祝曉麗 王晶 秦秀娟 姜輝 高雅晨 高家榮（安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，合肥230038）

慢性腎小球腎炎（chronic glomerulonephritis，CGN）以腎小球損害為主，表現(xiàn)為腎小球系膜細胞的異常增殖和炎癥反應［1］。微小RNA（miRNA）是一類內源性的、較?。〒碛?2~23個核苷酸）的非編碼RNA分子［2］。miRNA可影響細胞的多種生物學功能，如分化、新陳代謝、衰老、自噬、增殖和凋亡，因此，miRNA可能是引起CGN發(fā)病的一個重要潛在靶點［3-13］。本文采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導，建立CGN大鼠細胞增殖模型，發(fā)現(xiàn)通過下調miR-324-5p表達可促進細胞增殖及Syk/Ras/c-fos通路相關基因的表達，初步探討了CGN的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠腎小球系膜細胞（HBZY-1）購自武漢Procell公司；EZ-10 Total RNA Mini-Preps Kit購自上海生工生物工程股份有限公司；ABScripⅡRT Mix for qPCR with gDNA Remover和2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；ERK1/2購自美國Proteintech公司；MEK1/2和p-MEK1/2購自美國Cell Signaling Tech?nology公司；p-ERK1/2、Syk及Ras一抗購自美國Ab?cam公司；p-Syk和c-fos一抗購自北京Bioss公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將HBZY-1細胞接種于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，放于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞的增殖情況MTT法檢測取對數(shù)期的HBZY-1細胞消化得到細胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μl，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，無血清培養(yǎng)基同步細胞24 h，培養(yǎng)不同的時間（24 h、48 h、72 h）后每孔加入20μl MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，移去上清，各孔加入二甲基亞砜200μl，振蕩10 min溶解結晶物，用酶標儀測量各孔的光密度值（OD490nm）。

1.2.3 細胞凋亡情況流式細胞術檢測HBZY-1細胞用不含EDTA的胰酶消化后離心，用預冷的PBS洗2次，加入1×Annexin V結合液重懸細胞，向重懸液中加入5 μl Annexin V-FITC避光靜置孵育15 min，加入10 μl PI，混勻，室溫避光靜置孵育5 min，立即用流式細胞儀檢測。

1.2.4 Syk/Ras/c-fos信號軸相關基因mRNA的檢測提取總RNA，反轉錄成cDNA。以β-actin作為內參，采用熒光定量PCR方法檢測各組相關mRNA表達。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 免疫熒光實驗檢測Syk/Ras/c-fos信號軸相關蛋白表達HBZY-1細胞棄去培養(yǎng)基后接種于6孔板中，加常溫PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min后用4℃預冷的PBS洗3次，0.1%Triton-X孵育30 min，PBS漂洗3次后，0.5% BSA封閉，分別加一抗p-Syk（1∶100）、Ras（1∶250）、p-MEK1/2（1∶50）、p-ERK1/2（1∶50）及c-fos（1∶100）4℃孵育過夜。避光，加入以1∶200比例稀釋的二抗，室溫孵育1 h。PBS洗滌后，采用DAPI（1∶100）染核，封片劑進行封片，熒光顯微鏡觀察實驗結果。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS23.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，計量資料均以±s表示，組間比較用方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HBZY-1細胞中miR-324-5p表達水平通過RT-qPCR實驗，檢測不同組別中miR-324-5p的表達水平以及miR-324-5p-inhibitor的轉染效率。RT-qP?CR結果 如 圖1所 示，與Control組 相 比，LPS組 的miR-324-5p表達水平顯著降低，表明在LPS誘導的HBZY-1細胞中miR-324-5p表達下調。與轉染前LPS誘導細胞相比，LPS+inhibitor組的miR-324-5p表達水平顯著降低（P<0.01），LPS+inhibitor-NC組與LPS組相比，miR-324-5p在兩組中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。證明miR-324-5p-inhibitor轉入HBZY-1細胞中，并顯著抑制LPS誘導的細胞中miR-324-5p表達水平，inhibitor-NC轉染進入細胞不影響miR-324-5p的表達。

