高波 馬娟 李秀花 李焦生 王容燕 陳書龍

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所 河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 保定 071000）

馬鈴薯腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructorThorne，1945）是重要的遷移性植物內(nèi)寄生線蟲，主要為害植物地下部尤其是塊根、塊莖和球莖等［1-2］，也是國內(nèi)外重要的檢疫性線蟲［3］。該線蟲引起甘薯莖線蟲病，給我國的甘薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，一般發(fā)病田塊減產(chǎn)10%-30%，重則達(dá)50%-60%，甚至絕產(chǎn)無收［4］。在實(shí)際生產(chǎn)中甘薯莖線蟲病的防治主要以涕滅威之類的高毒藥劑為主，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及線蟲抗藥性的產(chǎn)生。選用抗耐病品種是目前最經(jīng)濟(jì)有效且環(huán)境友好的方法之一，近些年雖利用傳統(tǒng)方法育成了數(shù)百個甘薯新品種，其中不乏抗線品種，但往往由于品質(zhì)欠佳，使得其產(chǎn)業(yè)化價(jià)值大打折扣［5］。

RNAi技術(shù)以其高特異性，綠色安全，無殘留，不易產(chǎn)生抗藥性，且開發(fā)成本遠(yuǎn)低于化學(xué)農(nóng)藥等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前植物病蟲害防控領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［6］。RNAi技術(shù)在植物寄生線蟲中的應(yīng)用也越來越廣泛，如通過外源dsRNA遞送的方法已成功地對香蕉穿孔線蟲［7］、馬鈴薯腐爛莖線蟲［8］、南方根結(jié)線蟲［9］等線蟲的靶基因進(jìn)行了沉默；通過轉(zhuǎn)基因寄主遞送dsRNA的方式也已在馬鈴薯腐爛莖線蟲［10］、南方根結(jié)線蟲［11-12］、大豆孢囊線蟲［13］等線蟲中得到成功應(yīng)用；另外通過植物病毒載體遞送dsRNA的方法，也已成功應(yīng)用到根結(jié)線蟲的防治研究中［14-15］。因此，RNAi技術(shù)在未來植物寄生線蟲的防治策略制定和新技術(shù)的開發(fā)中將扮演著越來越重要的角色。

利用RNAi技術(shù)防控植物寄生線蟲的靶標(biāo)基因主要為線蟲的管家基因或寄生相關(guān)基因，將這些基因沉默后可以有效阻礙線蟲侵染寄主植物［16-17］。因此，為獲得具有RNAi應(yīng)用價(jià)值的線蟲靶標(biāo)基因資源，我們在前期研究中構(gòu)建了馬鈴薯腐爛莖線蟲的潛在致死基因庫（在秀麗隱桿線蟲中RNAi表型為致死或胚胎致死的同源基因），Dd-mel-26（Maternal Effect Lethal）基因即是其中的一員。MEL-26蛋白在秀麗隱桿線蟲中主要作為底物特異性適配體蛋白（substrate-specific adaptor protein）來介導(dǎo)泛素連接酶CUL-3（E3連接酶）對底物MEI-1蛋白的泛素化降解，從而對卵細(xì)胞由減數(shù)分裂轉(zhuǎn)有絲分裂的進(jìn)程進(jìn)行調(diào)節(jié)［18］。此外，MEL-26還參與了秀麗隱桿線蟲其他生命進(jìn)程，如：其可以與CUL-3結(jié)合來正調(diào)控胞質(zhì)分裂［19］；將該基因敲除/沉默后會導(dǎo)致線蟲體壁的橫紋肌粗肌絲無法正確組裝［20］、細(xì)胞分裂時(shí)染色體無法正常分離［21］、體長變短［22］、胚胎致死［22-24］、卵無法孵化［25］、高雄性占比［26］以及種群適應(yīng)性降低［27］等。由此可知，該基因在線蟲繁殖、發(fā)育和運(yùn)動中均發(fā)揮著重要作用。本研究擬對馬鈴薯腐爛莖線蟲的Dd-mel-26基因進(jìn)行克隆和功能分析，為開發(fā)馬鈴薯腐爛莖線蟲防控新策略與技術(shù)研發(fā)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯腐爛莖線蟲為本實(shí)驗(yàn)室保存，分離自河北省盧龍縣發(fā)病甘薯，為A型種群，室內(nèi)采用胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)法活體保存［28］。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯腐爛莖線蟲RNA和DNA的提取及cDNA第一鏈的合成 收集的馬鈴薯腐爛莖線蟲加入Trizol后用凍融法進(jìn)行充分裂解，再按照TransZolUp Plus RNA Kit（北京全式金）試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取。用MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（大連寶生物）試劑盒，并按照其說明書提取莖線蟲的基因組DNA。將獲得的RNA用PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（大連寶生物）試劑盒按照說明書合成cDNA第一鏈。

