李海洲，張艷煒，許英杰，楊 門，張 磊，韓京軍

1.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院心胸外科，廣東 深圳 518000；

2.深圳市疾病預(yù)防和控制中心免疫規(guī)劃科，廣東 深圳 518055

miRNA是一類廣泛分布于多細(xì)胞生物中的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 3’非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）結(jié)合使其降解或抑制翻譯，在蛋白質(zhì)的合成過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［1］。研究［1-3］證實，miRNA通過調(diào)控基因表達(dá)，發(fā)揮多種生物學(xué)功能，影響細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、凋亡和代謝，miRNA不僅參與機體的生長發(fā)育等正常生理過程，還參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和腫瘤血管形成等過程。研究［4］顯示，miR-933過表達(dá)對肺癌的增殖、侵襲具有抑制作用。miRNA具有腫瘤特異性，在不同腫瘤中有特定的表達(dá)水平，通過腫瘤組織與正常組織的miRNA表達(dá)譜對比分析，可發(fā)現(xiàn)不同腫瘤特定的異常表達(dá)miRNA，對腫瘤的早期診斷有重要意義［5］。Kruppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子6（Kruppellike zinc finger transcription factor 6，KLF6）是KLFs家族的重要成員，是已被證實的抑癌基因［6］，在前列腺癌［7］、結(jié)直腸癌［8］、鼻咽癌［9］等腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用。本研究旨在明確miR-933對KLF6基因的調(diào)控作用，以及對肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等過程的影響并探討相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來源及主要試劑

人肺癌細(xì)胞系H460、A549，以及正常人肺支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫。

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（r e a ltime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購自日本Takara公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本Dojindo公司，miR-933 mimic和mimic NC購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

將人肺癌細(xì)胞系H460、A549，以及正常人肺支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行傳代和鋪板。

1.2.2 miR-933及KLF6 mRNA表達(dá)水平檢測

采用TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RTFQ-PCR反應(yīng)體系及程序參考試劑盒說明書。以U6、GAPDH作為KLF6內(nèi)參對照，測定miR-933、KLF6的相對表達(dá)量，采用2-ΔΔCt法分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.3 分組及瞬時轉(zhuǎn)染miR-933

實驗分為miR-933 mimic陰性對照組（mimic NC）和miR-933 mimic組。每孔以5×104個細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到40%～50%，轉(zhuǎn)染miR-933 mimic和mimic NC，培養(yǎng)6 h后，換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測

取1×103個轉(zhuǎn)染后細(xì)胞鋪于96孔板中，分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，根據(jù)CCK-8說明書，測定每孔吸光度（D）值，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 EdU細(xì)胞增殖實驗

根據(jù)EdU試劑盒說明書，對轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，使用熒光顯微鏡拍照成像，隨機取5個視野計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞遷移能力檢測

收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基制成3×105個細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液加入上室，下室加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞固定、染色，使用熒光顯微鏡拍照成像，隨機取10個視野計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.7 細(xì)胞侵襲檢測

采用matrigel基質(zhì)膠包埋transwell小室，用無血清培養(yǎng)基制成4×105個細(xì)胞/mL的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞懸液加入小室，下室加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞固定、染色，使用熒光顯微鏡拍照成像，隨機取10個視野計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.8 細(xì)胞凋亡能力檢測

根據(jù)Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒說明書，在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入Annexin Ⅴ-FITC和PI混勻，采用流式細(xì)胞儀上機檢測。

1.2.9KLF6表達(dá)水平檢測

提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），加入KLF6抗體、GAPDH抗體溫育，發(fā)光成像。采用Image J軟件分析各組細(xì)胞KLF6蛋白條帶總灰度值，計算蛋白表達(dá)水平。

1.2.10 數(shù)據(jù)庫分析

利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）、GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和Kaplan-Meier Plotter（https://kmplot.com/analysis/）等公共數(shù)據(jù)庫分析KLF6對肺癌臨床病理學(xué)參數(shù)的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料結(jié)果用表示，對于符合正態(tài)分布的兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-933在BEAS-2B、A549、H460細(xì)胞中的表達(dá)水平

RTFQ-PCR檢測結(jié)果見圖1，miR-933在A549細(xì)胞中的相對表達(dá)量為0.458±0.029，在H460細(xì)胞中的相對表達(dá)量為0.295±0.014，與BEAS-2B細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（A549：t=32.29，P＜0.001；H460：t=85.61，P＜0.001）。

圖1 miR-933在正常肺支氣管上皮細(xì)胞和肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平Fig.1 Expression of miR-933 in lung bronchial epithelial cells and lung cancer cell lines

