金優(yōu)萍，李錄英，周 平

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 200032

乳腺癌發(fā)病率正在逐年上升，目前已超越肺癌成為全球最常見的惡性腫瘤。雖然乳腺癌的治療方法不斷改善，但其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移依然嚴重威脅患者的生命健康。乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的機制尚未完全闡明，因此，進一步探究乳腺癌轉(zhuǎn)移機制，挖掘新的關(guān)鍵調(diào)控分子，為臨床防治乳腺癌轉(zhuǎn)移提供新靶點迫在眉睫。

研究［1-4］表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可以與DNA、蛋白或其他RNA結(jié)合，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本實驗室前期通過lncRNA表達譜芯片篩選發(fā)現(xiàn)，lncRNA ENST00000508435在乳腺癌組織中高表達［5］，檢索Ensemble數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，ENST00000508435即為微管不穩(wěn)定蛋白1假基因2（stathmin 1 pseudogene 2，STMN1P2）。然而，迄今為止尚未見與STMN1P2有關(guān)的報道。因此，本研究通過檢測STMN1P2在臨床乳腺癌組織和細胞系中的表達及對乳腺癌細胞生物學(xué)行為的影響，探究STMN1P2在乳腺癌中發(fā)揮的功能及其調(diào)控機制，以期為乳腺癌的防治提供新靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 乳腺癌組織

本研究收集的乳腺癌組織和對應(yīng)癌旁組織均取自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的27例乳腺癌患者，并得到了復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準（倫理號為2017-F001），所有患者均知情同意。

1.1.2 乳腺癌細胞系

人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231和BT-549細胞均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，人乳腺上皮細胞系MCF-10A購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.3 實驗試劑

DMEM、L-15、RPMI-1640、F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Toyobo公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，過表達質(zhì)粒和特異小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）套裝均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，transwell小室購自美國Corning公司，細胞周期染液和凋亡試劑盒購自日本Dojindo公司，β-actin和核內(nèi)不均一核糖核蛋白U（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U，hnRNPU）抗體購自美國Abcam公司，Biotin RNA Labeling Mix購自美國Roche公司，RNA pull-down試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RTFQ-PCR

按照產(chǎn)品說明書，用TRIzol提取組織和細胞的總RNA，對RNA進行變性反轉(zhuǎn)錄后，以所獲cDNA為模板，分別加入一系列特異引物，利用RTFQ-PCR系統(tǒng)進行擴增。最后用GAPDH的表達對各基因的表達進行標(biāo)準化，并通過2-ΔΔCt法計算特定基因的轉(zhuǎn)錄水平。GAPDH引物順義鏈為5’-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3’，反義鏈為5’-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3’；STMN1P2引物順義鏈為5’-ATCAATTCTATAATTCCCTTTCCCCTC-3’，反義鏈為5’-AACCACTTATTTCTCCATCCTTTGC-3’；hnRNPU引物順義鏈為5’-GGGGACGGCAAAACAGAACA-3’，反義鏈為5’-AGCACTGAGACGATCTCTTGA-3’。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

將細胞總蛋白用6%～12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行恒壓電泳，然后通過恒流濕轉(zhuǎn)法將蛋白印跡在聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PⅤDF）膜上。室溫封閉1 h后用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline with Tween，PBST）漂洗，加入一抗4 ℃溫育過夜后，再加入二抗，室溫溫育1 h后顯影拍照，最后使用Image J軟件對顯影條帶進行灰度值分析。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染時，細胞覆蓋率需達70%，按照LipofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染方式，將過表達質(zhì)?；騭iRNA分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231或BT-549細胞中，培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。其中siRNA的序列如下：si-STMN1P2-1順義鏈為5’-GAGAAUAGAGAGGCACAAATT-3’，反義鏈為5’-UUUGUGCCUCUCUAUUCUCTT-3’；si-STMN1P2-2順義鏈為5’-GCCAGAGAAGGAUAAGCACTT-3’，反義鏈為5’-GCCAGAGAAGGAUAAGCACTT-3’；si-STMN1P2-3順義鏈為5’-GCAAAGGAUGGAGAAAUAATT-3’，反義鏈為5’-UUAUUUCUCCAUCCUUUGCTT-3’；si-hnRNPU順義鏈為5’-GAACUCUCGUAUGCUAAGATT-3’，反義鏈為5’-UCUUAGCAUACGAGAGUUCTT-3’。

1.2.4 Transwell遷移實驗

將轉(zhuǎn)染有過表達質(zhì)?；騭iRNA的細胞制成無血清細胞懸液，在transwell上室放入無血清細胞懸液，下室放入含血清培養(yǎng)基，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，之后將小室用PBS漂洗，再先后用甲醇固定和0.1%結(jié)晶紫染色30 min，后用濕潤的棉簽擦去小室上層細胞，在顯微鏡下觀察拍照。最后使用Image J軟件進行細胞計數(shù)。

