徐雨璇 嚴展鵬 徐婷婷 王 培 鄭 雪 朱方石,

1.南京中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院，江蘇南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究室，江蘇南京 210028

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）指胃黏膜上皮反復受損致腺體萎縮、減少的疾病。CAG 與胃癌發(fā)病相關(guān)[1]。Notch 信號通路可以促進胃黏膜上皮細胞增殖[2-4]。細胞增殖凋亡失衡是CAG 機制之一[5]。健脾益氣方對CAG的臨床療效肯定[6-7]，能保護CAG 大鼠胃黏膜、抑制胃組織Wnt/β-catenin 及PI3K-Akt 信號通路蛋白的表達[8-10]。本研究擬通過健脾益氣方干預(yù)CAG 脾虛證大鼠，觀察其Ki67 及Notch 等信號通路相關(guān)蛋白表達，揭示健脾益氣方的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 MNNG（日本東京化成工業(yè)）；蘇木精染液（719054，珠海貝索）；伊紅染液（719062，珠海貝索）；大鼠促胃液素（EG038-18，依科賽）和生長抑素（somatostatin，SST）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（EG027-36，依科賽）；Notch1（AI10126996，Bioss），Notch2（AG09066100，Bioss），Hes1（11988S，CST）?？贵w濃度均為1∶1000。

1.1.2 藥物 雷尼替?。?50 mg/粒，上海衡山藥業(yè)，生產(chǎn)批號：200804）；替普瑞酮[50 mg/片，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，1606031]；葉酸片（5 mg/片，天津力生制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：1612054）。健脾益氣方水提液：茯苓10 g，黨參15 g，炒白術(shù)10 g，炙甘草3 g，法半夏6 g，陳皮6 g，木香10 g，砂仁6 g，莪術(shù)10 g，郁金10 g，云母石30 g，白花蛇舌草30 g（江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科）。

1.1.3 動物 健康SD 大鼠65 只，體重（230±10）g，雄性（動物質(zhì)量合格證號：SCXK2019-0001，生產(chǎn)許可證號：AEWC-20181205-65，南京藥科大學實驗動物中心）。

1.1.4 儀器 CT-9 生物組織攤烤片機、CB-08 石蠟包埋機，湖北定源醫(yī)用材料。RM2245 石蠟切片機，德國Leica。CKX31 倒置生物顯微鏡，日本Olympus。KHB ST-360酶標儀，瑞士Tecan。

1.2 研究方法

1.2.1 CAG 脾虛證大鼠模型建立及分組干預(yù) 選取55 只健康SD 大鼠自由飲食含170 μg/ml MNNG的純凈水及含0.03%雷尼替丁的大鼠飼料制造CAG 大鼠模型，造模24 周。24 周后選取5 只大鼠處死觀察其胃黏膜萎縮狀態(tài)，形成CAG 脾虛證模型[11]。剩余50 只按隨機數(shù)字表法分為健脾益氣方低[13.1 g/（kg·d）]、中[26.2 g/（kg·d）]、高劑量組[52.4 g/（kg·d）]，以及模型組（等量生理鹽水）、陽性藥組[葉酸2.7 mg/（kg·d）+替普瑞酮13.5 mg/（kg·d）]，每 組 各10 只，另 取10 只健康SD 大鼠作為空白組（等量生理鹽水）。六組均灌胃干預(yù)8 周，記錄其狀態(tài)和體重。

1.2.2 標本的采集 8 周后，每組取5 只進行標本采集。采用10%水合氯醛進行麻醉（0.3 ml/100 g），腹主動脈取血3～6 ml，靜置2 h 后離心5 min（3000 r/min，離心半徑為13.5 cm），取上層血清，-80°C 儲存。取胃底、胃竇、胃體組織各1 塊，甲醛固定。

1.2.3 HE 染色 切片依次浸入二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水后蘇木精染色3 min，清洗，分化5 s，清洗，梯度乙醇脫水，伊紅染色15 s，95%、100%乙醇各5 min，二甲苯5 min，封片。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗 標準孔10 孔梯度稀釋，樣本孔中加入待測血清40 μl 及促胃液素、SST 一抗10 μl，封膜。震蕩后37℃孵育1 h。洗板30 s 共3 次。加鏈霉素-辣根過氧化物酶50 μl，封膜，37℃孵育1 h。37℃避光顯色15 min。每孔加入50 μl 終止液。酶標儀檢測450 nm 波長處吸光度，繪制標準曲線。

1.2.5 免疫組織化學染色 將切片放入二甲苯中5 min共2 次脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水清洗；抗原修復液中沸騰持續(xù)10 min；清洗，雙氧水10 min，封閉1 h；一抗4℃過夜；磷酸鹽吐溫緩沖液清洗，二抗室溫1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液清洗，DAB 顯色；蘇木精復染30 s，清洗，分化，返藍，清洗。浸入梯度乙醇、二甲苯，封片。Ki67、蛋白表達量采用Image-ProPlus 6.0 計算其光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 六組一般情況及體重比較

空白組毛色白有光澤，活動積極。模型組毛色黃易脫落，活動量減少。陽性藥組及健脾益氣方低、中、高劑量組毛光亮，活動量高。模型組體重低于空白組，健脾益氣方中、高劑量組體重高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表1。