2.2 miR-933轉(zhuǎn)染效率以及KLF6基因mRNA表達(dá)和蛋白水平

在A549和H460構(gòu)建miR-933過表達(dá)的細(xì)胞模型中，通過RTFQ-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。miR-933 mimic組A549和H460細(xì)胞中miR-933的表達(dá)水平比mimic NC組顯著提高（A549：t=62.03，P＜0.0001；H460：t=50.49，P＜0.0001，圖2A）。轉(zhuǎn)染后，A549和H460細(xì)胞的KLF6基因mRNA相對表達(dá)水平均顯著提高（A549：t=12.34，P＜0.001；H460：t=9.472，P＜0.05，圖2B）。與mimic NC組相比，mimic組的A549和H460細(xì)胞的KLF6蛋白相對表達(dá)水平均顯著提高（A549：t=4.233，P＜0.05；H460：t=7.63，P＜0.05，圖2C）。

圖2 miR-933調(diào)控KLF6基因的表達(dá)Fig.2 KLF6 gene regulated by miR-933

2.3 miR-933對A549和H460細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實驗結(jié)果見圖3，mimic組A549和H460細(xì)胞在48、72、96 h的增殖能力均低于mimic NC組（P＜0.05）。EdU實驗結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-933顯著抑制A549和H460細(xì)胞的增殖能力（A549：t=42.28，P＜0.001；H460：t=5.631，P＜0.01）。

圖3 CCK-8檢測轉(zhuǎn)染miR-933 mimic對A549和H460細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 CCK-8 assay for assessing the effect of miR-933 on proliferation of A549 and H460 cells after transfection with miR-933 mimic

圖4 EdU檢測轉(zhuǎn)染miR-933 mimic對A549和H460細(xì)胞增殖能力的影響Fig.4 EdU assay for assessing the effect of miR-933 on proliferation of A549 and H460 cells

2.4 miR-933對A549和H460細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

遷移實驗結(jié)果見圖5，與mimic NC組相比，miR-933 mimic組A549和H460細(xì)胞的遷移率均顯著降低（A549：t=25.21，P＜0.01；H460：t=13.87，P＜0.01）。Transwell侵襲實驗結(jié)果見圖6，miR-933 mimic組A549和H460細(xì)胞的侵襲能力、侵襲率均低于mimic NC組（A549：t=23.18，P＜0.01；H460：t=21.02，P＜0.01）。

圖5 轉(zhuǎn)染miR-933mimic抑制A549和H460細(xì)胞遷移能力Fig.5 The inhibited migration of A549 and H460 cells after transfection of miR-933 mimic

圖6 轉(zhuǎn)染miR-933 mimic抑制A549和H460細(xì)胞侵襲能力Fig.6 The inhibited invasive ability of A549 and H460 cells after transfection of miR-933 mimic

2.5 miR-933對A549和H460細(xì)胞凋亡的影響

miR-933 mimic組A549和H460細(xì)胞凋亡率分別為48.30%±1.00%和6.10%±0.20%，均顯著高于mimic NC對照組（37.60%±0.90%和2.70%±0.01%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（A549：t=13.18，P＜0.001；H460：t=29.41，P＜0.0001，圖7）。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miR-933 mimic對A549和H460細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 The effect of transfection of miR-933 mimic on apoptosis of A549 and H460 cells detected by flow cytometry

2.6 KLF6基因?qū)Ψ伟┗颊哳A(yù)后的影響

在TCGA數(shù)據(jù)庫59例正常組織樣本和515例肺癌組織樣本中，KLF6基因較正常組織顯著下調(diào)（圖8A）。在GEO數(shù)據(jù)庫［10］10例正常組織樣本和82例肺癌組織樣本中，與正常肺組織相比，肺癌組織中KLF6基因明顯下調(diào)（P＜0.001，圖8B）。在不同臨床分期的肺癌組織（正常組織59例，Ⅰ期病例277例，Ⅱ期病例125例，Ⅲ期病例85例，Ⅳ期病例28例）中，KLF6基因表達(dá)無明顯差異（P>0.05，圖8C）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，高表達(dá)KLF6與肺癌患者的生存率呈正相關(guān)（P＜0.05，圖8D）。

圖8 KLF6表達(dá)與肺癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Fig.8 Study of the clinical association of KLF6 with the clinicopathologic parameters of lung cancer

