劉孟楠，羅 鋼，何清位，劉 平，劉 顏，楊思進(jìn)*

（1.國(guó)家中醫(yī)藥臨床研究基地及心血管內(nèi)科，西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，瀘州646000；2.澳門(mén)科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，氹仔999078）

慢性心臟病是目前最常見(jiàn)的重大疾病之一。2019年發(fā)布的《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告》顯示2017年我國(guó)心血管疾病死亡人數(shù)占比高達(dá)31%[1]。心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是慢性心臟病的主要病理改變，表現(xiàn)為心肌成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積[2]。MF不僅是導(dǎo)致心力衰竭的一個(gè)主要原因，而且與心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān)。目前常規(guī)治療方案雖能緩解慢性心臟病的臨床癥狀，但由于引起心肌纖維化的因素繁多、機(jī)制欠清，尚缺乏有效阻逆心肌纖維化的藥物[3]。近年來(lái)中醫(yī)藥治療MF的實(shí)驗(yàn)研究不斷深入，阻止甚至逆轉(zhuǎn)MF的發(fā)展是研究的一致目標(biāo)，分子生物水平及基因領(lǐng)域的探索也日趨深入。MF的中醫(yī)病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)、久病入絡(luò)，本虛為陰陽(yáng)虧虛，標(biāo)實(shí)為痰濁、瘀血等[4]。人參是常見(jiàn)的滋補(bǔ)類(lèi)藥物，在虛癥及急癥中運(yùn)用廣泛，其提取物人參皂苷及多糖等為主要有效成分，其有效成分在治療MF方面療效顯著[5-7]。

中草藥人參為五加科植物人參（Panax ginsengC.A.Mey）的根，是補(bǔ)氣的常用藥物。人參因集中制作的方法、栽培技術(shù)不同、產(chǎn)地區(qū)別而有別直參（朝鮮參、高麗參）野山參、紅參等不同名稱(chēng)[8]?！叭藚⑽陡剩餮a(bǔ)五臟、安精神、定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目、開(kāi)心、益智，久服輕身延年”是《神農(nóng)本草經(jīng)》對(duì)人參功效的描述[9]?！侗静菥V目》亦記載人參能“治男女一切虛癥”[10]。人參在食療保健上可調(diào)理亞健康狀態(tài)，是一種滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥，現(xiàn)代研究表明人參對(duì)于治療心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)衰弱癥、癌癥等均有一定的療效[11-13]。雖然人參在治療心衰、心肌病及改善MF上具有比較明確的效果，但其潛在的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究探討。

由于中藥多成分、多途徑和多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，很難明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，其作用機(jī)制的研究主要停留在療效性指標(biāo)層面，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的研究較少。因此，本研究旨在運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法尋找人參中具有類(lèi)藥性、口服吸收較好的成分，并預(yù)測(cè)這些成分治療MF的作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，為深入研究人參及其中藥復(fù)方治療MF的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 人參化學(xué)成分的收集和篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology Platform，TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php）是基于系統(tǒng)藥理學(xué)收錄《中國(guó)藥典》收錄的中藥材的作用靶點(diǎn)、成分、藥物關(guān)鍵參數(shù)的平臺(tái)，可用于中藥材藥動(dòng)學(xué)、靶標(biāo)預(yù)測(cè)等分析，借助平臺(tái)信息可以從整體水平研究藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和疾病網(wǎng)絡(luò)，從而揭示中藥性質(zhì)與作用機(jī)制[14]。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取人參的化學(xué)成分，輸入關(guān)鍵詞“人參”，得到活性成分信息。本研究通過(guò)篩選出同時(shí)滿(mǎn)足生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類(lèi)藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18的化學(xué)成分以及文獻(xiàn)報(bào)道的有活性的成分。

1.2 預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出人參的活性成分的作用靶點(diǎn)，作為候選藥物靶點(diǎn)。然后，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）將所的藥物靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成基因名稱(chēng)[15]。以“myocardial fibrosis”為關(guān)鍵詞，通過(guò)在GeneCards（https://www.genecards.org/）收集與MF相關(guān)的基因，將挖掘得到的MF相關(guān)基因與藥物靶點(diǎn)基因映射篩選出共同靶點(diǎn)，從而得到人參活性成分治療MF的目標(biāo)作用靶點(diǎn)。

