王 珣 王冬平 蔡 揚(yáng)

1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，貴州貴陽(yáng) 550004；2.遼寧省大連市友誼醫(yī)院口腔科，遼寧大連 116011

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜皮膚常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)在OLP患者組織中存在CD4+T 淋巴細(xì)胞中的輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）1/Th2的平衡失調(diào)[1]。Monney 等[2]發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3，Tim-3）家族，是一個(gè)新基因家族，表達(dá)于T 細(xì)胞。人類Tim-3 可以作為T(mén)h1的特異性表面標(biāo)志[3]。目前研究認(rèn)為，由于Tim-3 與半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）的結(jié)合使得Tim-3/Gal-9 通路激活對(duì)Th1 細(xì)胞效應(yīng)有抑制作用[4]。本研究探討Tim-3、Gal-9、γ 干擾素（interferon-γ，INF-γ）在OLP 患者組織中的表達(dá)，探討Tim-3/Gal-9 信號(hào)通路在OLP 局部病損形成中的作用

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

兔抗人Tim-3 多克隆抗體（貨號(hào)：sc-292389）、兔抗人Gal-9 多克隆抗體（貨號(hào)：0604R）、兔抗人IFN-γ多克隆抗體（貨號(hào)：BA0952）、0.02 mol/L PBS 緩沖液、0.1 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）（貨號(hào)：GL1721-XL）、SABC 試劑盒（貨號(hào)：QN1224）、DAB 顯色試劑盒（貨號(hào)：AR1022）均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 研究對(duì)象

選擇2016 年10 月至2019 年10 月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）牙周黏膜科診治的經(jīng)病理確診的41例OLP 患者為OLP 組，其中非糜爛型21例，糜爛型20例。排除經(jīng)期或孕期婦女，口腔檢查有炎癥及患有其他口腔黏膜病或腫瘤等，伴皮膚損傷，伴全身系統(tǒng)性疾病，局部和或全身使用過(guò)調(diào)節(jié)免疫、抗生素等相關(guān)制劑。

OLP 組男17例，女24例；年齡30～71 歲，平均（46.3±17.5）歲。另外選取同期于我院診治的10 名正?？谇火つと巳鹤鳛檎＝M，其中男6 名，女4 名；年齡25～76 歲，平均（47.1±18.2）歲。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 研究方法

所有標(biāo)本分成兩份，一份在液氮中速凍，保存于-80℃冰箱；另一份固定于10%甲醛溶液中，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色及病理診斷，病理記分（淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度輕度、中度、重度分別記1、2、3 分，基底細(xì)胞液化程度輕度、中度、重度分別記1、2、3 分）參考張?bào)懔值萚5]提出的OLP 病理記分標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 按SABC 試劑盒法步驟進(jìn)行，一抗?jié)舛确謩e為T(mén)im-3（1:100）、Gal-9（1∶200）、IFN-γ（1∶100）。每批染色陰性對(duì)照用PBS 代替，Tim-3、Gal-9、IFN-γ 分別以人淋巴結(jié)、腎組織、胰腺癌標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2 結(jié)果判定方法 Tim-3、Gal-9 陽(yáng)性表達(dá)均為細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核上呈淡黃色或棕黃色顆粒。IFN-γ陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜上呈黃色或黃褐色顆粒。采用盲法觀察每張切片的5 個(gè)高倍視野（400×），總共計(jì)數(shù)至少500 個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。Tim-3、Gal-9 參照李詠等[6]的方法，IFN-γ 參照潘玉霞等[7]的方法，每張切片最終分?jǐn)?shù)按陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度兩個(gè)參數(shù)的乘積計(jì)算，0～4 分為陰性，5～12 分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman 秩相關(guān)分析。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tim-3、Gal-9、IFN-γ 在OLP 病損區(qū)的表達(dá)

正常組口腔黏膜未見(jiàn)Tim-3 陽(yáng)性細(xì)胞。OLP 組織中上皮層的陽(yáng)性細(xì)胞為基底細(xì)胞、棘層細(xì)胞，見(jiàn)圖1A；固有層的陽(yáng)性細(xì)胞為浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞，見(jiàn)圖1B。OLP 組上皮層、固有層Tim-3 陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.48%（33/41）和85.37%（35/41），高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

OLP 組織中Gal-9 陽(yáng)性細(xì)胞主要為上皮層的棘細(xì)胞和基底細(xì)胞，見(jiàn)圖1C。OLP 組Gal-9 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率為78.05%（32/41）低于正常組的100.00%（10/10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

OLP 組IFN-γ 陽(yáng)性細(xì)胞主要為固有層內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞，見(jiàn)圖1D。OLP 組IFN-γ 陽(yáng)性表達(dá)率為73.17%（30/41），高于正常組（正常組織僅為陰性表達(dá)），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

圖1 Tim-3、Gal-9、IFN-γ 在OLP 病損區(qū)的表達(dá)（免疫組織化學(xué)SABC 法，400×）

OLP 組織中，Tim-3 表達(dá)在上皮層、固有層呈正相關(guān)（r=0.756，P=0.015）；Tim-3 與Gal-9 表達(dá)在上皮層呈負(fù)相關(guān)（r=-0.426，P ＜0.05）；Tim-3 和IFN-γ表達(dá)在固有層呈正相關(guān)（r=0.423，P ＜0.05）。

