李治文 劉培燕 陳建松，2 廖金鈴.2，3 林柏榮，2 卓侃，2

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物線蟲研究室，廣州 510642；2. 廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；3. 廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，廣州 510520）

擬禾本科根結(jié)線蟲（Meloidogynegraminicola）是水稻重要的病原之一，該線蟲引起的水稻根結(jié)線蟲病廣泛分布于熱帶和亞熱帶國(guó)家，包括中國(guó)、美國(guó)、孟加拉國(guó)、緬甸、老撾、印度、泰國(guó)、越南和菲律賓 等［1-2］。在我國(guó)，擬禾本科根結(jié)線蟲首先在海南省發(fā)現(xiàn)，其后在福建、廣東、廣西和安徽等多個(gè)省份均有報(bào)道，近年危害愈加嚴(yán)重［3-5］。該線蟲在水田通?？稍斐?7%-32%的水稻產(chǎn)量損失，在旱地水稻田可造成更嚴(yán)重的危害，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致高達(dá)80%的損失甚至水稻失收［6］。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)擬禾本科根結(jié)線蟲可分泌效應(yīng)子至寄主植物中，這些效應(yīng)子具有抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)、改變植物信號(hào)通路等功能，有利于線蟲寄生。如Chen等［7］報(bào)道定位在線蟲亞腹食道腺的效應(yīng)子MgGPP被線蟲分泌到寄主植物細(xì)胞質(zhì)外體中，在效應(yīng)子C端幫助下進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N端發(fā)生糖基化且C端被水解，然后被運(yùn)輸至細(xì)胞核中抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)，促進(jìn)線蟲寄生。另兩個(gè)效應(yīng)子Mg16820和Mg01965同樣定位在線蟲亞腹食道腺并促進(jìn)線蟲寄生。Mg16820在線蟲侵入水稻后的遷移階段被分泌到水稻細(xì)胞質(zhì)外體，當(dāng)線蟲進(jìn)入固著性寄生階段時(shí)則被分泌到水稻細(xì)胞內(nèi)，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；Mg01965在線蟲遷移和固著寄生階段均被分泌到水稻細(xì)胞質(zhì)外體［8-9］。其中Mg16820在植物細(xì)胞質(zhì)外體和細(xì)胞內(nèi)分別抑制病原相關(guān)分子模式促發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI）和效應(yīng)子促發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity，ETI）［8］；而Mg01965在質(zhì)外體時(shí)可抑制PTI，但在細(xì)胞內(nèi)則無(wú)抑制植物免疫的作用［9］。進(jìn)一步研究表明Mg16820與一個(gè)脫落酸響應(yīng)基因蛋白：脫水應(yīng) 激誘導(dǎo)蛋白（dehydration-stress inducible protein 1，DIP1）相互作用，推測(cè)其可能參與植物應(yīng)激反應(yīng)［8］。

本課題組前期構(gòu)建了一個(gè)擬禾本科根結(jié)線蟲抑制差減文庫(kù)，從中克隆獲得MgMO237效應(yīng)子，研究表明該效應(yīng)子具有抑制植物PTI、促進(jìn)線蟲寄生的功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MgMO237與3個(gè)水稻防衛(wèi)相關(guān)蛋白相互作用，其中之一是水稻富含半胱氨酸重復(fù)序列分泌蛋白（Cys-rich repeat secretory proteins，CRRSPs）OsCRRSP55［10］。由于轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY47能綁定OsCRRSP55啟動(dòng)子區(qū)并啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄，而WRKY家族基因通常受到水楊酸和茉莉酸調(diào)控，因此推測(cè)OsCRRSP55基因可能參與植物激素通路相關(guān)的防衛(wèi)反應(yīng)，MgMO237可能通過(guò)與OsCRRSP55互作干擾了植物激素信號(hào)通路，從而抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)［10-14］。因此本研究進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)OsCRRSP55的表達(dá)特性，并通過(guò)RNA-seq（RNA sequencing）Illumina測(cè) 序 及RT-qPCR技 術(shù) 尋 找MgMO237與OsCRRSP55的植物激素通路共響應(yīng)基因，為了解OsCRRSP55基因在線蟲寄生中的作用及尋找防控根結(jié)線蟲的靶標(biāo)基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型日本晴水稻（Oryza sativacv. ‘Nipponbare’）、MgMO237轉(zhuǎn)基因水稻、pCAMBIA1305.1載 體、pUbi載體和經(jīng)單卵囊純化后的擬禾本科根結(jié)線蟲種群均保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物線蟲研究室。