1.3 活性成分-疾病靶點(diǎn)構(gòu)建

將候選化學(xué)成分與MF靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape3.8.2建立人參的化合物-MF靶點(diǎn)群網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)（node）代表藥物化學(xué)成分與潛在作用靶點(diǎn)；邊（edge）展現(xiàn)了人參有效成分和其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，根據(jù)化合物與靶點(diǎn)連接情況篩選出人參作用于MF的關(guān)鍵化合物。

1.4 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為分析人參治療MF靶蛋白之間的相互作用，以STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)（https://string-db.org/）構(gòu)建人參治療MF靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)。將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)為“homo sapiens”（人類(lèi)），最低相互作用閾值設(shè)為中等置信度0.4“medium confidence”，勾選“hide disconnected nodes in the network”以隱藏游離點(diǎn)，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，結(jié)果保存成PNG及TSV格式。TSV文件與R語(yǔ)言鏈接并使用barplot包進(jìn)行編譯，以各基因連接節(jié)點(diǎn)數(shù)量為變量繪制PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因柱狀圖。

1.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析

將藥物-疾病交集基因?qū)隓AVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），輸入靶基因名稱(chēng)列表，限定物種為“Homo Sapiens”，將靶點(diǎn)基因修正為官方名稱(chēng)，得到基因的ID，設(shè)定閾值P＜0.05，進(jìn)行基因本體（Gene Onotology，GO）生物過(guò)程富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，結(jié)果用R語(yǔ)言制作柱狀圖及氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 候選化合物及靶點(diǎn)的篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得化合物190個(gè)，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為篩選條件，得到候選成分21個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表1。逐一對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，得到256個(gè)靶點(diǎn)。

表1 人參候選化合物成分

2.2 疾病靶點(diǎn)獲取結(jié)果

從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到個(gè)3125個(gè)MF相關(guān)靶點(diǎn)基因。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果

將256個(gè)化合物靶點(diǎn)與3125個(gè)MF相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到38個(gè)共同靶點(diǎn)基因，對(duì)應(yīng)人參17個(gè)候選化合物。利用cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建中藥化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 人參有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

藍(lán)色橢圓形為藥物，紅色菱形為疾病，綠色六邊形為藥物，紫色三角形為藥物有效成分。

2.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將映射得到的38個(gè)交集靶點(diǎn)基因?qū)隨TRINGS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2示，除去1個(gè)游離節(jié)點(diǎn)后，PPI網(wǎng)絡(luò)包含37個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn)，共有151條邊代表了蛋白之間互作用，處于該蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中心的蛋白質(zhì)包括B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL2），含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)1/3/8/9，絲裂原激活蛋白激酶8（Recombinant Mitogen Activated Protein Kinase 8，MAPK8）和B細(xì)胞κ輕肽基因增強(qiáng)子核因子抑制因子（αnuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in Bcells inhibitor，NFKBIA）等，這些關(guān)聯(lián)的基因或蛋白可能是人參治療MF的重要靶點(diǎn)。這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中非常重要，通過(guò)計(jì)算每個(gè)因的連接節(jié)點(diǎn)數(shù)目，找出前15個(gè)PPI核心基因，這些即為人參治療MF的核心基因。詳見(jiàn)圖3。

圖2 人參治療MF靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 PPI核心基因

2.5 GO功能分析

38個(gè)藥物-疾病交集基因影響了78個(gè)生物學(xué)過(guò)程（P＜0.05），選取P值排名前20的功能信息，詳見(jiàn)表2，圖4。圖表結(jié)果顯示，人參的活性成分主要富集在核受體的活動(dòng)，配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號(hào)通路，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過(guò)程，轉(zhuǎn)錄輔激活結(jié)合，G蛋白偶聯(lián)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性，類(lèi)固醇結(jié)合，神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)，轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合，G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等方面。