1.2.5 RNA pull-down實驗

既然每天基本只拍一張照片，不如嘗試拍攝更有力的作品，既能向觀眾透露整體敘事的一些信息，又能獨立存在，這會是一項有趣的挑戰(zhàn)。在365天的項目中給自己設(shè)定敘事以外的挑戰(zhàn)，既能給予你更多思考空間，也能給你更多動力，促使你完成項目。

將含STMN1P2表達載體通過酶切位點制備成單鏈模板，將其純化后，進行體外轉(zhuǎn)錄并采用生物素標(biāo)記。收集1 mg全細胞總蛋白與3 μg純化的生物素化的轉(zhuǎn)錄本4 ℃溫育1 h。后將洗滌的鏈霉親和素磁珠添加到蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物中，室溫溫育1 h，洗滌3次，并在95 ℃的SDS緩沖液中煮沸。后續(xù)通過SDS-PAGE篩選與陰性對照存有差異的條帶，切取差異條帶進行質(zhì)譜分析，分析可能與RNA特異結(jié)合的蛋白。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)用表示，組間的兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STMN1P2在乳腺癌組織和細胞系中高表達

通過RTFQ-PCR在27例乳腺癌組織及相對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本中檢測STMN1P2的表達，結(jié)果顯示，STMN1P2在乳腺癌組織中的表達顯著上調(diào)（圖1A）。同時，檢測STMN1P2在乳腺癌細胞系MDA-MB-231、BT-549、MCF-7和人乳腺上皮細胞系MCF-10A中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MCF-10A細胞相比，MDA-MB-231、BT-549和MCF-7乳腺癌細胞系中STMN1P2的相對表達量明顯升高，分別為（4.22±0.62，P＜0.01）、（9.06±0.63，P＜0.01）和（3.89±0.18，P＜0.05）（圖1B）。其中，STMN1P2在MDAMB-231細胞中的表達量低于BT-549細胞，且兩者細胞類型均為梭形，更有比較意義，因此在研究STMN1P2的生物學(xué)功能及可能機制時，選擇在MDA-MB-231細胞中過表達STMN1P2，在BT-549細胞中敲低STMN1P2。

圖1 STMN1P2在乳腺癌組織和細胞系中的表達水平Fig.1 The expression level of STMN1P2 in breast cancer tissues and cell lines

2.2 干擾STMN1P2表達抑制乳腺癌細胞遷移

為研究高表達STMN1P2對乳腺癌細胞生物學(xué)行為的影響，本實驗選用3種siRNA轉(zhuǎn)染BT-549細胞來抑制STMN1P2的表達。RTFQ-PCR檢測結(jié)果顯示，3種siRNA均能有效地降低STMN1P2的表達，其中si-STMN1P2-2的干擾效率最好，可達65%左右（P＜0.05，圖2A）。因此，在利用si-STMN1P2-2抑制STMN1P2表達的基礎(chǔ)上進行transwell實驗，研究STMN1P2對細胞遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾STMN1P248 h后，細胞遷移能力減弱，干擾組較對照組的遷移細胞數(shù)減少（200.00±11.27vs237.67±17.79，P＜0.05，圖2B、2C），提示干擾STMN1P2表達可抑制乳腺癌細胞遷移。

圖2 干擾STMN1P2表達抑制BT-549細胞遷移能力Fig.2 Interference with STMN1P2 expression inhibited the migration ability of BT-549 cells

2.3 STMN1P2對細胞凋亡和周期無明顯影響

為研究STMN1P2對乳腺癌細胞其他生物學(xué)行為的影響，在利用si-STMN1P2-2抑制STMN1P2表達的基礎(chǔ)上再通過流式細胞術(shù)分別研究STMN1P2對細胞凋亡和細胞周期的影響。細胞凋亡研究結(jié)果顯示，干擾組細胞轉(zhuǎn)染48 h后細胞凋亡率為10.48%±1.24%，與對照組的細胞凋亡率（9.29%±0.03%）相近（圖3A、3B）。細胞周期研究結(jié)果顯示，干擾組細胞轉(zhuǎn)染48 h后位于S期的細胞比例與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（30.30±0.71vs27.65±1.77，圖3C、3D）。這提示干擾STMN1P2對細胞凋亡和細胞周期并無明顯影響。

圖3 干擾STMN1P2表達對細胞凋亡和細胞周期無影響Fig.3 Interference with STMN1P2 expression had no effect on cell apoptosis and cell cycle

2.4 過表達STMN1P2促進乳腺癌細胞遷移

在MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)染STMN1P2過表達質(zhì)粒后，RTFQ-PCR檢測結(jié)果顯示，STMN1P2的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，約為對照組的85倍（P＜0.01，圖4A）。在過表達STMN1P2的基礎(chǔ)上進行transwell實驗觀察其對細胞遷移的作用，結(jié)果顯示，當(dāng)STMN1P2表達增加時，細胞的遷移能力增強，過表達組較對照組的遷移細胞數(shù)增加（499.00±43.84vs311.50±16.26，P＜0.05，圖4B、4C），提示STMN1P2可促進乳腺癌細胞遷移。