1.2 方法

1.2.1OsCRRSP55基因擴(kuò)增及序列分析 用天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒提取水稻根總RNA。取2 μg RNA，用北京全式金生物技術(shù)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，以該cDNA為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)覆蓋基因開(kāi)放閱讀框的引物（本研究所用引物見(jiàn)表1）擴(kuò)增OsCRRSP55基因全長(zhǎng)。PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：cDNA 1 μL，KOD FX 1 μL，2 × KOD FX Buffer 25 μL，dNTPs 10 μL，上下游引物各1.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物純化回收，連接到北京全式金生物技術(shù)有限公司的pEASY-Blunt Simple載體上，最后轉(zhuǎn)化克隆送廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司測(cè)序。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

通過(guò)NCBI進(jìn)行OsCRRSP55同源序列檢索，使 用ClustalW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）和Boxshade（http：//sourceforge.net/projects/boxshade/）軟件進(jìn)行序列比對(duì)及作圖。用SignalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分別預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.2OsCRRSP55基因在水稻不同器官的表達(dá)分析 分別提取水稻種子及14日齡水稻根、莖、葉RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以該cDNA為模板，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）擴(kuò)增OsCRRSP55基因和水稻內(nèi)參基因OsUBQ（Os03g13170），檢測(cè)OsCRRSP55基因在水稻各器官的相對(duì)表達(dá)量。RTqPCR反 應(yīng) 體 系（20 μL）為：2 ×GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL；上下游引物各0.4 μL；cDNA 1 μL；RNase-free Water 8.2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min；95℃變性10 s，60℃擴(kuò)增30 s，40個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)取3次生物學(xué)重復(fù)處理的樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，用2-ΔΔct方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3OsCRRSP55基因響應(yīng)線蟲侵染的表達(dá)分析 將200條擬禾本科根結(jié)線蟲侵染前2齡幼蟲接種至14日齡水稻根部，7 d后分別取根結(jié)及健康水稻的相應(yīng)根部位，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以該cDNA為模板，用RT-qPCR檢測(cè)OsCRRSP55基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4OsCRRSP55基因響應(yīng)水楊酸和茉莉酸甲酯的表達(dá)分析 用8 mmol/L水楊酸（salicylic acid，SA）和100 μmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）水溶液（含0.02%（V/V）吐溫20）噴施14日齡水稻葉片，直至形成細(xì)密水膜。以含0.02%（V/V）吐溫20的清水為對(duì)照，置于28℃培養(yǎng)24 h［15-16］。提取上述水稻根部RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以該cDNA為模板，用RT-qPCR檢測(cè)OsCRRSP55基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 響應(yīng)MgMO237的植物激素通路基因篩選與驗(yàn)證 分別提取14日齡MgMO237轉(zhuǎn)基因水稻OE26、OE61株系和野生型水稻葉片RNA，反轉(zhuǎn) 錄 獲 得cDNA。以 該cDNA為 模 板，用RTqPCR擴(kuò)增MgMO237基因和水稻內(nèi)參基因OsUBQ（Os03g13170），檢測(cè)MgMO237基因的表達(dá)，確認(rèn)陽(yáng)性MgMO237轉(zhuǎn)基因水稻植株。

分別提取14日齡MgMO237轉(zhuǎn)基因水稻OE26、OE61和野生型水稻的根部總RNA，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)并用Illumina HiSeqTM 進(jìn)行測(cè)序。通過(guò) FDR（false discovery rate）與log2FC（FDR＜0.05且 |log2FC|＞1）篩選轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻的差異表達(dá)基因。采用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）法進(jìn)行基因表達(dá)量計(jì)算。用EdgeR軟件進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，并對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析。用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行植物激素通路差異表達(dá)基因的驗(yàn)證。