3 討 論

肺癌是中國癌癥致死的首要原因，嚴(yán)重威脅著中國國民健康和社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。肺癌作為一種高發(fā)病率、高死亡率的全球性慢性疾病，仍然是人類面臨的嚴(yán)峻安全問題之一［11］。國際癌癥研究機構(gòu)2018年最新報告顯示，全球有1810萬癌癥新增病例和960萬例癌癥死亡病例，其中肺癌新增病例數(shù)為200多萬（11.6%）、死亡病例數(shù)170多萬（18.4%）排在首位［12］。中國腫瘤登記中心數(shù)據(jù)顯示，2015年肺癌新增病例78.7萬例、死亡病例63.1萬例［13］，肺癌已成為危害人類健康的最大“殺手”。因此，研究肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子調(diào)控機制并尋找有效的治療靶點，有利于優(yōu)化現(xiàn)有肺癌治療手段。

miRNA是一類長度為18～22 nt的非編碼RNA，廣泛參與基因的表達(dá)和調(diào)控［1］。miRNA在腫瘤中表達(dá)失調(diào)，腫瘤組織中部分miRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用［3］。Fang等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a-5p在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中表達(dá)上調(diào)，在A549細(xì)胞中過表達(dá)miR-20a-5p能夠增強細(xì)胞的增殖和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。miR-199的表達(dá)與肺癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，低表達(dá)miR-199與預(yù)后不良呈正相關(guān)，miR-199表達(dá)越低，預(yù)后越差，miR-199可以作為肺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物［15］。過表達(dá)miR-199可以增強H1299和SPCA1肺癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)其遷移和侵襲能力［15］。Xu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-129-5p可下調(diào)YWHAB，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-933在肺癌細(xì)胞A549和H460中均顯著下調(diào)，而且過表達(dá)miR-933能抑制A549和H460細(xì)胞的增殖，降低其遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，miR-933可能是NSCLC潛在的抑癌基因。同時，越來越多的miRNA被證實在結(jié)直腸癌［17-18］、肝癌［19-20］、腎細(xì)胞癌［19-20］等多種腫瘤中表達(dá)異常，從而引起靶基因和蛋白的表達(dá)失調(diào)。

KLF6是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和程序性死亡，其功能改變與許多人類疾病的病理學(xué)過程有關(guān)，包括心血管疾病、代謝紊亂和癌癥［19-20］，KLF6已被證明是多種腫瘤的抑癌基因［6，8］。Ito等［21］研究表明，KLF6在NSCLC組織中經(jīng)常下調(diào)，并通過誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長，表明KLF6是NSCLC的腫瘤抑制因子。另外，KLF6基因多態(tài)性與肺癌的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)聯(lián)性［22］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-933提高了KLF6 mRNA表達(dá)和KLF6蛋白的水平，過表達(dá)miR-933能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，提示miR-933可能通過調(diào)控KLF6表達(dá)發(fā)揮抑癌基因的作用。相比正常組織，KLF6在肺癌組織中的表達(dá)量顯著下調(diào)，提示KLF6是誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的重要因子。而且，由Kaplan-Meier生存曲線可知，高表達(dá)KLF6的肺癌患者的總生存率高于低表達(dá)KLF6的患者，因此，KLF6可作為判斷肺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。Tahara等［23］研究發(fā)現(xiàn)，KLF6與佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）相互作用，引起NSCLC細(xì)胞生長阻滯，KLF6基因表達(dá)缺失可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞H358的生長，而且KLF6還通過誘導(dǎo)CDKIs、p21和p27參與PMA調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力。miR-24-3p通過調(diào)控靶向KLF6基因，間接調(diào)節(jié)IL-6/STAT3信號通路影響食管癌細(xì)胞的生長和凋亡，沉默miR-24-3p使KLF6基因的表達(dá)水平上調(diào)，從而抑制食管癌細(xì)胞的增殖活力，促進(jìn)其凋亡［24］。吳鑫等［25］研究發(fā)現(xiàn)，KLF6在結(jié)直腸癌組織、癌前病變組織中的表達(dá)水平低于癌旁正常組織，并與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有一定相關(guān)性。高表達(dá)miR-543靶向結(jié)合KLF6的3’-UTR并抑制KLF6的表達(dá)，通過靶向調(diào)控KLF6的表達(dá)來調(diào)控p21的表達(dá)，從而調(diào)控腎透明細(xì)胞癌的增殖和侵襲，影響腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展［26］。

本研究證實miR-933過表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞A549和H460的增殖、遷移和侵襲能力，同時miR-933能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系的凋亡。而miR-933過表達(dá)可以提高KLF6 mRNA表達(dá)和KLF6蛋白的水平，說明miR-933可以調(diào)控KLF6表達(dá)，發(fā)揮抑制肺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。本研究進(jìn)一步揭示了miRNA在NSCLC發(fā)病中的分子機制，發(fā)現(xiàn)miR-933可能為NSCLC的診斷和治療提供新的靶點。