丁高峰，郭雷鳴，陸寓非

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，河南 鄭州 450000

乳腺癌是全球女性致死率較高的癌癥之一［1］，全球乳腺癌發(fā)病率以每年約2%的速度遞增，近年來(lái)中國(guó)乳腺癌的發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢(shì)［2-3］。放療是乳腺癌綜合治療的重要手段，且作為術(shù)后輔助性治療手段，可降低局部復(fù)發(fā)率和減少死亡危險(xiǎn)［4］。乳腺癌對(duì)放療的放射抵抗是影響療效的主要原因之一［5-6］。降低癌癥對(duì)輻射的抗性、增加輻射敏感性對(duì)提高乳腺癌療效有重要意義。人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是乳腺癌原癌基因，是最具有代表性的乳腺癌標(biāo)志物，乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）是一種具有遺傳傾向的乳腺癌和卵巢癌的易感基因，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的遺傳性乳腺癌易感基因［7-8］。HER2與乳腺癌的發(fā)展、惡性轉(zhuǎn)化和不良預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)的HER2是乳腺癌靶向治療效果和術(shù)后療效的重要預(yù)測(cè)標(biāo)志物［9］。研究［10］發(fā)現(xiàn)，30%乳腺癌患者HER2高表達(dá)，是預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。BRCA1是一種腫瘤抑制蛋白，通過(guò)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期阻滯和DNA修復(fù)，維持遺傳基因的穩(wěn)定性［11］。BRCAl影響乳腺癌細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的敏感性可能存在雙向調(diào)節(jié)的作用，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌的癌變組織、相鄰正常乳腺組織和良性乳腺病變組織中HER2和BRCA1的mRNA和蛋白表達(dá)變化，旨在探討兩者的表達(dá)變化與乳腺癌放療預(yù)后的關(guān)系，為乳腺癌患者的臨床治療提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 倫理審查

本研究經(jīng)患者知情同意自愿進(jìn)行，所有患者都事先制訂了完整計(jì)劃并簽署了知情同意書(shū)。

1.2 研究對(duì)象

選取鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科2010年5月—2013年5月收治的156例接受乳腺癌手術(shù)患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，平均年齡（45.6±5.5）歲（35～63歲），未接受過(guò)任何放療、化療、內(nèi)分泌治療，既往未患急性、慢性疾病或其他惡性腫瘤。接受改良根治手術(shù)、術(shù)后輔助化療和放療（50 Gy/25次，每周治療5次）。另外145例懷疑可能患有乳腺癌，但病理學(xué)檢查結(jié)果表明僅是纖維瘤或良性乳腺病變的患者作為對(duì)照組，平均年齡（46.2±5.4）歲（32～58歲），乳腺癌患者和良性乳腺病變患者的年齡和基本情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.3 標(biāo)本處理

手術(shù)后，分別選取乳腺癌患者的癌組織、距離癌組織2 cm的正常乳腺組織和良性乳腺病變組織，一部分標(biāo)本立即放入液氮中保存，用于RNA的提取。另外一部分標(biāo)本在4%甲醛溶液中浸泡24 h并用石蠟包埋切片保存，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.4 RTFQ-PCR

取出液氮中的樣品組織，利用TRIzol提取RNA后測(cè)定其濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為10 μL的cDNA，然后用PCR儀進(jìn)行基因片段擴(kuò)增。PCR條件為：95 ℃預(yù)處理4 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火5 s，72 ℃延伸5 s，共30個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。RTFQ-PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 RTFQ-PCR的引物序列Tab.1 The primer sequences for RTFQ-PCR

1.5 免疫組織化學(xué)

將石蠟包埋的組織標(biāo)本進(jìn)行4 μm連續(xù)切片，置于梯度乙醇脫水15 min。然后將切片浸入雙氧水中滅活處理，磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）清洗3次，每次5 min，常溫下在常規(guī)山羊血清中浸泡15 min。標(biāo)本中加入20～30 μL經(jīng)PBS稀釋后的HER2和BRCA1抗體，4 ℃下溫育過(guò)夜，陰性對(duì)照組用PBS來(lái)替代一抗。溫育后，PBS清洗3次，每次5 min，滴加二抗37 ℃下溫育45 min。然后PBS清洗3次，每次5 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）后染色5～10 min，自來(lái)水沖洗后用蘇木精復(fù)染5 min，稀鹽酸脫鹽處理30 s后清洗5 min，然后脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察。HER2和BRCA1蛋白具有陽(yáng)性表達(dá)的石蠟切片作為控制組。

