超過30%［2］。目前研究顯示，ALI的關鍵機制是過度的炎癥反應會損害肺泡和支氣管上皮細胞膜的完整性，從而影響其基本功能［3］。革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分脂多糖（lipopolysac?charide，LPS）被認為是ALI的主要致病因素［4］。當LPS刺激后，包括TNF-α、IL-6和IL-1β在內(nèi)的關鍵炎癥細胞因子被大量釋放促進ALI的進展［5-6］。李金河等［7］通過生物信息學手段篩選出ALI中差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)CXCL2基因在ALI后表達急劇上升，提示CXCL2基因可能在ALI中發(fā)揮重要作用。然而目前尚未報道關于CXCL2基因在ALI中的作用及機制，因此本實驗旨在探究CXCL2基因?qū)PS誘導的支氣管上皮細胞炎癥反應的影響，并初步探究其可能的機制，以期為ALI的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料人支氣管上皮細胞系16HBE購自中國科學院上海生命科學學院細胞庫；LPS、MTT檢測試劑、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；脂質(zhì)體Lipo?fectamine 2000購自美國Invitrogen公司；AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKa?Ra公司；預染蛋白Marker購自賽因百奧生物技術有限公司；SYBR Green PCR Master Mix購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；TNF-α、IL-6和IL-1β ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；CXCL2單抗、JAK2單抗、p-JAK2單抗、STAT3單抗、p-STAT3單抗購自美國CST公司；辣根過氧化酶標記的二抗購自美國Santa Cruz公司；CXCL2特異性siRNA和對照非特異性siRNA購自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人支氣管上皮細胞16HBE自液氮中取出，常規(guī)復蘇后接種到含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，加入終濃度為100 U/ml的青霉素-鏈霉素雙抗，輕輕混勻后將細胞培養(yǎng)瓶置于含5%CO2、100%飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組和處理將處于對數(shù)生長期的16HBE細胞接種至24孔板，接種密度為1×105個/孔，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)過夜培養(yǎng)，待細胞生長至約60%融合時，參照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000試劑使用說明書分別將CXCL2特異性siRNA和對照非特異性siRNA轉(zhuǎn)染至16HBE細胞，轉(zhuǎn)染48 h后添加50μg/ml的LPS干預16HBE細胞。實驗分為Control組（未行任何處理的16HBE細胞）、LPS組（添加50μg/ml LPS干預的16HBE細胞）、si-NC+LPS組（轉(zhuǎn)染非特異性siRNA后添加50 μg/ml LPS干預的16HBE細胞）和si-CXCL2+LPS組（轉(zhuǎn)染CXCL2特異性siRNA后添加50μg/ml LPS干預的16HBE細胞）。

1.2.3 qPCR檢測分別收集處理后的4組16HBE細胞，采用RNA提取試劑盒抽提細胞中的RNA，使用微量核酸測定儀檢測RNA樣品的純度和濃度，選擇合格的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA合成第1鏈cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒進行qPCR擴增，反應結(jié)束后獲得Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，采用相對定量2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達量。引物序列如下，CXCL2前引物：5'-TCCTCAATGCTG?TACTGGTCC-3'；后 引 物：5'-ATGTTCTTCCTTTC?CAGGTC-3'。GAPDH前引物：5'-ATTCTACCCACG?GCAAGTTCAATGG-3'；后 引 物：5'-AGGGGCGGA?GATGATGACCC-3'。

1.2.4 MTT實驗4組16HBE細胞分別接種至96孔板，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別在12 h、24 h和48 h時進行MTT實驗，即在各個時間點向每孔細胞中加入20μl MTT溶液（濃度為5 mg/ml），在37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，取出細胞培養(yǎng)板，吸去上清，向每孔細胞中加入150 μl DMSO溶液，振蕩至反應沉淀完全溶解。使用酶標儀測定每孔細胞的光密度值（OD），以OD值的大小反映16HBE細胞增殖活力的高低。

1.2.5 流式細胞術檢測將處于對數(shù)期的16HBE細胞接種至6孔板，分組處理后以胰蛋白酶消化細胞，收集細胞制成單細胞懸液，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，再加結(jié)合緩沖液300μl重懸細胞，向細胞懸液中依次加入AnnexinⅤ-FITC和PI染液各5μl，室溫下避光孵育15 min，向細胞懸液中添加結(jié)合緩沖液200μl，立即上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 ELISA檢測16HBE細胞分組處理后，分別收集各組細胞培養(yǎng)上清液，使用ELISA檢測試劑盒分別檢測TNF-α、IL-6和IL-1β含量，具體操作步驟嚴格參照ELISA檢測試劑盒使用說明書。