1.2.2Dd-mel-26基因cDNA及基因組序列擴(kuò)增與分析 根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線蟲的Dd-mel-26基因的EST序列設(shè)計(jì)特異性引物，cDNA序列中間片段擴(kuò)增引物為mel-26F/mel-26R（表1），擴(kuò)增試劑為2×EasyTaqPCR SuperMix（全式金），并按試劑說明進(jìn)行操作。利用經(jīng)典RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得兩端序列［29-30］。利用引物mel-26GF/mel-26GR（表1）擴(kuò)增獲得Dd-mel-26基因組序列。擴(kuò)增獲得的所有序列片段均經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后連接克隆載體pMD18-T，之后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，最后將經(jīng)篩選獲得的陽性克隆送至上海生工進(jìn)行測序。獲得的序列使用DNAMAN、DNAstar軟件進(jìn)行比對拼接，使用NCBI-ORF finder在線進(jìn)行開放閱讀框查找、蛋白翻譯；使用NCBI-Blast進(jìn)行基因同源性分析；使用MEGA6.0鄰接法（Neighboor Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用在線工具SignalP 4.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測；使用ProtParam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）預(yù)測蛋白質(zhì)序列理化性質(zhì)；使用 EBI 的 InterProscan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）預(yù)測蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；使 用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，使用EzMol（www.sbg.bio.ic.ac.uk/ezmol/）進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)重現(xiàn)及分析；使用PSORT II（https：//psort.hgc.jp/form2.html）預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位。使用GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)分析。試驗(yàn)用到的所有引物序列信息均列于表1。

表1 本研究所用引物信息Table 1 Primer information used in this study

1.2.3Dd-mel-26基因在莖線蟲基因組中的拷貝數(shù)分析 根據(jù)Dd-mel-26基因的cDNA和基因組序列信息，設(shè)計(jì)并合成探針引物mel26-probe-F/mel26-probe-R（表1），線蟲基因組的提取方法同1.2.1，基因組酶切使用XbaI、HindIII和EcoR V。Southern雜交采用DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（羅氏）試劑盒，參照彭煥等［8］的方法進(jìn)行操作。最終顯色的雜交膜晾干后用掃描儀進(jìn)行掃描后保存圖片，分析拷貝數(shù)。

1.2.4Dd-mel-26基因在莖線蟲不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況 收集馬鈴薯腐爛莖線蟲卵約10 000個，人工挑取2齡3齡混合期幼蟲（J2-J3 mix）、4齡幼蟲（J4）、雄蟲、雌蟲各300頭，3次重復(fù)。并利用RNAiso Plus（大連寶生物）提取線蟲各發(fā)育期總RNA，使用EasyScriptAll-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）（全式金）合成cDNA第一鏈，利用TransStartTop Green qPCR SuperMix（全式金）試劑盒進(jìn)行qPCR，引物序列見列表1，體系為：2×Top Green qPCR SuperMix，10 μL；正反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL；cDNA模板1.2 μL；加RNase free H2O至20 μL。qPCR反應(yīng)在耶拿qTOWER3上運(yùn)行，程序?yàn)?4℃ 30 s；94℃ 5 s，57℃ 15 s，72℃ 10 s，40個循環(huán)。以卵為參照組，采用2-ΔΔCt法計(jì)算不同齡期基因相對表達(dá)量。

