陶淑芳，別延紅（通訊作者），蔡 靜，金瓊燕，范 紅

（上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院病理科 上海 201805）

激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4（AP4）/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白4（TFAP4）是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸-拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，其最初被鑒定為與SV40 啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白。后來，AP4 被表征為c-Myc 轉(zhuǎn)錄因子的靶標(biāo)，c-Myc轉(zhuǎn)錄因子是在大多數(shù)腫瘤中被激活的原型致癌基因的產(chǎn)物[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，AP4 可能代表c-Myc 和N-Myc 下游的中央樞紐，介導(dǎo)它們的某些功能，例如增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。AP4 表達(dá)升高與多種腫瘤類型的癌癥進(jìn)展和患者預(yù)后不良相關(guān)[3-4]。小鼠中AP4 的缺失表明AP4在控制特性，腫瘤起始和適應(yīng)性免疫中的作用。子宮內(nèi)膜癌是危害女性健康的一種重要腫瘤，且近年來發(fā)病率逐年增加。我們課題組前期進(jìn)行了一些AP4 與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系的基礎(chǔ)研究，如AP4 對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡和惡性轉(zhuǎn)化等的影響等[5]，然而，目前AP4 基因在子宮內(nèi)膜癌中研究極少，其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用也尚不清楚。在這里，我們將初步探討AP4 基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響及其對(duì)一些EMT 相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。

1.資料與方法

1.1 一般資料

AP4 真核表達(dá)載體pez-M02-AP4 由廣州復(fù)能基因構(gòu)建，對(duì)照組質(zhì)粒為pez-M02。子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa 購買自上海蓋寧生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 及Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自賽默飛世爾。AP4 抗體購自Sigma 公司。Trizol 試劑及PCR 試劑盒購自大連Takara 公司。增殖檢測(cè)試劑盒來自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

基因轉(zhuǎn)染：Lipo3000 脂質(zhì)體試劑盒轉(zhuǎn)染AP4 基因入子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，分為對(duì)照組及AP4 組。參照Lipo3000 試劑盒說明書，DNA 與lipo3000 的比例是1μg ∶2μL。

RNA 及蛋白檢測(cè)：基因轉(zhuǎn)染48 h 后，分別收集細(xì)胞。Trizol 法提取RNA。RT-Real time PCR 法檢測(cè)mRNA 水平改變，Western blot 電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)。其中AP4 基因的引物序列為：F：GAGGGCTCTGTAGCCTTGC，R：GAATCCCGCGTTGATGCTCT。E-鈣黏蛋白的引物序列：F：CGAGAGCTACACGTTCACGG；R：GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG.Vimentin 的引物序列：F：GACGCCATCAACACCGAGTT；R：CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT。

細(xì)胞增殖測(cè)定：將基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h，胰酶消化收取細(xì)胞并計(jì)數(shù)，然后鋪于96 孔板，密度2.5×104/mL。在基因轉(zhuǎn)染后24 h，48 h 及72 h 加入10 μL/孔CCK-8 試劑。繼續(xù)孵育1 ～2 h，而后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值。設(shè)定的測(cè)定波長(zhǎng)是450 nm，參比波長(zhǎng)是630 nm，計(jì)算分析增殖數(shù)據(jù)。

2.結(jié)果

首先，我們利用lipo3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pez-M02-AP4質(zhì)粒入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，提取RNA 和蛋白進(jìn)行PCR 及蛋白電泳實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)錄水平，AP4 組mRNA 表達(dá)較對(duì)照組升高約3.756 倍（見圖1）；在蛋白水平，AP4 組則檢測(cè)到明確的蛋白表達(dá)（見圖2），顯示基因轉(zhuǎn)染成功。

圖1 AP4 基因轉(zhuǎn)染上調(diào)AP4 的mPNA 表達(dá)

圖2 AP4 基因轉(zhuǎn)染上調(diào)AP4 的蛋白表達(dá)

我們進(jìn)一步利用CCK-8 法測(cè)定了AP4 基因?qū)?xì)胞增殖的影響。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，AP4 組與對(duì)照組相比，在24 h，48 h，72 h，AP4組細(xì)胞增殖增加約17.95%（P＜0.05），26.45%（P＜0.05），21.38%（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 AP4 基因促進(jìn)癌細(xì)胞增值