1.2.7 Western blot實驗分別收集處理后的4組16HBE細胞，加入細胞裂解液，冰上提取細胞總蛋白，對蛋白樣品進行定量測定，蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合，水浴加熱使蛋白質(zhì)變性。取等量蛋白樣品加入上樣孔，以SDS-PAGE電泳分離蛋白，蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜置于5%脫脂奶粉中封閉處理2 h，使用TBST洗膜3次，加入相應一抗（CXCL2一抗1∶800稀釋，JAK2一抗1∶500稀釋，p-JAK2一抗1∶500稀釋，STAT3一抗1∶500稀釋，p-STAT3一抗1∶500稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL化學發(fā)光試劑進行顯色反應，使用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，采用Image J軟件分析圖像，以β-actin標定計算目的蛋白相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 各組16HBE細胞中CXCL2 mRNA和蛋白表達水平比較qPCR和Western blot分析結(jié)果顯示，與Control組相比，LPS組16HBE細胞中CXCL2 mRNA和蛋白表達均明顯上調(diào)（P<0.05）；與LPS組相比，si-CXCL2+LPS組細胞中CXCL2 mRNA和蛋白表達均明顯下調(diào)（P<0.05），si-NC+LPS組中CXCL2 mRNA和蛋白的表達無明顯變化（P>0.05），見圖1、表1。

圖1 Western blot分析16HBE細胞中CXCL2蛋白表達水平Fig.1 Western blot analysis of CXCL2 protein expression level in 16HBE cells

表1 4組16HBE細胞中CXCL2 mRNA和蛋白表達水平比較（±s，n=9）Tab.1 Comparison of CXCL2 mRNA and protein expres?sion levels in 4 groups of 16HBE cells（±s，n=9）

表1 4組16HBE細胞中CXCL2 mRNA和蛋白表達水平比較（±s，n=9）Tab.1 Comparison of CXCL2 mRNA and protein expres?sion levels in 4 groups of 16HBE cells（±s，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05.

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2.2 各組16HBE細胞增殖活力比較MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，LPS組16HBE細胞在24 h和48 h的增殖活力均明顯降低（P<0.05）；與LPS組相比，si-CXCL2+LPS組細胞在24 h和48 h的增殖活力均明顯升高（P<0.05），si-NC+LPS組細胞在12 h、24 h、48 h的增殖活力均無明顯變化（P>0.05）。見表2。

表2 4組16HBE細胞增殖活力比較（±s，n=9）Tab.2 Comparison of proliferation activity of 16HBE cells in 4 groups（±s，n=9）

表2 4組16HBE細胞增殖活力比較（±s，n=9）Tab.2 Comparison of proliferation activity of 16HBE cells in 4 groups（±s，n=9）

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2.3 各組中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量比較ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，LPS組中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量明顯增多（P<0.05）；與LPS組相比，si-CXCL2+LPS組中TNFα、IL-6和IL-1β的含量明顯減少（P<0.05），si-NC+LPS組中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量無明顯變化（P>0.05）。如表3所示。

表3 4組TNF-α、IL-6和IL-1β的含量比較（±s，n=9，pg/ml）Tab.3 Comparison of contents of TNF-α，IL-6 and IL-1β in 4 groups（±s，n=9，pg/ml）

表3 4組TNF-α、IL-6和IL-1β的含量比較（±s，n=9，pg/ml）Tab.3 Comparison of contents of TNF-α，IL-6 and IL-1β in 4 groups（±s，n=9，pg/ml）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05.

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2.4 各組16HBE細胞凋亡率比較流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，LPS組16HBE細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與LPS組相比，si-CXCL2+LPS組細胞凋亡率明顯降低（P<0.05），si-NC+LPS組細胞凋亡率無明顯變化（P>0.05）。見圖2、表4。

表4 4組16HBE細胞凋亡率比較（±s）Tab.4 Comparison of apoptosis rate of 16HBE cells in 4 groups（±s）

表4 4組16HBE細胞凋亡率比較（±s）Tab.4 Comparison of apoptosis rate of 16HBE cells in 4 groups（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05.

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圖2 流式細胞術檢測16HBE細胞凋亡率Fig.2 Flow cytometry detection of 16HBE cell apoptosis rate

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05.