1.2.5體外誘導(dǎo)Dd-mel-26基因的沉默 dsRNA的合成：分別從Dd-mel-26基因CDS序列的5'端（片段a：358 bp）、中間區(qū)域（片段b：410 bp）和3'端（片段c：315 bp）設(shè)計(jì)靶標(biāo)片段，并利用T7 RiboMAX Express RNAi System（Promega）試 劑 盒并合成dsRNA，并按照說明書的步驟進(jìn)行操作。參考李宇等和彭煥等的方法［7-8］刺激線蟲取食：M9 buffer（1×），125 μL；5%的間苯二酚，100 μL；加線蟲懸浮液至總體積500 μL。25℃，旋轉(zhuǎn)混勻儀上（20 r/min）浸泡處理3 h。用DEPC H2O快速洗滌線蟲5次。配制誘導(dǎo)沉默混合液：dsRNA溶液，終濃度1.5 mg/mL；加線蟲懸浮液至100 μL。25℃、旋轉(zhuǎn)混勻儀上（20 r/min）浸泡處理24 h，每個處理3個重復(fù)，以dsGFP浸泡的線蟲作為陰性對照，以DEPC H2O代替dsRNA作為空白對照；之后用DEPC H2O洗滌處理后的線蟲5次并用1 mL DEPC H2O懸浮線蟲。受不同區(qū)段dsRNA浸泡處理的線蟲利用1.2.1中的方法提取總RNA，并利用qPCR的方法（同1.2.4）分析受處理線蟲靶基因的沉默效率。

1.2.6Dd-mel-26沉默后線蟲的生物學(xué)表型測定 采用沙柱法分析受處理線蟲的垂直遷移力［31-33］。取內(nèi)徑為25 mm、高60 mm 的PVC管，一端包以150目（孔徑0.106 mm）的尼龍網(wǎng)紗，在管內(nèi)填滿經(jīng)高溫消毒、且過40目篩（孔徑0.38 mm）的干燥沙子。將裝有沙子的PVC管垂直立于60 mm培養(yǎng)皿中，皿中加入20 mL水，待沙柱中沙子全部浸透后，從沙柱上端加入300頭線蟲，每個處理3個重復(fù)，室溫靜置15 h后收集皿中線蟲，并統(tǒng)計(jì)通過率（線蟲通過率=通過的線蟲數(shù)/300）。采用接種胡蘿卜愈傷組織法測定受處理線蟲繁殖量［28］，每皿接種100頭線蟲，每處理4個重復(fù)，25℃黑暗培養(yǎng)30 d后收集皿中線蟲并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用DPS v6.55軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用單因素方差分析及Turkey法分析不同處理的差異顯著性。不同處理間字母相同代表兩處理間的差異不顯著（P＞0.05），反之，則差異顯著 （P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 Dd-mel-26基因cDNA及基因組序列擴(kuò)增與 分析

Dd-mel-26基因cDNA的兩端及中間片段電泳圖見圖1-A，1-B和1-C，基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果見圖1-D。Dd-mel-26基因cDNA全長為1 594 bp（Gen-Bank登錄號：MZ158305），包含一個1 158 bp的開放閱讀框，預(yù)測編碼一個含385個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為43.52 kD，等電點(diǎn)為5.4，其5' 非翻譯區(qū)（UTR）序列長為86 bp，并存在一個反式剪接引導(dǎo)序列 SL1（GGT TTA ATT ACC CAA GTT TGA G），3' UTR長為350 bp，并含有加尾信號AATAAA。測得Dd-mel-26基因組序列長2 824 bp（GenBank登錄號：MZ190837），基因組結(jié)構(gòu)中包含10個外顯子和9個內(nèi)含子序列（圖2），且符合GU/AG的剪接規(guī)律，9個內(nèi)含子中有4個內(nèi)含子的3'端發(fā)現(xiàn)了UUUCAG序列，在所有9個內(nèi)含子的3'端-5位點(diǎn)均為尿嘧啶堿基（U）。

圖1 馬鈴薯腐爛線蟲Dd-mel-26 cDNA及其基因組序列擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Amplification results of the cDNA and genomic sequence of Dd-mel-26