圖4 過表達STMN1P2促進MDA-MB-231細胞遷移Fig.4 Overexpression of STMN1P2 promotes the migration of MDA-MB-231 cells

2.5 hnRNPU可能為STMN1P2的特異結(jié)合蛋白

為探究STMN1P2促進乳腺癌細胞遷移的機制，采用RNA pull-down技術(shù)結(jié)合SDS-PAGE和質(zhì)譜分析差異條帶（如圖5A紅色箭頭所示），鑒定出hnRNPU可能為STMN1P2的結(jié)合蛋白，同時通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，RNA pull-down捕獲的蛋白中實驗組與陰性對照組相比其hnRNPU表達水平增加（圖5B）。

圖5 RNA pull-down實驗結(jié)果顯示hnRNPU可能為STMN1P2的特異結(jié)合蛋白Fig.5 RNA pull-down showed that hnRNPU might be a specific binding protein of STMN1P2

2.6 STMN1P2調(diào)控hnRNPU表達

圖6 hnRNPU表達受STMN1P2調(diào)控Fig.6 hnRNPU expression was regulated by STMN1P2

2.7 STMN1P2通過結(jié)合hnRNPU促進細胞遷移

為研究STMN1P2促進細胞遷移的功能是否需要hnRNPU參與，我們開展了挽救實驗，利用siRNA干擾hnRNPU的表達，觀察抑制hnRNPU是否能逆轉(zhuǎn)STMN1P2促乳腺癌細胞遷移的作用。在BT-549細胞中轉(zhuǎn)染hnRNPU的siRNA，結(jié)果顯示，si-hnRNPU能有效降低hnRNPU的mRNA（P＜0.001，圖7A）和蛋白（P＜0.05，圖7B）表達。隨后，在過表達STMN1P2的MDA-MB-231細胞中干擾hnRNPU進行transwell實驗，結(jié)果顯示，抑制hnRNPU能夠逆轉(zhuǎn)STMN1P2的促遷移作用（圖7C）。

圖7 抑制hnRNPU逆轉(zhuǎn)STMN1P2的促乳腺癌細胞遷移的作用Fig.7 Inhibition of hnRNPU reversed the effect of STMN1P2 on breast cancer cell migration

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。近年來，中國每年被確診為乳腺癌的病例不斷增多，且呈現(xiàn)出年輕化趨勢［6］。雖然乳腺癌的治療已取得顯著進展，但由于侵襲性高，其預(yù)后仍不理想。因此，闡明乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制，發(fā)現(xiàn)新靶點，對于進一步揭示乳腺癌轉(zhuǎn)移過程及研發(fā)治療乳腺癌的新藥具有重大意義。

LncRNA被證明具有多種生物學(xué)功能，包括參與表觀遺傳調(diào)控、細胞周期、細胞凋亡和遷移調(diào)控等［7］，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用，可作為潛在的腫瘤標(biāo)志物。例如，lncRNA MALAT1調(diào)控選擇性mRNA剪接和表觀遺傳修飾，在多種惡性腫瘤中表達異常，被認為是肺癌預(yù)后的評判參數(shù)［8］；在乳腺癌患者血清中的循環(huán)lncRNA RP11-445H22.4、HOTAIR也可以作為乳腺癌潛在的生物標(biāo)志物［9］。本研究所采用的lncRNA STMN1P2是Stathmin 1的一個假基因，Stathmin 1是一種高度保守的細胞質(zhì)磷蛋白，參與細胞增殖、分化等功能［10］，與多種癌癥息息相關(guān)［11-12］，被作為抗癌活性藥物的新型治療靶標(biāo)［13］，預(yù)示其假基因STMN1P2可能對癌癥也有類似作用。本研究發(fā)現(xiàn)，STMN1P2在乳腺癌臨床組織和細胞系中顯著高表達，下調(diào)STMN1P2的表達后，乳腺癌細胞遷移能力減弱，上調(diào)STMN1P2的表達后，細胞遷移能力增強，提示STMN1P2可調(diào)控乳腺癌細胞遷移，有望成為乳腺癌潛在的生物標(biāo)志物。

HnRNPU是一種RNA結(jié)合蛋白，在DNA損傷修復(fù)、抑制細胞凋亡及腫瘤進程中發(fā)揮重要作用［14-15］。近期已有研究［16］報道，hnRNPU可以與lncRNA相互作用，HNF4A-AS1/hnRNPU/CTCF軸或可作為成神經(jīng)細胞瘤進展的治療靶標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，hnRNPU為STMN1P2的特異結(jié)合蛋白，且上調(diào)或下調(diào)STMN1P2表達后，hnRNPU的表達與STMN1P2呈正相關(guān)，提示STMN1P2調(diào)控乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的分子機制可能與其結(jié)合hnRNPU并發(fā)生相互作用有關(guān)。

綜上所述，本研究初步揭示了STMN1P2在乳腺癌發(fā)展過程中的作用及機制，有望或為乳腺癌防治的新靶點。