2.2 OLP 患者病理特征與Tim-3、Gal-9、IFN-γ的相關(guān)性分析

淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)記分與Tim-3 在上皮層與固有層的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.504、3690.613，P ＜0.05），與Gal-9 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.303，P ＜0.05）；基底細(xì)胞液化浸潤(rùn)記分與Tim-3 在上皮層陽(yáng)性表達(dá)、IFN-γ 陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.333、0.369，P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 OLP 患者病理特征與Tim-3、Gal-9、IFN-γ的相關(guān)性分析（例）

3 討論

本課題組前期研究結(jié)果顯示：OLP 組織病損區(qū)主要表現(xiàn)為T(mén)h1 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致Th1 和Th2 細(xì)胞之間的失衡。研究發(fā)現(xiàn)Tim-3 在活化的CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞上表達(dá)，少量也會(huì)出現(xiàn)在Th17 細(xì)胞中[2]。Tim-3 對(duì)炎癥細(xì)胞有激活作用，從而對(duì)炎癥反應(yīng)有促進(jìn)作用[8]。Tim-3 能夠使Th1 細(xì)胞發(fā)生遷移，并對(duì)細(xì)胞效應(yīng)功能發(fā)揮作用，主要表達(dá)在Th1 細(xì)胞表面[9]。研究發(fā)現(xiàn)[10]，OLP 中Th1 細(xì)胞分布的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)帶緊貼上皮基底膜。Th1 免疫應(yīng)答的調(diào)控可能是由于Tim-3的作用，Tim-3 成為一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)蛋白大量活化參與。OLP病損區(qū)固有層Th1 大量增多，促進(jìn)IFN-γ 分泌，可使淋巴細(xì)胞向上皮層入侵，大量的Tim-3+Th1 淋巴細(xì)胞出現(xiàn)在上皮層。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，支氣管上皮細(xì)胞有Tim-3 表達(dá)，能夠促進(jìn)免疫反應(yīng)[11]。Tim-3 表達(dá)在已分化的Ⅰ型CD8+Te 細(xì)胞（Tcl 細(xì)胞）表面[12]。在病毒感染中，發(fā)現(xiàn)Tim-3 能引導(dǎo)CD8+T 失活[13]。推測(cè)活化的Tim-3 促使CD8+T 失活，免疫耐受作用降低[14]。

OLP 病損區(qū)IFN-γ 表達(dá)增高。已有研究顯示，在體內(nèi)IFN-γ的分泌促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目增多，從而誘發(fā)苔蘚樣反應(yīng)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)[15-16]。Th1 細(xì)胞在OLP 病損中活化，Tim-3 被激活主要用于調(diào)控IFN-γ的分泌，發(fā)揮抑制免疫耐受的作用。

Gal-9 即Tim-3 配體，主要在巨噬細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中表達(dá)。主要在炎癥反應(yīng)的調(diào)控和介導(dǎo)細(xì)胞分化、細(xì)胞間聚集、黏附、凋亡上發(fā)揮作用[17]。以往研究發(fā)現(xiàn)[18]，體內(nèi)Th1 介導(dǎo)細(xì)胞活性功能的減少是由于Gal-9 對(duì)Th1 細(xì)胞可選擇性清除。Th1 功能效應(yīng)可能由Tim-3/Gal-9 通路調(diào)控。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞聚集和死亡的原因是由于表達(dá)在Th1 細(xì)胞的Tim-3 與Gal-9 結(jié)合，兩者結(jié)合在短時(shí)間可促進(jìn)Ca2+內(nèi)流[19]。Gal-9 末端有糖類識(shí)別域N、C，他們與Tim-3 結(jié)合時(shí)結(jié)合模式及黏附性都不一樣，N 末端糖類識(shí)別域作用為調(diào)節(jié)固有免疫，而C 末端糖類識(shí)別域作用為誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡，發(fā)揮免疫作用，可以清除Th1 細(xì)胞[20-21]。Zhu 等[22]在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中發(fā)現(xiàn)，Gal-9 可清除CD4+T 細(xì)胞從而減少I(mǎi)FN-γ 分泌，在體內(nèi)通過(guò)免疫反應(yīng)用于減輕炎癥，從而減輕病程進(jìn)展。在小鼠腎毒血清腎炎模型中，CD8+T 細(xì)胞被Gal-9 選擇性清除，可發(fā)揮介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制免疫[23]。推測(cè)OLP 局部病損中Gal-9 表達(dá)減少，其清除CD8+T 細(xì)胞能力減弱，在OLP 局部病損中CD8+T 細(xì)胞不斷增加發(fā)揮其介導(dǎo)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞作用。Gal-9 表達(dá)減少，致使Th1 細(xì)胞表面的Tim-3 與Gal-9 結(jié)合受阻，Tim-3/Gal-9 信號(hào)通路[24]阻斷無(wú)法清除Tim-3+Th1 細(xì)胞，Th1 效應(yīng)細(xì)胞持續(xù)性高應(yīng)答[25]，促進(jìn)IFN-γ 分泌。IFN-γ 可以活化角質(zhì)形成細(xì)胞上Fas 抗原表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。故推測(cè)在OLP 中基底細(xì)胞液化可能是由于IFN-γ 通過(guò)上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡引起[26]。

本研究提示OLP 患者局部病損中Tim-3/Gal-9通路異常，使Th1 效應(yīng)細(xì)胞增強(qiáng)，可能參與了OLP 病損區(qū)病理?yè)p傷過(guò)程。