1.2.6 響應(yīng)OsCRRSP55的植物激素通路基因分析 設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增帶有FLAG標(biāo)簽的OsCRRSP55全長(zhǎng)序列，將獲得的擴(kuò)增片段和pUbi載體用NcoI和PmlI（賽默飛世爾科技公司）雙酶切，用東洋紡生物科技有限公司的Ligation High Ver.2連接酶連接獲得 pUbi∶OsCRRSP55∶FLAG瞬時(shí)表達(dá)載體。通過(guò)polyethylene glycol（PEG）介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將該載體轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體［17］?；赪estern blot技術(shù)，使用FLAG標(biāo)簽抗體檢測(cè)OsCRRSP55蛋白的表達(dá)。水稻原生質(zhì)體的制備、蛋白提取和Western blot分析按Chen等［10］描述的方法進(jìn)行。提取過(guò)表達(dá)OsCRRSP55水稻和野生型水稻原生質(zhì)體RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以該cDNA為模板，用RTqPCR檢測(cè)響應(yīng)OsCRRSP55的植物激素通路基因的表達(dá)量，獲得線蟲效應(yīng)子MgMO237及互作蛋白OsCRRSP55在水稻中的共響應(yīng)基因。

2 結(jié)果

2.1 水稻OsCRRSP55基因的序列分析

水稻OsCRRSP55基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)798 bp，預(yù)測(cè)氨基酸長(zhǎng)265 aa，蛋白分子量大小28.19 kD，具N端信號(hào)肽，不含跨膜結(jié)構(gòu)域，含有兩個(gè)Unknown Function 26（DUF26）結(jié)構(gòu)域，保守基序?yàn)镃-X8-C-X2-C（圖1）。氨基酸序列相似性比對(duì)結(jié)果顯示，OsCRRSP55與多種植物CRRSP55氨基酸序列相似，其中與掃帚黍（Dichanthelium oligosanthes）的DoCRRSP55同源性最高，相似性為79.8%。

圖1 植物CRRSP55蛋白多序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Multiple sequence alignment and conserved motif analysis of plant CRRSP55 proteins

2.2 OsCRRSP55基因在水稻不同器官及響應(yīng)線蟲侵染的表達(dá)分析

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，OsCRRSP55在水稻的種子、14天齡的根、莖和葉中均有表達(dá)，其中在葉與根中表達(dá)量較高，分別為種子中表達(dá)量的24.35和5.39倍（圖2-A）。

與健康水稻根中的OsCRRSP55基因表達(dá)相比，擬禾本科根結(jié)線蟲侵染7 d后的根結(jié)中OsCRRSP55基因表達(dá)量顯著提高，提高約12倍（圖2-B）。

圖2 水稻OsCRRSP55基因的表達(dá)Fig. 2 Expression levels of OsCRRSP55 gene in rice

2.3 OsCRRSP55是水楊酸和茉莉酸響應(yīng)基因

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，OsCRRSP55在外源水楊酸處理的水稻中轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，其表達(dá)量是未經(jīng)水楊酸處理水稻的2.52倍；結(jié)合OsCRRSP55基因啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子WRKY47表達(dá)水平也顯著上調(diào)，約為未經(jīng)水楊酸處理水稻的7.73倍（圖3-A）。OsCRRSP55和WRKY47在茉莉酸甲酯處理的水稻中轉(zhuǎn)錄水平也顯著上調(diào)，與未經(jīng)茉莉酸甲酯處理的水稻相比，分別上調(diào)1.97倍和2.45倍（圖3-B）。

圖3 水楊酸和茉莉酸甲酯處理水稻后OsCRRSP55和WRKY47基因的表達(dá)變化Fig. 3 Expression variations of OsCRRSP55 and WRKY47 genes in the rice treated with salicylic acid and methyl jasmonate

2.4 響應(yīng)MgMO237的植物激素通路基因篩選與 驗(yàn)證

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示在野生型水稻中沒(méi)有檢測(cè)到MgMO237基因表達(dá)，而在兩個(gè)MgMO237轉(zhuǎn)基因水稻株系OE61和OE26中均能檢測(cè)到MgMO237基因表達(dá)（圖4），表明OE61和OE26為MgMO237轉(zhuǎn)基因水稻。

圖4 MgMO237轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定Fig. 4 Identification of MgMO237-transgenic rice

對(duì)MgMO237轉(zhuǎn) 基 因 水 稻OE26、OE61株 系與野生型水稻進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用EdgeR對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，OE26植株相對(duì)野生型植株有1 059個(gè)基因顯著上調(diào)，1 412個(gè)基因顯著下調(diào)。OE61植株相對(duì)野生型植株有740個(gè)基因顯著上調(diào)，2 290個(gè)基因顯著下調(diào)（圖5-A）。OE26和OE61植株相對(duì)野生型植株共同上調(diào)的基因有239個(gè)，共同下調(diào)的基因有782個(gè)（圖5-B），其中富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的基因共有10個(gè)，包括9個(gè)下調(diào)基因和1個(gè)上調(diào)基因。顯著下調(diào)的基因?yàn)镮AA24（Os07g0182400）、IAA20（Os06g0166500）、IAA7（Os02g0228900）、PIL13（Os03g0782500）、b-ZIP TRANSCRIPTION FACTOR 62（Os07g0686100）、OsERF87（Os09g0572000）、CYCLIN-D3-1（Os09g0111100）、PR-1a（Os07g0129300）和PR-1b（Os01g0382000）；顯著上調(diào)的基因是TIFY11e（Os10g0391400），表明這些基因可能是MgMO237的植物激素通路響應(yīng)基因。