圖1 不同組別HBZY-1細胞中miR-324-5p的表達水平Fig.1 Expression levels of miR-324-5p in HBZY-1 cells of different groups

2.2 miR-324-5p對HBZY-1細胞增殖活性的影響HBZY-1細胞分別轉染miR-324-5p-inhibitor-NC質粒和miR-324-5p-inhibitor質粒，利用MTT法檢測在不同的時間（24 h、48 h、72 h），Control組、LPS組、LPS+inhibitor-NC組及LPS+inhibitor組的細胞增殖情況，如圖2所示，LPS組在490 nm下的吸收顯著高于Control組（P<0.01），表明LPS可誘導HBZY-1細胞增殖。轉染miR-324-5p-inhibitor質粒組的HBZY-1細胞相較于轉染miR-324-5p-inhibitor-NC質粒組的增殖更加明顯，表明抑制miR-324-5p表達能夠促進HBZY-1的增殖。

圖2 不同組別的HBZY-1細胞增殖活性Fig.2 Proliferative activity of HBZY-1 cells in different groups

2.3 miR-324-5p對HBZY-1細胞凋亡的影響

如圖3所示，miR-324-5p在LPS誘導的細胞增殖模型中低表達，LPS+inhibitor組與其他組相比，發(fā)現(xiàn)抑制miR-324-5p的表達可減少HBZY-1細胞的凋亡，提示調控miR-324-5p的表達水平可以作為CGN的治療和診斷的新手段和方向。

圖3 不同組別的HBZY-1細胞凋亡Fig.3 Apoptosis of HBZY-1 cells in different groups

2.4 各組HBZY-1細胞中Syk的表達結果如圖4所示，p-Syk以紅色為標識，表達主要在細胞質中，LPS+inhibitor組p-Syk蛋白表達顯著高于LPS組（P<0.05）。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，在LPS誘導CGN增殖模型中Syk表達顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，LPS+inhibitor組Syk的mRNA表達水平明顯升高（P<0.01），表明下調miR-324-5p表達可促進Syk表達。

圖4 Syk在各組HBZY-1細胞中表達Fig.4 Expression levels of Syk in HBZY-1 cells of differ?ent groups

2.5 各組HBZY-1細胞中Ras的表達結果如圖5所示，HBZY-1細胞中的Ras蛋白被染色，以紅色為標識，表達主要在細胞質中，LPS+inhibitor組Ras蛋白表達高于LPS組。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，在LPS誘導CGN增殖模型中Ras表達顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，LPS+inhibi?tor組Ras的mRNA表達水平明顯升高（P<0.01），表明下調miR-324-5p表達水平可促進Ras表達。

圖5 Ras在各組HBZY-1細胞中表達Fig.5 Expression levels of Ras in HBZY-1 cells of different groups

2.6 各組HBZY-1細胞中MEK1和MEK2的表達結果如圖6所示，HBZY-1細胞中的p-MEK1/2表達主要在細胞質中，LPS+inhibitor組p-MEK1/2蛋白表達高于LPS組。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，在LPS誘導CGN增殖模型中MEK1和MEK2表達顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，LPS+inhibitor組MEK1和MEK2的mRNA表 達 水 平明顯升高（P<0.01），表明下調miR-324-5p表達可促進MEK1和MEK2表達。

圖6 MEK1和MEK2在各組HBZY-1細胞中表達Fig.6 Expression levels of MEK1 and MEK2 in HBZY-1 cells of different groups

2.7 各組HBZY-1細胞中ERK1和ERK2的表達結果如圖7所示，HBZY-1細胞中的p-ERK1/2被染色，且表達主要在細胞質中，LPS+inhibitor組p-ERK1/2蛋白表達高于LPS組。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，在LPS誘導CGN增殖模型中ERK1和ERK2表達顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，LPS+inhibitor組ERK1和ERK2的mRNA表達水平明顯升高（P<0.01），表明下調miR-324-5p的表達水平可促進ERK1和ERK2表達。