圖2 Dd-mel-26基因組結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 Genome structure of Dd-mel-26

InterProscan分析結(jié)果顯示Dd-MEL-26蛋白含有兩個保守的功能結(jié)構(gòu)域MATH（Meprin-Associated Traf Homology） 和BTB（Bric-à-brac/ Tramtrack/ Broad complex），分別位于氨基酸序列的36-158 aa和187-294 aa區(qū)段。SignalP 和TMHMM 軟件分析顯示該蛋白不具有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，PSORT II軟件預(yù)測該蛋白定位于細(xì)胞核中，PSIPRED對該蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示（圖3），該蛋白在N端MATH保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域有8個β折疊股（strand）和2個α螺旋（helix）結(jié)構(gòu)，而在C端的BTB保守結(jié)構(gòu)域有5個α螺旋和3個β折疊股結(jié)構(gòu)。通過SWISS-MODEL進(jìn)行了同源建模，模板比對結(jié)果顯示與SWISS-MODEL模板庫中ID為3hu6.1的蛋白同源性最高為34.8%，以此為模板構(gòu)建了MEL-26蛋白的三級結(jié)構(gòu)圖（圖4），GMQE值為0.48，QMEN值為-2.41，說明Dd-MEL-26的三維結(jié)構(gòu)與模板蛋白匹配度較高。通過三維結(jié)構(gòu)可以看出，Dd-MEL-26蛋白以同源二聚體形式存在，兩個單體分別命名為26_A和26_B。其中結(jié)構(gòu)的上半部分富含β折疊股的蝶狀結(jié)構(gòu)為MATH功能結(jié)構(gòu)域所在的部位（MATH_A和MATH_B），下半部分富含α螺旋的碟狀結(jié)構(gòu)為BTB功能結(jié)構(gòu)域所在的部位（BTB_A和BTB_B），在BTB保守結(jié)構(gòu)域結(jié)束后緊跟著兩個α螺旋結(jié)構(gòu)為3-box結(jié)構(gòu)域（圖4紅色部分）

圖3 Dd-MEL-26蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig. 3 Predicted secondary structure of Dd-MEL-26 protein

圖4 Dd-MEL-26蛋白的三級結(jié)構(gòu)圖Fig. 4 Tertiary structure of Dd-MEL-26 protein

2.2 Dd-mel-26基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于Dd-MEL-26蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果（圖5）顯示所有線蟲被分為了4組，其中植物寄生線蟲、食細(xì)菌線蟲和昆蟲病原線蟲均單獨(dú)聚為1組，而動物寄生線蟲則分為了兩個亞組。馬鈴薯腐爛莖線蟲的Dd-MEL-26蛋白與植物寄生線蟲象耳豆根結(jié)線蟲（M. enterolobii）、沖繩傘滑刃線蟲（Bursaphelenchus okinawaensis）和松材線蟲（B. xylophilus）聚為一組，其中與象耳豆根結(jié)線蟲的同源性最高達(dá)76.14%，與另兩個植物病原線蟲的同源性為（66.54±0.79）%。另外，Dd-MEL-26與食細(xì)菌線蟲的同源性為（63.05±0.77）%，與動物寄生線蟲A亞組的同源性為（70.52±1.13）%，而與B亞組的同源性為（62.88±1.27）%。

圖5 基于Dd-mel-26基因的氨基酸序列利用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Neighbor-Joining tree calculated from the sequences of Dd-mel-26 amino acid sequence

2.3 Dd-mel-26基因在莖線蟲基因組中的拷貝數(shù) 分析

Southern雜交結(jié)果（圖6）顯示用EcoRV和XbaI酶切的基因組泳道中只出現(xiàn)一條帶，而Hind III酶切的基因組泳道中出現(xiàn)了兩條帶，通過分析探針序列及其對應(yīng)的基因組序列發(fā)現(xiàn)探針序列所對應(yīng)的基因組序列中有一個Hind III酶切位點(diǎn)，從而導(dǎo)致了雜交結(jié)果為兩條帶，綜合以上分析可得Dd-mel-26在基因組中為單拷貝基因。

