劉洪良 周寒靜 周 麗 隆姝孜 萬 林 廖 奎 張 濤

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，重慶400016）

我國肺癌發(fā)病率和死亡率居世界首位，嚴(yán)重威脅人民的健康［1］。其中肺腺癌約占肺癌的40%，且絕大部分診斷時已為晚期［2-3］。放療是惡性腫瘤常用的治療方法，在晚期肺腺癌的治療中占據(jù)重要地位［4-5］。臨床中肺腺癌放化療療效較差，五年生存率僅為15%左右［1］。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤微環(huán)境中廣泛存在乏氧，而乏氧進(jìn)一步介導(dǎo)的放射抗拒是導(dǎo)致肺腺癌放療療效差的重要原因之一［6］。乏氧條件下腫瘤細(xì)胞中普遍存在HIF-1α和AngⅡ表達(dá)上調(diào)，其中HIF-1α 表達(dá)上調(diào)與放射抗拒密切相關(guān)，且AngⅡ與HIF-1α 表達(dá)正相關(guān)，AngⅡ可上調(diào) HIF-1α 表達(dá)［7-11］。因此，在增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性和提高腫瘤的放療療效的研究中，可以重點(diǎn)研究尋找能減弱AngⅡ效應(yīng)以下調(diào)乏氧條件下腫瘤細(xì)胞HIF-1α 表達(dá)水平的藥物。坎地沙坦是一種臨床中應(yīng)用廣泛且安全性良好的藥物，其主要用于治療高血壓和心血管等疾病，它能特異性阻斷AngⅡ與自身受體的結(jié)合而降低AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)，但坎地沙坦能否增加乏氧肺腺癌放射敏感性尚不明確。鑒于此，本研究探討坎地沙坦對乏氧條件下肺腺癌A549細(xì)胞放射敏感性的影響以及相關(guān)機(jī)制，旨在為提高肺腺癌的放療療效尋找新的易于臨床推廣的藥物。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分子腫瘤及表觀遺傳學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。胎牛血清、1640 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自BI 公司；CCK-8 試劑盒購自 Bimake 公司；坎地沙坦和AngⅡ購自Med Chem Express 公司；AngⅡ ELISA試劑盒購自基因美公司；兔抗人HIF-1α 單克隆抗體、兔抗人P53 單克隆抗體和兔抗人P21 單克隆抗體購自Abcam 公司；兔抗人GAPDH 單克隆抗體購自CST 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗購自萬類公司；ECL 發(fā)光液、全蛋白提取試劑盒、BCA 全蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司；直線加速器購自VARIAN Medical Systems 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌A549 細(xì)胞株在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。設(shè)置常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組。常氧組：37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；乏氧組：37℃、1%O2、94%N2、5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；坎地沙坦+乏氧組：添加坎地沙坦使其終濃度為1.6μmol/L 后置入37℃、1%O2、94%N2、5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 ELISA 檢測AngⅡ的表達(dá) 將常氧培養(yǎng)的肺腺癌A549 細(xì)胞接種至直徑10 cm 的培養(yǎng)皿，接種細(xì)胞密度為50 萬/皿。常氧培養(yǎng)細(xì)胞至70%~80%匯合狀態(tài)時更換培養(yǎng)液。然后設(shè)置常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組進(jìn)行對應(yīng)條件培養(yǎng)24 h。ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中AngⅡ的水平，按試劑盒說明書進(jìn)行AngⅡ檢測。