表2 藥物-疾病交集基因具有的功能信息

圖4 GO功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG富集通路分析

結(jié)果通路富集分析發(fā)現(xiàn)，該38個(gè)靶點(diǎn)顯著富集在88條通路上（P＜0.05），其中20條通路與MF密切相關(guān)。詳見(jiàn)圖5，其中，主要通路包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路，弓形體病通路，流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路，前列腺癌通路，糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路，乙型肝炎通路，甲型流感通路，細(xì)胞凋亡通路，麻疹通路，軍團(tuán)病通路等，提示人參可以通過(guò)以上多條通路作用于MF。得到相關(guān)的通路圖，詳見(jiàn)圖6。

圖5 人參治療MF關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路富集信息氣泡圖圓點(diǎn)越大，富集基因數(shù)目越多

圖6 人參治療MF的相關(guān)通路

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出人參中21個(gè)活性成分，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到3125個(gè)MF的相關(guān)靶點(diǎn)，通過(guò)映射找到了17個(gè)與MF直接相關(guān)的化合物及38個(gè)藥物與疾病共同直接作用的蛋白靶點(diǎn)，構(gòu)建了“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，明確了相關(guān)蛋白靶點(diǎn)的功能類(lèi)別及參與改善MF作用的信號(hào)通路。GO功能富集分析結(jié)果顯示，人參改善MF的基因功能主要體現(xiàn)涉及核受體的活動(dòng)，配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號(hào)通路，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過(guò)程，轉(zhuǎn)錄輔激活結(jié)合，G蛋白偶聯(lián)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性，類(lèi)固醇結(jié)合，神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)，轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合，G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等生物過(guò)程，這與MF及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展都有一定的聯(lián)系。通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，我們發(fā)現(xiàn)這些蛋白之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系，因此靶點(diǎn)之間的相互作用調(diào)節(jié)可能是人參治療MF的潛在機(jī)制之一。另外，通過(guò)David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這38個(gè)蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，我們得到P＜0.05的信號(hào)通路，KEGG富集通路分析發(fā)現(xiàn)88條通路與MF發(fā)病顯著相關(guān)，包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路，弓形體病通路，流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路，前列腺癌通路，糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路，乙型肝炎通路，甲型流感通路，細(xì)胞凋亡通路，麻疹通路和軍團(tuán)病通路等。

引起慢性心臟病的因素頗多，其中，高血壓是最重要和最常見(jiàn)因素[16]。目前認(rèn)為，高血壓和腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）的激活是慢性心衰心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的主要因素[2]。臨床防治心肌纖維化主要依賴(lài)抗高血壓藥物，RAS抑制劑及他汀類(lèi)藥物[17]。雖然這些藥物可一定程度上改善MF，但仍存在諸多不良反應(yīng)或禁忌癥。如沙庫(kù)巴曲纈沙坦鈉片可加重阿爾茲海默癥病情，ACEI類(lèi)藥物禁用于高血肌酐及高血鉀患者[18]。目前針對(duì)MF的新型藥物如尼達(dá)尼布、波生坦等，雖有基礎(chǔ)研究證實(shí)其可抑制MF的進(jìn)展，但還缺少大型循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)[19]。中醫(yī)藥在治療高血壓心肌病、心力衰竭、心肌缺血等慢性心臟病具有巨大優(yōu)勢(shì)，從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)獲得靈感并取得現(xiàn)代循證醫(yī)學(xué)的支持是推動(dòng)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展方向[20]。歷代醫(yī)家的記載及現(xiàn)代藥理研究均表示人參的藥用及保健價(jià)值在治療MF中具有巨大的潛力。