圖6 Dd-mel-26基因的Southern雜交結(jié)果圖Fig. 6 Southern blotting results of Dd-mel-26 gene

2.4 Dd-mel-26基因在莖線蟲不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況

對馬鈴薯腐爛莖線蟲不同發(fā)育時(shí)期Dd-mel-26基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（圖7），Dd-mel-26基因在卵中的相對表達(dá)量最高，且顯著高于其他幾個發(fā)育時(shí)期，其次為雌雄成蟲，最低為二齡和三齡期混合線蟲（J2-J3 mix），但從二齡到成蟲的4個發(fā)育時(shí)期中該基因的相對表達(dá)量差異不顯著。

圖7 馬鈴薯腐爛莖線蟲不同發(fā)育時(shí)期Dd-mel-26基因的相對表達(dá)量Fig. 7 Relative expressions of Dd-mel-26 gene at different developmental stages of D. destructor

2.5 Dd-mel-26基因不同區(qū)段dsRNA誘導(dǎo)RNAi沉默效率分析

用Dd-mel-26的3個片段dsRNA處理線蟲24 h后，qPCR結(jié)果（圖8）顯示靶基因的沉默效率最高的為b段和c段dsRNA處理線蟲，分別下調(diào)了55.8%和55.6%，而受a段dsRNA處理的線蟲靶基因僅下調(diào)了12.8%，與空白對照組相比不顯著。因此，沉默效率最高的為b段dsRNA。

圖8 受Dd-mel-26的a、b和c片段dsRNA處理的線蟲Dd-mel-26的相對表達(dá)量Fig. 8 Relative expressions of Dd-mel-26 after treatment with dsRNA of fragments a，b and c of Dd-mel-26

2.6 Dd-mel-26沉默后線蟲的生物學(xué)表型分析

用Dd-mel-26基因b段dsRNA處理線蟲24 h后，靶基因相對表達(dá)量顯著降低，達(dá)51.4%（圖9-A）；受處理線蟲的沙柱通過率顯著地高于空白對照組，提高約31.8%（圖9-B）；線蟲繁殖量則顯著地高于空白對照組，提高約28%（圖9-C）。而GFP陰性對照組與空白對照組差異不顯著。

圖9 受Dd-mel-26 dsRNA處理線蟲靶基因的相對表達(dá)量（A）、沙柱平均通過率（B）及其平均繁殖量（C）Fig. 9 Relative expressions of target gene（A），average passing rate in sand column（B），and average reproduction（C）in the Dd-mel-26 dsRNA-treated nematodes

3 討論

馬鈴薯腐爛莖線蟲在我國主要為害甘薯，是我國甘薯生產(chǎn)中的一種重要的病原線蟲。為更深入地了解馬鈴薯腐爛莖線蟲并尋找具有RNAi應(yīng)用價(jià)值的靶標(biāo)基因資源，本研究對馬鈴薯腐爛莖線蟲的一個潛在致死基因底物特異性適配體基因Dd-mel-26的全長cDNA序列進(jìn)行了克隆和功能分析，發(fā)現(xiàn)該基因在基因組中為單拷貝，與象耳豆根結(jié)線蟲的親緣關(guān)系最近。預(yù)測該蛋白可能主要以二聚體形式在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，將該基因沉默后線蟲的繁殖量增加，垂直移動能力增強(qiáng)，另外，該基因在卵中的表達(dá)量最高。