圖7 ERK1和ERK2在各組HBZY-1細胞中表達Fig.7 Expression levels of ERK1 and ERK2 in HBZY-1 cells of different groups

2.8 各組HBZY-1細胞中c-fos的表達結果如圖8所示，HBZY-1細胞中的c-fos被染色，且表達主要在細胞質中，LPS+inhibitor組c-fos蛋白表達高于LPS組。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，在LPS誘導CGN增殖模型中c-fos表達顯著升高（P<0.01）。與LPS組 相 比，LPS+inhibitor組c-fos的mRNA表達水平明顯升高（P<0.01），表明下調miR-324-5p的表達可促進c-fos表達。

圖8 c-fos在各組HBZY-1細胞中表達Fig.8 Expression levels of c-fos in HBZY-1 cells of differ?ent groups

3 討論

腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cell，GMC）約占據(jù)腎小球細胞的三分之一，在腎小球生理功能和病理反應中均起著重要作用，其異常增殖是CGN的主要病理表現(xiàn)之一［14-15］。本文選取大鼠腎小球系膜HBZY-1細胞，通過LPS誘導，建立CGN增殖模型，發(fā)現(xiàn)轉染miR-324-5p-inhibitor能夠促進HBZY-1細胞增殖。

近年來，大量實驗表明miRNA與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關［16-17］。miRNA是能與mRNA的3'-UTR結合進而調控轉錄后調節(jié)基因的非編碼RNA分子，降低靶mRNA的穩(wěn)定性，影響mRNA的翻譯，在包括細胞增殖、侵襲和凋亡等的一系列重要生命過程中發(fā)揮作用［18］。目前，miR-324-5p的相關研究多集中在癌癥方面［19-20］，而在CGN中的作用尚未明確，因此，本文對CGN發(fā)病機制進行初步探索，研究CGN發(fā)病是否與miR-324-5p的異常表達有關。

Syk是一種72 kD的胞漿非受體蛋白酪氨酸激酶，屬于蛋白酪氨酸激酶（PTKs）家族的成員之一［21-22］。Ras是一種小細胞GTPases，曾被稱為細胞的“分子開關”，在多種細胞過程中發(fā)揮作用，如增殖、凋亡及腫瘤的發(fā)生等［23-24］。Syk最終通過鳥嘌呤核苷酸轉換蛋白激活Ras，將Ras-GDP轉化為Ras-GTP。磷酸化Ras將下游因子Raf招募到細胞膜上并激活Raf，Ras和Raf通過磷酸化兩個絲氨酸殘基的激活結構域激活MEK1和MEK2下游靶蛋白。ERK1/2是MEK1/2磷酸化的唯一下游蛋白靶點。被激活的ERK1/2從細胞質中轉移到細胞核，進而介導c-Jun和c-fos轉錄活化。課題組前期曾研究過芪藤消濁顆粒通過Syk/Ras/c-fos軸對CGN大鼠的影響［22］，但并未對從基因層面深入探究CGN發(fā)病機制。本研究通過檢測Syk/Ras/c-fos通路相關基因的mRNA表達水平發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p可以調控Syk、Ras、MEK1、MEK2、ERK1、ERK2及c-fos的mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)正向相關，證實了miR-324-5p下調可以促進Syk/Ras/c-fos通路相關的mRNA的表達。

綜上所述，體外研究實驗結果表明，miR-324-5p在LPS誘導的HBZY-1細胞中呈現(xiàn)低表達，抑制miR-324-5p表達可上調Syk/Ras/c-fos信號軸相關基因的表達，增強HBZY-1細胞的增殖能力，抑制HBZY-1細胞凋亡，證實CGN引起的GMC增殖可能與miR-324-5p表達下調激活Syk/Ras/c-fos信號軸有關。