1.2.3 Western blot 檢測 HIF-1α、P53 和P21 蛋白表達(dá) 將常氧培養(yǎng)的肺腺癌A549 細(xì)胞接種至直徑10 cm的培養(yǎng)皿，接種細(xì)胞密度為50萬/皿。常氧培養(yǎng)細(xì)胞至70%~80%匯合狀態(tài)時更換培養(yǎng)液，然后設(shè)置4 個組，同時向4 個組中分別添加AngⅡ使其終濃度分別為 0 μmo/l L、0.1 μmo/l L、1 μmo/l L、10 μmo/l L，繼續(xù)常氧培養(yǎng)24 h 后提取蛋白。另外常氧培養(yǎng)細(xì)胞至70%~80%匯合狀態(tài)時更換培養(yǎng)液，然后設(shè)置常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組，向坎地沙坦+乏氧組添加坎地沙坦使其終濃度為1.6 μmo/l L。將各組分別進(jìn)行對應(yīng)條件培養(yǎng)24 h后提取蛋白。按照說明書進(jìn)行總蛋白提取，用BCA試劑盒測蛋白濃度。蛋白熱變性后進(jìn)行10%SDSPAGE 電泳，每孔蛋白上樣量為40 μg，以250 mA 為參數(shù)恒流轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。封閉后分別用相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次（10 min/次）。然后用二抗孵育1 h，TBST 洗膜3 次（10 min/次）。再用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，進(jìn)行發(fā)光成像。采用ImageJ 軟件分析條帶的灰度值，蛋白相對表達(dá)量的結(jié)果用目的條帶與組內(nèi)參照的灰度值比值表示。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 將常氧培養(yǎng)的肺腺癌A549 細(xì)胞接種至直徑10 cm 的培養(yǎng)皿，接種細(xì)胞密度為50 萬/皿。常氧培養(yǎng)細(xì)胞至70%~80%匯合狀態(tài)時更換培養(yǎng)液，設(shè)置常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組，向坎地沙坦+乏氧組添加坎地沙坦使其終濃度為1.6 μmo/l L。將各組分別進(jìn)行對應(yīng)條件培養(yǎng)24 h。消化收集常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，置于預(yù)冷的80%乙醇中4℃固定過夜。將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/ml，然后依次加入 RNA 酶抑制劑、碘化丙啶，37℃避光30 min后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.5 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖 將常氧培養(yǎng)的肺腺癌A549 細(xì)胞接種至96 孔板中，細(xì)胞接種密度為3 000個/孔，設(shè)置常氧組、乏氧組、坎地沙坦+乏氧組，待常氧培養(yǎng)各組細(xì)胞至細(xì)胞貼壁后，向坎地沙坦+乏氧組中加入坎地沙坦。各組分別進(jìn)行對應(yīng)條件的培養(yǎng)。分別于培養(yǎng) 0 h、24 h、48 h、72 h 時避光加入CCK-8 試劑（10μ/l 孔），在各自的孵箱中培養(yǎng)1 h。然后用酶標(biāo)儀測450 nm波長的光密度值OD450。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)及單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線 將常氧培養(yǎng)的肺腺癌A549 細(xì)胞接種至6 孔板，細(xì)胞接種密度為 400 個/孔，設(shè)置常氧組、乏氧組、坎地沙坦+乏氧組，待常氧培養(yǎng)各組細(xì)胞至細(xì)胞貼壁后，向坎地沙坦+乏氧組中加入坎地沙坦。將各組對應(yīng)條件培養(yǎng)24 h 后分別給予0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy 放射線照射，照射后進(jìn)行常氧培養(yǎng)。待其培養(yǎng)10 d 觀察到肉眼可見細(xì)胞集落后，給予多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色后計算克隆數(shù)?？寺⌒纬陕剩╬lating efficiency，PE）=（細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（surviving frac?tion，SF）=PE（照射組）/PE（對照組）。用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，公式為SF=1?（1?e-kD）N。其相關(guān)參數(shù) k=1/D0、lnn=D/qD0、增敏比=D0（乏氧照射組）/D（0坎地沙坦+乏氧照射組）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 各項(xiàng)試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。采用SPSS22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ?qū)ΤＱ鯒l件下A549細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示：常氧條件下A549 細(xì)胞經(jīng) 0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L不同濃度AngⅡ處理后其HIF-1α 表達(dá)逐漸上調(diào)，這提示AngⅡ能上調(diào)A549細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)（圖1）。

圖1 常氧條件下不同濃度AngⅡ處理A549細(xì)胞后HIF-1α表達(dá)Fig.1 Expression of HIF-1α in A549 cells under normox?ic conditions treated with AngⅡ at different conen?trations

2.2 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組AngⅡ的表達(dá) ELISA 結(jié)果顯示：乏氧組細(xì)胞上清液AngⅡ表達(dá)顯著高于常氧組（P<0.01，圖2），坎地沙坦組+乏氧組與乏氧組細(xì)胞上清液AngⅡ表達(dá)無顯著差異（P>0.05，圖2）。

圖2 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組AngⅡ的表達(dá)水平Fig.2 Expression of Ang Ⅱ in normoxia group，hypoxia group and candesartan combined with hypoxia group

2.3 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組HIF-1α、P53 及 P21 的表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示：乏氧組HIF-1α、P53 和P21 表達(dá)較常氧組均上調(diào)（圖3），坎地沙坦+乏氧組HIF-1α、P53 和P21 表達(dá)較乏氧組均下調(diào)（圖3）。

圖3 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組HIF-1α、P53 和P21表達(dá)Fig.3 Expression of HIF-1α，P53 and P21 in normoxia group，hypoxia group and candesartan combined with hypoxia group