MF是因持續(xù)性或反復(fù)加重的心肌缺血缺氧所產(chǎn)生的心肌病理改變，亦是多種慢性心臟病的共同結(jié)局，分子層面上表現(xiàn)為纖維細(xì)胞外基質(zhì)膠原分泌增加、降解減少，以膠原（Collagen）Ⅰ/Ⅲ比例失調(diào)以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積為主要特征[2]。MF具有雙重特性，一方面，其保證了因?yàn)楦鞣N原因?qū)е碌男募p傷后，心肌仍最大限度保持原有結(jié)構(gòu)與功能，是某種意義上的“瘢痕修復(fù)”。另一方面，過(guò)度的MF會(huì)導(dǎo)致心室僵硬度增加，造成心律失常，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，極大地影響心臟的收縮和舒張功能，最終導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降、心力衰竭[16]。心肌纖維化形成機(jī)制非常復(fù)雜，尚未完全闡明。比如血液動(dòng)力學(xué)障礙導(dǎo)致壓力過(guò)負(fù)荷、長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)、代謝毒素影響、腎素-血管緊張素的激活、各種生長(zhǎng)因子的異常分泌及氧化應(yīng)激、多條信號(hào)通路的激活等，上述諸多因素均參與了MF的發(fā)生發(fā)展[2]。本研究通過(guò)GO功能分析發(fā)現(xiàn)38個(gè)藥物-疾病交集基因影響了78個(gè)生物學(xué)過(guò)程，該38個(gè)靶點(diǎn)顯著富集在88條通路上，其中包括對(duì)器官纖維化研究較為深入的腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路，核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通路，核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體（NOD-like receptor，NLR）信號(hào)通路，網(wǎng)絡(luò)樣受體（toll-like receptor，TLR）信號(hào)通路，PI3K/Akt信號(hào)通路，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，RAS信號(hào)通路等，而目前對(duì)于器官纖維化聯(lián)系最為直接的TGF-β/Smad信號(hào)通路未列其中，但通過(guò)查閱人參相關(guān)提取物對(duì)于纖維化疾病的研究亦可發(fā)現(xiàn)其對(duì)該通路具有調(diào)控作用，考慮與通路之間相關(guān)下游蛋白的交叉有關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)TNF信號(hào)通路對(duì)MF具有顯著的影響。TNF-α是重要的促炎性細(xì)胞因子，作為激活細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要介質(zhì)，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。NF-κB是調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，活化后能調(diào)控包括TNF-α在內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，作為炎性反應(yīng)的整合者在免疫調(diào)節(jié)和炎癥發(fā)生過(guò)程中具有重要作用[22]。本研究亦發(fā)現(xiàn)人參提取物對(duì)于炎癥相關(guān)信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用。

MF在中醫(yī)學(xué)中可根據(jù)其臨床表現(xiàn)歸屬于“心衰”“心悸”“胸痹”等范疇[5]。導(dǎo)致MF的病因多樣，病機(jī)有別故存在諸多證型，需選擇不同治則來(lái)進(jìn)行治療。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為該病的病機(jī)多以肝腎虧虛為本，痰瘀互結(jié)為標(biāo)，故多采用補(bǔ)益肝腎、化痰祛瘀等方法治療[23]。人參作為滋補(bǔ)強(qiáng)壯之要藥多用于虛癥的補(bǔ)益之法，大量的基礎(chǔ)研究證實(shí)人參提取物豆甾醇、山柰酚、人參二醇及人參皂苷等均具有保護(hù)受損心肌、抑制心肌纖維化的作用。此外還有很多中藥的有效成分例如小檗堿、熊果酸、白藜蘆醇等被證實(shí)具有抑制MF的作用[5]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)人參活性成分和MF進(jìn)行靶標(biāo)挖掘和通路分析，預(yù)測(cè)出人參治療MF可能存在的17個(gè)化合物，38個(gè)靶點(diǎn)及88條潛在的通路，初步揭示了人參治療MF的作用機(jī)制，證實(shí)了中藥治療疾病的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為其后續(xù)基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)提供依據(jù)和方向。然而僅利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究人參的活性成分和作用靶點(diǎn)，可能存在相當(dāng)?shù)木窒扌?，如原始信息?lái)源于不一致，各數(shù)據(jù)庫(kù)存在的各種差異等，因此，未來(lái)還需大量基礎(chǔ)研究來(lái)驗(yàn)證本次研究成果。