2.5 各組16HBE細胞中JAK2和STAT3磷酸化水平比較Western blot檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，LPS組16HBE細胞中JAK2和STAT3磷酸化水平明顯升高（P<0.05）；與LPS組相比，si-CXCL2+LPS組細胞中JAK2和STAT3磷酸化水平明顯降低（P<0.05），si-NC+LPS組細胞中JAK2和STAT3磷酸化水平無明顯變化（P>0.05）。且各組細胞中JAK2和STAT3的水平無明顯變化（P>0.05）。見圖3、表5。

表5 4組16HBE細胞中JAK2和STAT3磷酸化水平比較（±s，n=9）Tab.5 Comparison of JAK2 and STAT3 phosphorylation levels in 4 groups of 16HBE cells（±s，n=9）

表5 4組16HBE細胞中JAK2和STAT3磷酸化水平比較（±s，n=9）Tab.5 Comparison of JAK2 and STAT3 phosphorylation levels in 4 groups of 16HBE cells（±s，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05.

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圖3 Western blot檢 測16HBE細胞 中JAK2和STAT3磷酸化水平Fig.3 Western blot detection of JAK2 and STAT3 phos?phorylation levels in 16HBE cells

3 討論

ALI的特征是過度的炎癥反應和肺泡上皮-毛細血管屏障的破壞［8］。過度活化的內(nèi)皮細胞，上皮細胞和白細胞可能產(chǎn)生并釋放大量炎癥介質(zhì)，從而引發(fā)和加速繼發(fā)性炎癥反應［9］。當細菌侵入肺泡腔時，肺炎伴隨各種炎癥細胞因子誘導的炎癥，這些炎癥細胞因子由支氣管上皮細胞或肺泡巨噬細胞產(chǎn)生，以激活諸如中性粒細胞或淋巴細胞等炎癥細胞。該反應對于殺死細菌是有效的，同時通過嗜中性粒細胞或淋巴細胞從血管到感染部位的過度積累而引起組織損傷［10］。作為細菌外膜的重要組成部分，LPS誘導ALI，其特征是大量促炎細胞因子的過量生產(chǎn)［11-12］。因此本實驗采用LPS處理支氣管上皮細胞16HBE，結(jié)果顯示，LPS處理后16HBE細胞增殖活力明顯降低，細胞凋亡率升高，炎癥相關因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量明顯增多，提示已成功構(gòu)建LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥模型。CXCL2屬于CXC趨化因子家族成員之一，能夠與其受體CXCR2相互作用參與多種免疫調(diào)節(jié)反應［13］。有研究顯示，中性粒細胞通過CXCL2自我調(diào)節(jié)免疫復合物介導的皮膚炎癥［14］。MAN等［15］研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞中未修復的DNA損傷導致顆粒物誘導的氣道炎癥反應升高，其中CXCL2參與炎癥反應的增強。既往研究提示，CXCL2參與調(diào)節(jié)炎癥反應過程，然而其是否調(diào)控ALI目前尚未見相關報道。因此本實驗探究CXCL2對LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥反應的影響，并探究其作用機制。

本實驗qPCR和Western blot實驗結(jié)果顯示，LPS誘導的16HBE細胞中CXCL2 mRNA和蛋白表達均明顯上調(diào)，提示CXCL2基因可能參與ALI的發(fā)展，與既往研究相符。為探究CXCL2基因在ALI中的作用，本實驗通過轉(zhuǎn)染CXCL2特異性siRNA下調(diào)16HBE細胞中CXCL2的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默CXCL2能夠提高LPS誘導的16HBE細胞增殖活力，降低細胞凋亡率，減少炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放。以上實驗結(jié)果提示，沉默CXCL2基因能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥反應。JAK2/STAT3信號通路廣泛存在于機體組織，參與機體多種生理過程包括增殖、分化及免疫調(diào)節(jié)等過程［16-18］。多項研究顯示，JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路是調(diào)控炎癥反應的轉(zhuǎn)導途徑之一［19-20］。在ALI中，JAK2/STAT3信號通路異常激活，且大量炎癥因子的釋放能夠進一步活化JAK2/STAT3信號通路，加劇炎癥級聯(lián)反應［21］。本實驗Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS誘導的16HBE細胞中JAK2和STAT3磷酸化水平明顯升高，而沉默CXCL2基因能夠部分降低JAK2和STAT3的磷酸化水平。表明LPS能夠活化16HBE細胞中JAK2/STAT3信號通路，沉默CXCL2基因可抑制JAK2/STAT3信號通路的激活。

綜上，LPS能夠誘導支氣管上皮16HBE細胞炎癥反應，且LPS能夠上調(diào)16HBE細胞中CXCL2的表達，沉默CXCL2基因能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導的16HBE細胞炎癥反應，其作用機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路的激活有關。