2.4 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組的細(xì)胞周期分布 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：乏氧組細(xì)胞周期G0/G1/S比例顯著高于常氧組（圖4，P<0.05），乏氧組細(xì)胞周期G2/M 比例顯著低于常氧組（圖4，P<0.05），坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞周期G0/G1/S比例顯著低于乏氧組（圖4，P<0.05），坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞周期G2/M比例顯著高于乏氧組（圖4，P<0.05）。

圖4 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞周期分布Fig.4 Cell cycle distribution in normoxia group，hypoxia group and candesartan combined with hypoxia group

2.5 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞增殖情況 CCK8 結(jié)果顯示：常氧組與乏氧組細(xì)胞OD450值無顯著差異（P>0.05，圖5），坎地沙坦+乏氧組和乏氧組細(xì)胞OD450值無顯著差異（P>0.05，圖5）。這表明與常氧比較，乏氧對A549細(xì)胞的增殖無顯著影響（P>0.05，圖5）。與乏氧比較，坎地沙坦對A549細(xì)胞的增殖無顯著影響（P>0.05，圖5）。

圖5 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組OD450結(jié)果Fig.5 Results of OD450 in normoxia group，hypoxia group and candesartan combined with hypoxia group

2.6 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù) 克隆形成實(shí)驗(yàn)和單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)曲線結(jié)果顯示：乏氧組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（surviving fraction，SF）顯著高于常氧組（表1及圖6，P<0.01），坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著低于乏氧組（表1、圖6，P<0.01）。乏氧組的D0為3.226，坎地沙坦+乏氧組的D0為2.166，放射增敏比為1.489（表 2）。

表1 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（）Tab.1 Surviving fraction of normoxia group，hypoxia group and candesartan combined with hypoxia group（）

表1 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（）Tab.1 Surviving fraction of normoxia group，hypoxia group and candesartan combined with hypoxia group（）

Note：1）P<0.01，hypoxia group vs normoxia group，candesartan combined with hypoxia group vs hypoxia group.

8 Gy 0.015 9±0.001 4 0.101 1±0.004 91）0.040 2±0.001 01）Groups Normxia Hypoxia Candesartan+Hypoxia 2 Gy 0.415 5±0.007 3 0.620 6±0.008 11）0.516 2±0.003 11）4 Gy 0.131 2±0.002 4 0.313 7±0.002 81）0.190 6±0.008 41）6 Gy 0.058 2±0.001 6 0.209 1±0.003 71）0.110 3±0.003 71）

圖6 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)曲線Fig.6 Cell survival fraction curve of normoxia group，hy?poxia group and candesartan combined with hypox?ia group

表2 常氧組、乏氧組和坎地沙坦+乏氧組細(xì)胞單擊多靶模型參數(shù)Tab.2 Parameter of click on multi-target model in nor?moxia group，hypoxia group and candesartan combined with hypoxia group

3 討論

肺癌是目前對人類健康和生命安全威脅最大的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率均居我國惡性腫瘤首位［2，12］。而肺腺癌是肺癌中最常見的病理類型，其主要好發(fā)于女性和不吸煙者［3，13］。放療作為目前肺腺癌的重要治療方式，其療效與氧濃度密切相關(guān)，而肺腺癌組織中普遍存在的乏氧會導(dǎo)致放射抗拒，這給提高肺腺癌放療療效和改善患者的預(yù)后帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

MIAO 等［14］發(fā)現(xiàn)肺癌患者化療時使用血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARBs）能增加患者的無疾病進(jìn)展期，這提示ARBs 有可能在腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用。然而ARBs 是否對腫瘤的放療療效也會產(chǎn)生影響尚不明確?？驳厣程故茿RBs 的代表藥物之一，因此我們對其能否影響乏氧條件下肺腺癌A549細(xì)胞的放射敏感性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與常氧相比，乏氧未對肺腺癌A549 細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，但其顯著增加了其細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。當(dāng)給予坎地沙坦處理乏氧肺腺癌A549 細(xì)胞后，與乏氧相比，坎地沙坦亦未對肺腺癌A549細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，但卻顯著降低了其細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。這表明坎地沙坦增加了乏氧肺腺癌A549 細(xì)胞的放射敏感性。但其相關(guān)機(jī)制尚不明確，因此在實(shí)驗(yàn)中對機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