1.6 染色結(jié)果判斷

根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，以腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色、棕褐色或棕黃色顆粒，定義為陽(yáng)性細(xì)胞。然后在高倍鏡下隨機(jī)查看5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：①統(tǒng)計(jì)的陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜10%為0分，10%≤陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜25%為1分，25%≤陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比≥50%為3分；② 統(tǒng)計(jì)的染色程度無(wú)色為0分，黃色為1分，黃褐色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)指標(biāo)相加為最終指標(biāo)：0～1分為“-”，2～3分為“+”，4～5分為“++”，6分為“+++”。

1.7 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

放療結(jié)束3個(gè)月后若胸壁或淋巴結(jié)引流區(qū)域腫瘤復(fù)發(fā)或部分腫瘤組織仍存在，定義為局部失敗。結(jié)合計(jì)算機(jī)體層成像（computed tomography，CT）和病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行局部失效的診斷，局部失敗率=（局部不受控患者數(shù)）/（患者總數(shù)）×100%。

1.8 患者隨訪

收集所有參與研究患者的臨床和組織病理學(xué)資料，通過(guò)電話或收集臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行隨訪，治療后前3年每3個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，接下來(lái)的3～5年每6個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，直到所有的隨訪患者死亡為止，隨訪截至2020年5月。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 癌組織、良性乳腺病變組織和相鄰正常乳腺組織中HER2和BRCA1 mRNA表達(dá)

RTFQ-PCR結(jié)果顯示，良性乳腺病變組織和相鄰正常乳腺組織中BRCA1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），癌組織相比其他兩組BRCA1 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01，圖1A）。良性乳腺病變組織和相鄰正常乳腺組織中HER2 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），癌組織中HER2 mRNA表達(dá)顯著高于其他兩組（P＜0.01，圖1B）。相比良性乳腺病變組織和相鄰正常乳腺組織，癌組織中BRCA1 mRNA呈低表達(dá)而HER2 mRNA高表達(dá)。

圖1 癌變組織、良性乳腺病變組織和相鄰正常乳腺組織中HER2和BRCA1 mRNA表達(dá)Fig.1 The mRNA expressions of HER2 and BRCA1 in breast cancer tissues,benign breast lesion tissues and adjacent normal breast tissues

2.2 癌組織、良性乳腺病變組織和相鄰正常乳腺組織中HER2和BRCA1蛋白水平

相鄰正常乳腺組織、良性乳腺病變組織和癌組織中HER2的陽(yáng)性表達(dá)率分別是11.5%，18.5%和49.4%，癌組織中HER2的陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高（P＜0.01，圖2A）。3組樣本中BRCA1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.7%，55.9%和32.7%，癌組織中BRCA1的陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低（P＜0.01，圖2B），良性乳腺病變組織和相鄰正常乳腺組織中HER2和BRCA1的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 癌變組織、良性乳腺病變組織和相鄰正常乳腺組織中HER2和BRCA1蛋白的表達(dá)Fig.2 The protein expressions of HER2 and BRCA1 in breast cancer tissues,benign breast lesion tissues and adjacent normal breast tissues

2.3 癌組織中HER2及BRCA1表達(dá)與放療敏感性的關(guān)系

HER2陽(yáng)性患者中的局部失敗率顯著高于陰性患者（P＜0.05，圖3A）；BRCA1陽(yáng)性患者的局部失敗率顯著低于陰性患者（P＜0.01，圖3B）。

圖3 癌變組織中HER2和BRCA1表達(dá)與放療敏感性的關(guān)系Fig.3 Relationship between HER2 and BRCA1 expressions in breast tissues and radiation sensitivity

2.4 不同HER2和BRCA1表達(dá)對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的影響

156例乳腺癌患者的5年生存率是75.6%，存活時(shí)間為57個(gè)月，其中BRCA1陽(yáng)性患者的5年生存率為86.3%，陰性患者為70.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031，圖4A）。HER2陽(yáng)性患者的5年生存率為67.5%，陰性患者為83.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020，圖4B）。

圖4 乳腺癌組織中不同HER2和BRCA1表達(dá)患者的5年生存率Fig.4 The 5-year overall survival rates of patients with different expressions of HER2 and BRCA1 in breast cancer tissues

