李 雙，鄢必新，張 穎，田淋淋，張 斌，李 敏，徐 建*

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開(kāi)發(fā)有限公司，吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130103；2.修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，通化134000）

精制冠心片處方由丹參、川芎、赤芍、紅花、降香5味中藥組成，具有活血化瘀的功效，用于淤血內(nèi)停所致的胸痹，癥見(jiàn)胸悶、心前區(qū)刺痛；冠心病心絞痛見(jiàn)上述候癥者。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層色譜法對(duì)丹參、赤芍、川芎、紅花進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法對(duì)丹參中丹酚酸B、丹參酮ⅡA和赤芍中芍藥苷進(jìn)行定量分析；為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證產(chǎn)品療效，對(duì)《中國(guó)藥典》中檢測(cè)方法進(jìn)行再評(píng)價(jià)研究，并對(duì)其未收載的降香進(jìn)行薄層鑒別研究，以有效控制其產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安U3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司）；MS205DU型電子天平（梅特勒-托利多公司）；SB25-12DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；薄層色譜攝影儀SLD-1（天津思利達(dá)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）。

1.2 試劑與試藥

1.2.1試藥

精制冠心片（批號(hào)：01-03糖衣片、04-06薄膜衣片），均由修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供；對(duì)照品來(lái)源：丹參對(duì)照藥材（批號(hào)：120923-201615）、川芎對(duì)照藥材(批號(hào)：120918-201411)、紅花對(duì)照藥材(批號(hào)：120907-200609)、降香對(duì)照藥材（批號(hào)：120952-200506）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201438）、丹參酮ⅡA對(duì)照品（批號(hào)：110766-201721）、丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：111562-201716）以上均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2.2 試劑

乙醚、乙酸乙酯、石油醚（60~90℃）、甲醇、正己烷、甲苯、正丁醇、丙酮、甲酸、硫酸、乙醇、磷酸、三氯甲烷、三氯化鋁、香草醛等均為分析純，乙腈為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參的薄層鑒別

取本品5片，糖衣片除去糖衣，研細(xì)，加乙醚20ml，超聲處理15分鐘，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴ml使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對(duì)照藥材0.2g，加甲醇2ml，超聲處理10分鐘，靜置，取上清液作為對(duì)照藥材溶液。再取缺丹參陰性樣品，同供試品方法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60~90℃）-乙酸乙酯（8∶3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。在日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)。陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 丹參薄層色譜圖

2.2 川芎的薄層鑒別

取川芎對(duì)照藥材0.2g，加甲醇2ml，超聲處理10分鐘，靜置，取上清液作為對(duì)照藥材溶液。另取缺川芎陰性樣品，同（2.1）供試品制備方法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取［鑒別］2.1項(xiàng)下的供試品溶液及上述對(duì)照藥材溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-甲苯-乙酸乙酯(9∶2∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 川芎薄層色譜圖

2.3 紅花的薄層鑒別

取本品15片，糖衣片除去糖衣，研細(xì)，加甲醇30ml，搖散，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0ml，加熱攪拌使溶解，放冷，以脫脂棉濾過(guò)，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，加水15ml洗滌，取正丁醇液回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0ml，加熱約3分鐘，充分?jǐn)嚢枋谷芙猓爬?，以少量脫脂棉濾過(guò)，濾液加于聚酰胺柱（2g，80~100目，柱內(nèi)徑為1.5~2cm，干法裝柱）上，依次以水25ml、20%甲醇15ml洗脫，合并上述兩種洗脫液，備用，繼以75%甲醇30ml洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取紅花對(duì)照藥材0.2g，加甲醇10ml，超聲處理15分鐘，濾過(guò)，濾液回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，以脫脂棉濾過(guò)，濾液自“加于聚酰胺柱........”起同法制成對(duì)照藥材溶液。再取缺紅花陰性樣品，同供試品方法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（6∶3∶0.3∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以含2%三氯化鋁的10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在紫外光（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 紅花薄層色譜圖

2.4 赤芍的薄層鑒別

?。?.3）項(xiàng)下的備用洗脫液，用水飽和正丁醇20ml振搖提取，分取正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺赤芍陰性樣品，同供試品制備方法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 赤芍薄層色譜圖

2.5 降香鑒別方法摸索

2.5.1 色譜條件選擇

參照中國(guó)藥典2020年版有關(guān)降香及其他文獻(xiàn)對(duì)降香的薄層鑒別方法進(jìn)行摸索，具體試驗(yàn)及結(jié)果如下。

2.5.2 條件篩選

2.5.2.1 供試品制備方法篩選

方法一：取本品5片，糖衣片除去糖衣，研細(xì)，加甲醇30ml，超聲30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解作為供試品溶液（1）。另取降香對(duì)照藥材0.5g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取缺降香陰性樣品，同供試品制備方法制成陰性樣品溶液。

方法二：取本品5片，糖衣片除去糖衣，研細(xì)，加70%乙醇，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?ml使溶解作為供試品溶液（2）。另取降香對(duì)照藥材0.5g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取缺降香陰性樣品，同供試品制備方法制成陰性樣品溶液。