坎地沙坦發(fā)揮作用的途徑是通過阻斷AngⅡ的受體從而使AngⅡ的生物效應(yīng)降低。有研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)體腫瘤中存在AngⅡ表達(dá)，且在實(shí)體腫瘤乏氧區(qū)域內(nèi) AngⅡ的表達(dá)可被乏氧顯著上調(diào)［7，10］。另外還有研究發(fā)現(xiàn)乏氧條件下HIF-1α 表達(dá)亦上調(diào)，而且HIF-1α 在腫瘤細(xì)胞適應(yīng)乏氧微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，同時乏氧腫瘤細(xì)胞對放射線產(chǎn)生放射抗拒也與 HIF-1α 密切相關(guān)［9-15］。在肺腺癌 A549 細(xì)胞中，AngⅡ與HIF-1α 的表達(dá)是否存在著聯(lián)系尚不得而知。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)乏氧促進(jìn)了肺腺癌A549 細(xì)胞AngⅡ和HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，且常氧條件下隨著AngⅡ濃度的增加A549 細(xì)胞中HIF-1α 表達(dá)亦逐漸上調(diào)，這表明AngⅡ能促進(jìn)HIF-1α 表達(dá)上調(diào)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還得知，與常氧相比，乏氧條件下A549 細(xì)胞中HIF-1α 表達(dá)上調(diào)引起了P53 和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白P21 表達(dá)上調(diào)，這與相關(guān)研究報道HIF-1α 可上調(diào)P53 表達(dá)后進(jìn)一步上調(diào) P21 的表達(dá)是一致的［16-17］。此外，P21 可阻止細(xì)胞周期 G1/S 和 S/G2 轉(zhuǎn)化［9，18］。因此推測HIF-1α 使P21 表達(dá)上調(diào)后可能會進(jìn)一步對細(xì)胞周期產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)對此展開了相關(guān)研究。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得知，與常氧相比，乏氧誘導(dǎo)A549 細(xì)胞中細(xì)胞周期G0/G1/S 比例顯著增加且G2/M 比例顯著降低，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期G0/G1/S阻滯?，F(xiàn)已知放射線敏感性與細(xì)胞周期時相有關(guān)，G2/M 時相的細(xì)胞對放射線敏感性較高，而G0/G1和S 時相的細(xì)胞對放射線敏感性較低［19-20］。由此可知，與常氧相比，乏氧通過促進(jìn)AngⅡ表達(dá)而上調(diào)HIF-1α 表達(dá)，后者進(jìn)一步上調(diào) P53 和 P21 表達(dá)而促使細(xì)胞周期G0/G1/S 阻滯，最終導(dǎo)致乏氧肺腺癌A549 細(xì)胞放射敏感性降低。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)坎地沙坦能改善乏氧引起的肺腺癌A549 細(xì)胞放射抗拒而增加其放射敏感性，它能阻斷AngⅡ受體降低AngⅡ的效應(yīng)。因此本研究推測坎地沙坦可能通過降低AngⅡ效應(yīng)最終對細(xì)胞周期G0/G1/S 阻滯產(chǎn)生影響，從而增加乏氧肺腺癌A549 細(xì)胞放射敏感性。鑒于此，本研究發(fā)現(xiàn)乏氧條件下給予坎地沙坦處理A549 細(xì)胞后，與乏氧組比較，其HIF-1α 表達(dá)下調(diào)且P53 和P21 表達(dá)亦下調(diào)，同時細(xì)胞周期G0/G1/S 比例顯著降低且G2/M 比例顯著增加。這證實(shí)乏氧條件下坎地沙坦通過降低AngⅡ的效應(yīng)可使A549細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致P53、P21表達(dá)下調(diào)后抑制細(xì)胞周期G0/G1/S阻滯，從而增加對放射線更敏感的細(xì)胞周期G2/M 比例，最終導(dǎo)致乏氧條件下A549細(xì)胞放射敏感性增加。綜上所述，坎地沙坦增加乏氧條件下A549 細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制可能與其下調(diào)HIF-1α 表達(dá)后進(jìn)一步抑制細(xì)胞周期G0/G1/S阻滯有關(guān)。

目前本研究發(fā)現(xiàn)坎地沙坦能增加乏氧條件下肺腺癌A549細(xì)胞的放射敏感性，同時初步揭示了其可能的機(jī)制。坎地沙坦是當(dāng)前臨床中廣泛用于治療心血管等疾病的藥物，這為進(jìn)一步研究改善乏氧肺腺癌放療療效和探尋新的易于臨床推廣的放療增敏劑提供了新的思路。我們將在后續(xù)的動物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究坎地沙坦放療增敏的作用和其相關(guān)機(jī)制。