表1 六組體重比較（g，）

表1 六組體重比較（g，）

注：與空白組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05

2.2 六組胃黏膜HE 染色情況

空白組胃黏膜上皮層次清楚，腺體正常。模型組胃黏膜上皮變薄，腺體減少，排列疏松、雜亂，可見杯狀細胞。其余四組胃黏膜上皮增厚，腺體增加，排列趨向整齊，炎癥細胞浸潤減少，健脾益氣方中劑量組最近似空白組。見圖1。

圖1 六組胃黏膜HE 染色情況（100×）

2.3 六組血清促胃液素、SST 水平比較

模型組血清促胃液素、SST 水平均低于空白組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。健脾益氣方高劑量組血清促胃液素水平高于模型組，健脾益氣方低、中、高劑量組SST 水平均高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表2。

表2 六組血清促胃液素、SST 水平比較（pg/ml，）

表2 六組血清促胃液素、SST 水平比較（pg/ml，）

注：與空白組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。SST：生長抑素

2.4 六組胃組織Ki67 蛋白表達情況

模型組Ki67 表達呈淺棕色，其余五組均呈黃棕色，見圖2（封三）。模型組Ki67 蛋白表達量低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。健脾益氣方低劑量組Ki67 蛋白表達量高于模型組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見表3。

表3 六組胃組織Ki67 蛋白表達量比較（）

表3 六組胃組織Ki67 蛋白表達量比較（）

注：與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bbP ＜0.01

圖2 六組胃組織Ki67 蛋白表達情況（免疫組織化學，100×）

2.5 六組胃組織Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表達情況

模型組Notch1、Notch2、Hes1 蛋白呈淺褐色，其余五組呈深褐色，見圖3～5（封三、封四）。模型組Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表達量均低于空白組，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。健脾益氣方低、中、高劑量組Notch1、Notch2 蛋白表達量均高于模型組，健脾益氣方高劑量組Hes1 蛋白表達量高于模型組，差異竣工有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表4。

表4 六組胃組織Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表達量比較（）

表4 六組胃組織Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表達量比較（）

注：與空白組比較，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01

圖3 六組胃組織Notch1 蛋白表達情況（免疫組織化學，100×）

圖4 六組胃組織Notch2 蛋白表達情況（免疫組織化學，100×）

3 討論

CAG 屬中醫(yī)“胃痞”“嘈雜”等范疇[12]，脾胃虛弱是主要病機，健脾益氣為主要治法[13]。胃黏膜損傷是脾虛的主要原因，脾虛的狀態(tài)為胃黏膜損傷提供了客觀條件，這一惡性循環(huán)加重了脾虛的病理改變[14]，“從脾虛論治”CAG的治則觀具有理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。

健脾益氣方由黨參、炒白術(shù)、茯苓、炙甘草、陳皮、法半夏、木香、砂仁、莪術(shù)、白花蛇舌草、云母石、郁金組成。黨參性平，與炒白術(shù)、茯苓、炙甘草合用益氣健脾；半夏、陳皮、砂仁、木香理氣化痰；莪術(shù)、郁金活血消積、行氣止痛；云母去瘀生新[15]；白花蛇舌草抗癌變[16]。諸藥合用，共奏健脾益氣，活血行氣之功[13]。

本研究結(jié)果顯示，健脾益氣方低、中、高劑量組一般狀態(tài)、體重較模型組均改善，以中、高劑量組優(yōu)勢顯著。促胃液素由G 細胞分泌，對胃腸道黏膜具有營養(yǎng)作用[17]；SST 由D 細胞分泌，可以減輕細胞脂質(zhì)過氧化，是胃黏膜防御機制之一[18]。在萎縮和腸化階段，促胃液素與SST 分泌呈下降趨勢[19-21]。健脾益氣方高劑量組促胃液素高于模型組，健脾益氣方三組SST 均高于模型組，提示其可以修復CAG 大鼠胃黏膜損傷。

胃黏膜細胞增殖是導致CAG 病理改變的核心因素之一，在CAG 發(fā)展進程中胃黏膜細胞增殖會出現(xiàn)被抑制的狀態(tài)[22-23]。Ki67 可評估細胞增殖水平。本研究顯示，模型組Ki67 表達下降，用藥干預(yù)促進了Ki67的表達，以健脾益氣方低劑量組為優(yōu)，提示健脾益氣方能改善CAG 胃黏膜上皮細胞增殖阻滯，促進胃黏膜正常細胞的增殖，有利于萎縮的胃黏膜腺體修復。

Notch 信號通路是控制細胞增殖、分化和凋亡的核心途徑[24]，由受體（Notch）和配體（Jagged、DLL）及靶基因Hes1 等組成[25-26]。Notch1、Notch2 能促進胃黏膜細胞增殖[2-4]，而胃黏膜細胞增殖被抑制與CAG的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[22-23]。據(jù)此推測，Notch 信號通路蛋白表達下降導致的細胞增殖阻滯是胃黏膜萎縮和腸上皮化生的機制之一。本研究示，健脾益氣方可以促進Notch1、Notch2 及Hes1的表達，以促進胃黏膜上皮細胞增殖，從而改善胃黏膜萎縮的病理改變。但中藥不同劑量組間尚未顯示出明顯差異。本研究為解釋健脾益氣方對CAG 療效的作用機制提供了一定的科學依據(jù)，至于健脾益氣方在Notch 等信號通路中發(fā)生分子調(diào)節(jié)作用的具體過程，有待進一步深入研究。