2.5.2.2 色譜條件篩選

照薄層色譜法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取上述供試品溶液（1）及相應(yīng)的對(duì)照藥材、陰性樣品溶液及供試品溶液（2）及相應(yīng)的對(duì)照藥材、陰性樣品溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，再分別以甲苯-乙醚-三氯甲烷（7∶2∶1）、石油醚（60~90℃）-乙酸乙酯（16∶3）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶10∶2）、甲苯-乙酸乙酯（2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光（365nm）下檢視。

2.5.2.3 結(jié)果

上述供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，但陰性樣品均有干擾，專屬性不強(qiáng)，故降香的薄層鑒別未收載于精制冠心片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下。

2.6 丹參、赤芍的含量測(cè)定

2.6.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；芍藥苷、丹酚酸B檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，丹參酮ⅡA檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于8000。

時(shí)間（分鐘） 流動(dòng)相A（%） 流動(dòng)相B（%）0~20 14 86 20~30 14→19 86→81 30~43 19→20 81→80 43~70 20→24 80→76 70~77 24 76 77~78 24→75 76→25 78~92 75 25 92~100 75→90 25→10

2.6.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取芍藥苷對(duì)照品、丹酚酸B對(duì)照品、丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每lml各含芍藥苷80μg、丹酚酸B 0.16mg、丹參酮ⅡA10μg的混合溶液，即得。

2.6.1.2供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，精密加入75%甲醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率400W，頻率40kHZ）40分鐘，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.6.1.3 陰性樣品溶液的制備

取按處方比例缺丹參的陰性對(duì)照樣品和按處方比例缺赤芍的陰性對(duì)照樣品，按“2.6.1.2”項(xiàng)下方法分別制備丹參、赤芍陰性樣品溶液。

2.6.1.4 測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定。

2.6.2 線性關(guān)系考察

取芍藥苷對(duì)照品溶液，濃度分別為0.0163、0.0490、0.0817、0.1144、0.1470mg/ml。精密吸取上述對(duì)照品溶液各5μl，分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=24.906x-0.9882，r=0.9998。表明芍藥苷在0.1785~3.57μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

取丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液，濃度分別為0.0024、0.0071、0.0119、0.0190、0.0238mg/ml。精密吸取上述對(duì)照品溶液各5μl，分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=106.96x-0.5349，r=0.9997。表明丹參酮ⅡA在0.0297~0.5944μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

取丹酚酸B對(duì)照品溶液，濃度分別為0.0059、0.0177、0.0294、0.0412、0.0530mg/ml。精密吸取上述對(duì)照品溶液各5μl，分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=32.757x-0.368，r=0.9998。表明丹酚酸B在0.1462~2.9234μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.6.3 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取“2.6.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各5μl，注入液相色譜儀，依法測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照樣品的色譜圖中，在與芍藥苷、丹參酮ⅡA、丹酚酸B對(duì)照品吸收峰保留時(shí)間的相應(yīng)位置上，無(wú)吸收峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾，此方法專屬性強(qiáng)。詳見(jiàn)圖5~11。

圖5 230nm-混合對(duì)照品

圖6 230nm-供試品

圖7 230nm-赤芍陰性（芍藥苷）

圖8 230nm-丹參陰性（丹酚酸B）

圖9 270nm-混合對(duì)照品（C丹參酮ⅡA對(duì)照品）

圖10 270nm-供試品

圖11 270nm-丹參陰性（丹參酮ⅡA）

2.6.4 精密度試驗(yàn)

取芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次5μl，結(jié)果芍藥苷峰面積RSD=0.91%（n=6），丹酚酸B峰面積RSD=0.24%（n=6），丹參酮ⅡA峰面積RSD=0.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24h按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果芍藥苷RSD=1.14%、丹酚酸B RSD=0.90%、丹參酮ⅡA RSD=0.12%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（01批）適量，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，共6份，按“2.6.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA含量。結(jié)果芍藥苷的平均含量為7.85mg/g，RSD=0.37%，丹酚酸B平均含量為11.44mg/g，RSD=0.38%（n=6），丹參酮ⅡA平均含量為1.20mg/g，RSD=0.31%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.6.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量（芍藥苷含量7.85mg/g、丹酚酸B含量11.44mg/g、丹參酮ⅡA含量1.20mg/g）的同一批供試品（01批）粉末共6份，每份約0.25g，分別精密加入適量混合對(duì)照品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA平均回收率分別為99.08%、98.76%、99.12%，RSD值分別為0.62%、0.48%、0.65%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6.8 樣品含量測(cè)定

依“2.6.1”項(xiàng)下方法對(duì)上述6批精制冠心片（批號(hào)：01-06）進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本次研究對(duì)方中各藥味進(jìn)行了較系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，采用薄層色譜法對(duì)制劑中的丹參、赤芍、川芎、紅花、降香進(jìn)行定性鑒別研究，結(jié)果表明丹參、川芎、紅花、赤芍薄層色譜鑒別方法重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，可以列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，降香薄層色譜鑒別陰性有干擾，專屬性較差，故未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，對(duì)丹參中有效成分丹酚酸B、丹參酮ⅡA和赤芍中有效成分芍藥苷進(jìn)行定量分析研究。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，方法可行、精密度高、重現(xiàn)性好，可準(zhǔn)確有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。本次質(zhì)控方法再評(píng)價(jià)研究，為精制冠心片質(zhì)量控制方法提供了一定數(shù)據(jù)支持，具有重要研究和應(yīng)用價(jià)值，并能更加全面地把控精制冠心片的質(zhì)量。