馬鈴薯腐爛莖線蟲的Dd-mel-26基因的基因組序列9個內(nèi)含子中，有4個內(nèi)含子的3'端發(fā)現(xiàn)了UUUCAG序列，在所有9個內(nèi)含子的3'端負(fù)5位點(diǎn)均為尿嘧啶堿基（U），與Blumenthal等［34］在秀麗隱桿線蟲中的研究結(jié)果基本一致。這些保守的嘧啶堿基在3'剪切位點(diǎn)的正確選擇中發(fā)揮著重要的作用［35-36］。Dd-mel-26的內(nèi)含子中有3個的序列長度小于50 bp，據(jù)報(bào)道這種短序列內(nèi)含子是線蟲所特有的［34］，而在其它的脊椎動物中是無法進(jìn)行剪切的［37］。另外，Gorlova等［38］研究顯示基因內(nèi)含子的數(shù)量在10以內(nèi)時(shí)則內(nèi)含子數(shù)量與基因的保守性呈正相關(guān)，而當(dāng)大于10時(shí)則基因的保守性不再隨內(nèi)含子數(shù)量發(fā)生改變。本研究中Dd-mel-26基因的基因組序列中含有9個內(nèi)含子，說明該基因的保守性比較強(qiáng)。結(jié)合該基因在基因組中為單拷貝的結(jié)果，推測該基因應(yīng)該屬于一種管家基因。

馬鈴薯腐爛莖線蟲Dd-MEL-26的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與植物寄生線蟲聚為一組，但其與動物寄生線蟲A亞組的同源性卻比與植物寄生線蟲沖繩傘滑刃線蟲與松材線蟲的同源性高，這可能是因?yàn)橄蠖垢Y(jié)線蟲與植物寄生線蟲沖繩傘滑刃線蟲與松材線蟲的同源性（67.07±0.97）%高于與動物寄生線蟲A亞組的同源性（66.07±0.60）%，而同時(shí)馬鈴薯腐爛莖線蟲與象耳豆根結(jié)線蟲的同源性76.14%又顯著高于其與動物寄生線蟲A亞組的同源性（70.52±1.13）%，所以綜合以上因素MEGA軟件將馬鈴薯腐爛莖線蟲與植物寄生線蟲聚為一組的結(jié)果是可靠的。這也從另一個角度證明了該基因在不同種線蟲間的高度保守性。另外，馬鈴薯腐爛莖線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲均屬于墊刃目，而沖繩傘滑刃線蟲與松材線蟲則均屬于滑刃目，這也可能是造成馬鈴薯腐爛莖線蟲與這兩種線蟲的同源性較象耳豆根結(jié)線蟲低的原因。

馬鈴薯腐爛莖線蟲Dd-MEL-26蛋白含有MATH和BTB兩個保守結(jié)構(gòu)域，與秀麗隱桿線蟲的MEL-26蛋 白 一 致［18，39］，屬 于MATH-BTB蛋 白 家 族。Dd-MEL-26蛋白MATH結(jié)構(gòu)域區(qū)域有8個β折疊股，BTB結(jié)構(gòu)域區(qū)域有5個α螺旋和3個β折疊股的二級結(jié)構(gòu)組成，均符合該家族蛋白的共同特征［40］，其三維結(jié)構(gòu)以二聚體形式存在，亦與秀麗隱桿線蟲和擬南芥中對MATH-BTB蛋白的三維結(jié)構(gòu)研究結(jié)果一致［41-42］。另外，Dd-MEL-26的三維結(jié)構(gòu)中緊跟在BTB結(jié)構(gòu)域后面存在一個類似“3-box”的結(jié)構(gòu)，與Zhuang等［43］研究結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)MATHBTB蛋白SPOP以二聚體形式與CUL-3蛋白（E3連接酶）結(jié)合，而“3-box”結(jié)構(gòu)的存在能使這種結(jié)合更穩(wěn)固。

MEL-26蛋白主要在性腺和受精的胚胎中被檢測到［39］，且在剛受精胚胎的16細(xì)胞期仍處于高水平表達(dá)狀態(tài)，而到64細(xì)胞期則降到很低的水平［26］。本研究中Dd-mel-26在卵中高水平表達(dá)，而在其他蟲態(tài)時(shí)表達(dá)水平較低，亦與前人研究結(jié)果一致。說明Dd-mel-26主要在馬鈴薯腐爛莖線蟲的胚胎發(fā)育早期發(fā)揮重要作用。