圖5 MgMO237轉(zhuǎn)基因水稻與野生型水稻差異表達(dá)基因 統(tǒng)計(jì)Fig. 5 Statistics of differentially expressed genes between MgMO237-transgenic rice and wild-type rice

隨機(jī)選取5個(gè)上述植物激素信號(hào)通路差異表達(dá)基因，用RT-qPCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示MgMO237轉(zhuǎn) 基 因植株中的PR-1a、PR-1b、CYCLIN-D3-1和OsERF87基因發(fā)生明顯下調(diào)，TIFY11e基因發(fā)生顯著上調(diào)（圖6），與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的表達(dá)趨勢(shì)一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。

圖6 RT-qPCR驗(yàn)證MgMO237轉(zhuǎn)基因水稻與野生型水稻差異表達(dá)的植物激素通路基因Fig. 6 Confirmation of differentially expressed genes within plant hormone pathways in MgMO237-transgenic rice and wild-type rice by RT-qPCR

2.5 響應(yīng)OsCRRSP55的植物激素通路基因分析

用FLAG標(biāo)簽抗體檢測(cè)OsCRRSP55轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體中的OsCRRSP55表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示在OsCRRSP55轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體蛋白中檢測(cè)到約28 kD特異條帶（圖7-A），條帶符合預(yù)期大小，表明OsCRRSP55蛋白瞬時(shí)表達(dá)成功。用RTqPCR技術(shù)對(duì)上述MgMO237的植物激素通路響應(yīng)基因OsERF87、IAA24、PIL13、CYCLIN-D3-1、PR-1b和TIFY11e在OsCRRSP55轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsERF87基因表達(dá)顯著高于在野生型水稻原生質(zhì)體中的表達(dá)，上調(diào)約3倍，其余基因均未發(fā)現(xiàn)顯著變化（圖7-B），表明OsERF87基因是MgMO237和OsCRRSP55的植物激素通路共響應(yīng)基因。

圖7 OsCRRSP55影響水稻植物激素通路基因的表達(dá)Fig. 7 Expression levels of genes within rice hormone pathways responding to OsCRRSP55

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)擬禾本科根結(jié)線蟲背食道腺表達(dá)效應(yīng)子MgMO237在線蟲侵染7 d后表達(dá)顯著上調(diào)，與3個(gè)水稻蛋白：OsCRRSP55、OsGSC和OsBetvI相互作用，抑制水稻活性氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)積累和防衛(wèi)基因表達(dá)，提高了水稻的感病性［10］，其中OsCRRSP55屬于DUF26蛋白超家族［18］。DUF26蛋白是有胚植物（embryophyte）特有的一類蛋白，根據(jù)蛋白含有的DUF26結(jié)構(gòu)域數(shù)量、是否具信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域劃分為四類蛋白家族［18］。第一類是富含半胱氨酸類受體細(xì)胞質(zhì)激酶（Cysteine-rich receptor-like cytoplasmic kinases，CRCKs），只含有兩個(gè)DUF26結(jié)構(gòu)域，但沒(méi)有信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；第二類是富含半胱氨酸類受體蛋白激酶（cysteine-rich receptor-like protein kinases，CRKs），具有兩個(gè)DUF26結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；第三類是胞間連絲定位蛋白（plasmodesmata-localized proteins，PDLPs），具有兩個(gè)DUF26結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，但胞內(nèi)缺少蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；第四類是CRRSPs蛋白，含有單個(gè)或多個(gè)DUF26結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，但不具有跨膜結(jié)構(gòu)域和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域［18］。DUF26蛋白對(duì)植物的抗生物和非生物脅迫具有重要作用，包括干旱、高溫、鹽脅迫、真菌和細(xì)菌脅迫等［19］。例如水稻CRK10基因的激活表達(dá)能增強(qiáng)對(duì)白葉枯病的抗性［20］；擬南芥CRK家族基因，包括CRK4，CRK6和CRK36過(guò)表達(dá)均可增強(qiáng)擬南芥的免疫應(yīng)答及對(duì)丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性［19-20］。DUF26還可結(jié)合糖，具有凝集素活性。如銀杏中純化出的CRRSPs蛋白Ginkbilobin2（Gnk2）含一個(gè)DUF26結(jié)構(gòu)域，作為甘露糖結(jié)合的凝集素在體外發(fā)揮抗真菌作用［21-23］。玉米中兩種CRRSPs蛋白AFP1和AFP2可與甘露糖結(jié)合，參與對(duì)玉米黑粉菌的抗性［24］。然而，該超家族蛋白在植物與線蟲互作中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)OsCRRSP55具信號(hào)肽和兩個(gè)DUF26結(jié)構(gòu)域，但不含跨膜結(jié)構(gòu)域和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，屬于CRRSPs蛋白家族。RTqPCR結(jié)果顯示OsCRRSP55在水稻根中表達(dá)，且在根結(jié)線蟲侵染后表達(dá)量顯著升高，表明OsCRRSP55在線蟲寄生中發(fā)揮作用。