在對(duì)EMT 相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)控方面，AP4 組與對(duì)照組相比，E-cadherin的mRNA下調(diào)約40.80%（P＜0.01）（見圖4），vimentin（絲蛋白）則上調(diào)約71.10%（P＜0.01）（見圖5）。表明其具有潛在的促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。

圖4 AP4 基因下調(diào)的E-cadherin 的mPNA 表達(dá)

圖5 AP4 基因上調(diào)vimentin 的mPNA 表達(dá)

3.討論

最近的許多研究表明，AP4 在多種類型的腫瘤中高表達(dá)，包括乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，胃癌，胰腺癌，前列腺癌，非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞癌等[1-2,6-9]。AP4 的表達(dá)是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，可根據(jù)轉(zhuǎn)移情況預(yù)測(cè)總體生存時(shí)間和癌癥進(jìn)展。另外，AP4 對(duì)于維持癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程和調(diào)節(jié)腸內(nèi)腫瘤的發(fā)生是必不可少的[1]，然而其在子宮內(nèi)膜癌中的研究尚少。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）最初是作為一種形態(tài)發(fā)生程序而發(fā)現(xiàn)的，它參與了多個(gè)組織和器官的形成以及傷口的愈合[4,10-12]。研究表明，上皮來源的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過EMT過程后，細(xì)胞黏附逐漸喪失以及細(xì)胞的遷移和侵襲特性增加。因此，腫瘤細(xì)胞的EMT 有助于轉(zhuǎn)移，這是癌細(xì)胞的重要標(biāo)志之一。經(jīng)過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，靜止的上皮細(xì)胞失去極性并與鄰近組織分離，成為更具運(yùn)動(dòng)性和侵襲性的間充質(zhì)樣細(xì)胞。在癌癥發(fā)展的后期階段，EMT 發(fā)生在轉(zhuǎn)移的初始階段，其中腫瘤細(xì)胞從其主要部位擴(kuò)散，生長(zhǎng)并在身體其他部位形成腫瘤，最終導(dǎo)致患者死亡。另外，經(jīng)過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的細(xì)胞具有與干細(xì)胞或者癌癥干細(xì)胞相關(guān)的自我更新性狀。已有研究發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)錄因子例如Snail，Slug，ZEB1，ZEB2 和Twist 等可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生[10-12]。這些因素直接抑制了細(xì)胞黏附介體E-cadherin，并且在一定程度上賦予了干細(xì)胞。

研究表明AP4 代表EMT-TF（誘導(dǎo)EMT 的轉(zhuǎn)錄因子），類似于Snail 或ZEB1/2[1]。AP4 與許多EMT 效應(yīng)子和標(biāo)記基因（如Snail，vimentin，F(xiàn)OS，LEF1 和N-cadherin）的啟動(dòng)子結(jié)合并上調(diào)[1]，并直接抑制CDH1/E-cadherin。此外，異位AP4 誘導(dǎo)的EMT 和AP4 對(duì)于c-Myc 誘導(dǎo)的EMT 是必需的。在異種移植小鼠模型中，AP4 的失活阻止了結(jié)直腸癌細(xì)胞系注射后肺轉(zhuǎn)移的形成。此外，AP4 表達(dá)升高與患者生存不良和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移形成增加相關(guān)。使用轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞系，證明AP4 可以通過激活突變的p53-R280K 蛋白和缺乏DNA 結(jié)合域的顯性陰性AP4 的表達(dá)來激活細(xì)胞遷移和侵襲，降低細(xì)胞的流動(dòng)性。此外，大腸癌細(xì)胞中的AP4 抑制可抑制細(xì)胞遷移和侵襲，而AP4 的過表達(dá)則具有相反的作用[4]。子宮內(nèi)膜癌是一種腺癌，起源于子宮腔內(nèi)襯的上皮細(xì)胞。本次我們發(fā)現(xiàn)，AP4 也具有誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的潛能。

綜上所述，AP4 過表達(dá)于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后，抑制了E-cad 基因的表達(dá)，并且上調(diào)了vimentin 的表達(dá)，這一過程有助于降低細(xì)胞間黏附作用并促進(jìn)細(xì)胞游離。