2.5 乳腺癌組織中HER2與BRCA1表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

156例乳腺癌組織樣本中，53例患者HER2陽(yáng)性表達(dá)而B(niǎo)RCA1陰性表達(dá)，27例HER2陰性表達(dá)而B(niǎo)RCA1陽(yáng)性表達(dá)，24例患者兩項(xiàng)表達(dá)均為陽(yáng)性，52例患者兩項(xiàng)表達(dá)均為陰性（表2）。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，HER2和BRCA1的表達(dá)并無(wú)顯著相關(guān)性（r=0.032，P=0.691）。

表2 乳腺癌組織中HER2和BRCA1表達(dá)的關(guān)聯(lián)性Tab.2 Correlation between HER2 and BRCA1 expressions in breast cancer tissues

3 討 論

HER2是胃癌和乳腺癌抗體治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)，目前針對(duì)該靶點(diǎn)的藥物已成功應(yīng)用于患者的臨床輔助治療，20%～25%的乳腺癌患者HER2基因高表達(dá)［12-13］。BRCA1是多效性損傷響應(yīng)蛋白，主要作用在于DNA復(fù)制過(guò)程中的DNA修復(fù)、靶點(diǎn)激活和保護(hù)基因組雙螺旋DNA免受損傷［14］。BRCA1胚系突變與卵巢和乳腺癌的放射敏感性高度相關(guān)［15］。本研究通過(guò)檢測(cè)HER2和BRCA1在乳腺癌不同組織中的mRNA表達(dá)和蛋白水平，分析兩者的表達(dá)與放療敏感性的關(guān)系及與預(yù)后生存期的相關(guān)性，探討兩者的表達(dá)與乳腺癌患者放療敏感性的關(guān)系，以期為乳腺癌患者提供一種新的臨床治療方法。

HER2的高表達(dá)會(huì)提高癌細(xì)胞存活率、活性和增殖率，并針對(duì)癌癥的許多治療手段（如內(nèi)分泌治療、放療、化療等）起到一定的抑制作用，影響治療效果［16-17］。Tagliabue等［18］研究也證實(shí)，HER2的高表達(dá)和激活會(huì)導(dǎo)致乳腺細(xì)胞癌變。本研究表明，與良性乳腺病變組織和相鄰正常乳腺組織相比，癌組織中HER2 mRNA表達(dá)和蛋白水平均增加，證實(shí)HER2高表達(dá)與乳腺癌病變密切相關(guān)。BRCA1是DNA修復(fù)系統(tǒng)中重要的因子之一［19］，細(xì)胞分裂過(guò)程中DNA受損后，BRCA1會(huì)迅速磷酸化，識(shí)別DNA受損信號(hào)或S期DNA修復(fù)過(guò)程的信號(hào)，BRCA1是降低乳腺癌發(fā)病率、抑制DNA損傷的重要分子，對(duì)乳腺癌患者的病變過(guò)程有明顯的抑制作用［20-21］。本研究表明，乳腺癌患者癌組織中BRCA1 mRNA表達(dá)和蛋白水平顯著降低，BRCA1表達(dá)水平的降低可作為乳腺癌癌變過(guò)程中的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。

研究［22-23］報(bào)道，HER2陽(yáng)性預(yù)示著乳腺癌預(yù)后不良，BRCA1陰性表達(dá)的患者生存率要低于BRCA1陽(yáng)性表達(dá)的患者。本研究顯示，HER2陽(yáng)性患者的局部失敗率比HER2陰性患者高，BRCA1陽(yáng)性患者的局部失敗率比BRCA1陰性患者低。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，HER2陽(yáng)性患者的5年生存率要低于HER2陰性患者，BRCA1陽(yáng)性患者的5年生存率則高于BRCA1陰性患者，推測(cè)兩者可能是放療敏感性和預(yù)后生存的重要指標(biāo)，改變HER2和BRCA1在乳腺癌中的表達(dá)水平也許可以調(diào)節(jié)乳腺癌患者的放療敏感性，并影響患者的5年生存率。

綜上所述，乳腺癌組織中HER2陽(yáng)性患者的局部失敗率高，且預(yù)后比HER2陰性患者差，BRCA1陽(yáng)性患者的局部失敗率低，且預(yù)后明顯好于BRCA1陰性患者，提示調(diào)控HER2和BRCA1的表達(dá)對(duì)提高乳腺癌患者的放療效果可能有一定促進(jìn)作用。但本研究存在樣本數(shù)量有限、指標(biāo)體系不完整、指標(biāo)結(jié)果不全面等問(wèn)題，仍有待進(jìn)一步深入研究。