OsCRRSP55基因的啟動(dòng)子具有OsWRKY47轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域［11］，之前研究發(fā)現(xiàn)水楊酸和茉莉酸可誘導(dǎo)一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)［11-14］。本研究發(fā)現(xiàn)水楊酸和茉莉酸不僅顯著提高水稻OsWRKY47基因的表達(dá)，同時(shí)也顯著提高OsCRRSP55的表達(dá)，表明OsWRKY47和OsCRRSP55為水楊酸和茉莉酸響應(yīng)基因。近年研究發(fā)現(xiàn)水楊酸和茉莉酸信號(hào)途徑在水稻抗擬禾本科根結(jié)線蟲中發(fā)揮作用，尤其是茉莉酸信號(hào)途徑［16］。因此我們推測(cè)MgMO237可能通過(guò)與OsCRRSP55的互作影響了寄主中水楊酸和茉莉酸等激素信號(hào)的傳遞，抑制了水稻的防衛(wèi)反應(yīng)，促進(jìn)線蟲對(duì)水稻的寄生。為證明該推測(cè)，本研究進(jìn)一步探索在水稻中是否存在MgMO237和OsCRRSP55的水楊酸和茉莉酸信號(hào)共響應(yīng)基因。RNA-seq測(cè)序結(jié)果顯示與野生型水稻相比，包括OsERF87在內(nèi)的9個(gè)植物激素通路相關(guān)基因在MgMO237轉(zhuǎn)基因水稻中轉(zhuǎn)錄下調(diào)，1個(gè)植物激素通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)。同時(shí)RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在OsCRRSP55轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體中，響應(yīng)MgMO237的植物激素通路相關(guān)基因僅OsERF87基因顯著上調(diào)，其余基因表達(dá)沒(méi)有顯著變化，表明OsERF87受到OsCRRSP55和MgMO237的共調(diào)控。據(jù)報(bào)道，水稻OsERF87可被茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá)，從而引起病程相關(guān)蛋白基因RSOsPR10顯著上調(diào)［25］。綜上，我們認(rèn)為擬禾本科根結(jié)線侵染水稻后分泌效應(yīng)子MgMO237，MgMO237通過(guò)與OsCRRSP55的互作抑制了茉莉酸響應(yīng)基因OsERF87表達(dá)，從而影響了茉莉酸信號(hào)的傳遞，進(jìn)而抑制了植物的防衛(wèi)反應(yīng)并降低了寄主對(duì)線蟲的抗性。

4 結(jié)論

水稻OsCRRSP55基因?qū)儆贒UF26蛋白超家族，能響應(yīng)擬禾本科根結(jié)線蟲的侵染，同時(shí)能響應(yīng)水楊酸和茉莉酸甲酯脅迫。線蟲效應(yīng)子MgMO237與OsCRRSP55均能調(diào)控茉莉酸響應(yīng)基因OsERF87的表達(dá)。前期研究已表明MgMO237與OsCRRSP55相互作用，且MgMO237可抑制植物免疫反應(yīng)并增強(qiáng)植物感病性。綜上，推測(cè)MgMO237通過(guò)OsCRRSP55調(diào)控茉莉酸激素信號(hào)傳導(dǎo)，抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)，促進(jìn)線蟲寄生。