秀麗隱桿線蟲MEL-26蛋白在胚胎早期發(fā)育、細(xì)胞分裂以及肌肉形成中都發(fā)揮著重要的作 用［18，20-21，40］，將其敲除后會導(dǎo)致線蟲出現(xiàn)胚胎致死、卵無法孵化、體長變短、高雄性占比以及種群適應(yīng)性降低等表型［22-27］。因此，預(yù)測該基因在馬鈴薯腐爛莖線蟲中應(yīng)該也有類似的功能。將該基因沉默后對馬鈴薯腐爛莖線蟲的繁殖和遷移均應(yīng)該有較大的抑制作用，而本研究中將Dd-mel-26基因沉默后其繁殖量及沙柱通過率均顯著增加，與預(yù)期不符，原因可能是：（1）目前對于mel-26基因的研究還僅在模式線蟲秀麗隱桿線蟲中，在其它線蟲尤其是植物寄生線蟲中還未有研究，因此該基因的功能是否與模式線蟲的完全一致還不清楚；（2）秀麗隱桿線蟲的基因功能研究可以通過基因敲除或飼喂表達(dá)dsRNA的細(xì)菌來穩(wěn)定持久的沉默線蟲的靶基因［44］，而利用體外dsRNA浸泡法對馬鈴薯腐爛莖線蟲靶基因的沉默具有一定的時(shí)效性［8，45］，且往往只能對幼蟲和成蟲進(jìn)行基因沉默，無法對線蟲全生育期尤其卵的靶基因進(jìn)行沉默，而本研究中Dd-mel-26基因恰恰是在卵中表達(dá)量最高；（3）Li等［46］發(fā)現(xiàn)一種E3連接酶（RLE-1）被敲除后可以延長秀麗隱桿線蟲的壽命，而MEL-26在蛋白泛素化降解中亦是通過與CUL-3蛋白（E3連接酶）結(jié)合來發(fā)揮作用［44］，因此，mel-26基因被敲除后可能也有同樣的效應(yīng)，而在另一項(xiàng)研究證明將秀麗隱桿線蟲的mel-26基因敲除后確實(shí)可以延長線蟲的壽命［44］。本研究中將該基因沉默后導(dǎo)致線蟲的繁殖量增加可能也是此原因造成的，線蟲壽命的增加一方面會拉長其繁殖期，另一方面會降低死亡率，最終使得線蟲的總繁殖量超出正常水平；（4）有研究顯示將mel-26敲除或過表達(dá)均會導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲的肌肉發(fā)育異常［20］，因此，維持正常的肌肉發(fā)育可能需要mel-26基因的表達(dá)處于一定的平衡范圍內(nèi)，而本研究對該基因的部分沉默可能打破了這種平衡從而對馬鈴薯腐爛莖線蟲的肌肉組織產(chǎn)生了刺激效應(yīng)，最終表現(xiàn)出對沙柱的通過率顯著提高。

通過對馬鈴薯腐爛莖線蟲致死基因的研究，可以為利用RNAi技術(shù)來防治植物寄生線蟲提供靶標(biāo)基因資源。本研究對馬鈴薯腐爛莖線蟲Dd-mel-26的研究雖未能抑制莖線蟲的繁殖和垂直移動，但明確了該基因在馬鈴薯腐爛莖線蟲的繁殖和垂直移動中發(fā)揮著重要的作用，也顯示出體外浸泡法誘導(dǎo)線蟲基因沉默的方法具有一定的局限性，即其時(shí)效性和無法實(shí)現(xiàn)對卵中靶基因的沉默。也提示我們今后在對抗線靶基因資源的篩選中選擇寄主介導(dǎo)的基因沉默，或通過提高dsRNA的穩(wěn)定性延長其飼喂時(shí)間從而得到更穩(wěn)定持久可靠的RNAi表型，從而推動RNAi技術(shù)在植物寄生線蟲防控中的應(yīng)用。

4 結(jié)論

馬鈴薯腐爛莖線蟲Dd-mel-26基因在基因組中為單拷貝屬于管家基因的一種，其與象耳豆根結(jié)線蟲的親緣關(guān)系最近，主要在胚胎發(fā)育早期發(fā)揮作用，且在一定條件下可以正調(diào)控馬鈴薯腐爛莖線蟲的繁殖和垂直移動，但將該基因做為RNAi靶標(biāo)可能需要更加深入的研究。