王惠 張順斌 金賀 王晗 張耕華 夏詩寧 陳井生 段玉璽

（1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，沈陽 110866；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院，哈爾濱 1500862；3. 沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院， 沈陽 110866）

大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines Ichinohe）是動物界、紐帶科、孢囊線蟲屬土傳內(nèi)寄生線蟲，其獨特的生物學特性和在惡劣條件下長期存活的能力使得它仍然是大豆產(chǎn)區(qū)病蟲害防治策略的目標之一［1］。大豆孢囊線蟲病在全世界各地均有發(fā)生，并造成了不同程度的危害［2］。它不僅通過侵染大豆根部影響地上部分的生理性狀，如葉片發(fā)黃、矮小等，而且也會使得大豆地下部分根瘤減少造成其他微生物對傷口的二次侵染［3］，甚至在條件適合的情況下，形成的孢囊在土壤中可以存活10年之久［4］。因此，對于大豆孢囊線蟲的防控治理顯得刻不容緩。

大豆孢囊線蟲入侵大豆根部，需破壞植物的細胞結構并進一步誘導形成使其生長發(fā)育的唯一營養(yǎng)結構合胞體（syncytia）。由此可見，大豆孢囊線蟲與大豆的互作涉及大豆的物理防御［5］及由物理防御誘發(fā)的其他防御反應。細胞壁作為維持植物細胞結構的一種物理障礙［6］，可以阻止真菌、細菌、線蟲等病原物對植物的侵害［7］，是防御大豆孢囊線蟲的關鍵因素之一。因此，將細胞壁與大豆孢囊線蟲抗性聯(lián)系起來［7］，通過分析細胞壁的生物學成分及其相關的調節(jié)因子有助于了解大豆孢囊線蟲的抗性機制。木質素作為構成細胞壁、內(nèi)皮層和凱氏帶的重要成分［8］，在植物逆境調控和細胞壁抗性中發(fā)揮關鍵作用，目前對木質素的研究涉及各種病蟲害脅迫下含量和相關基因的響應分析［9］，以及木質素降解和高值轉化利用［10］等，而關于大豆孢囊線蟲脅迫下木質素生物合成的關鍵酶4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumaric acid-CoA ligase）的響應和基因應答研究較少，因此本論文從細胞壁中木質素生物合成關鍵酶4CL出發(fā)，探討4CL在大豆孢囊線蟲脅迫中的響應機制。

1 大豆孢囊線蟲概況

1.1 大豆孢囊線蟲

大豆孢囊線蟲是大豆的重要病害［11］，分布于世界種植大豆的所有產(chǎn)區(qū)［3］。據(jù)統(tǒng)計，線蟲大概有4 100種，2012年研究者調查了線蟲的基本情況列舉出10種重要線蟲。其中，孢囊線蟲（cyst nematode）和根結線蟲（root-knot nematode）因需要建立取食結構供給營養(yǎng)較為突出而包含在其中［12］。大豆孢囊線蟲是一種土傳性病害，其孢囊在土壤中孵化出二齡幼蟲（second-stage juveniles，J2）［12］，J2只有在條件適宜并遇到合適寄主和相應的根系分泌物后才會對寄主根部進行侵染。大豆孢囊線蟲寄主相對專一，主要為豆科植物，但是在煙草、卷心菜等［13］也見其寄生為害。雖然大豆孢囊線蟲可以侵入非豆科植物，但在這些植物上一般不能完成生活史。大豆孢囊線蟲的生活史和致病特性使其成為研究植物-寄生線蟲寄生機制和致病機制的重要模型［1］，為本文的主要闡述對象。

1.2 大豆孢囊線蟲致病機制

大豆孢囊線蟲的生活史可以簡單歸類為3個時期：卵期、幼蟲期和成熟期［14］。其中J2在識別寄主之后通過口針刺入根組織來完成侵染［15］，這一過程會造成大豆根部的機械損傷，也是大豆受到二次感染和木質素沉積修復機械損傷的一個階段。前人研究發(fā)現(xiàn)由機械損傷引起的木質素積累和響應基因的表達，結合線蟲的致病機制，侵染初期木質素很可能也參與其中［16-17］，并通過木質化和衍生的細胞壁抗性對大豆孢囊線蟲抗性進行調控。J2穿透表皮組織后向維管組織遷移，整個過程依靠口針的反復刺入和分泌物的作用破壞表皮細胞和皮質［18］；幼蟲在到達維管束后開始建立取食位點并注入大量的分泌物來溶解相鄰細胞的細胞壁，細胞壁溶解后原生質體融合形成多核取食位點：合胞體［1］。綜上，在線蟲侵染初期和合胞體建立后期，植物寄生線蟲效應因子對宿主細胞壁的修飾作用均具有重要功能?？梢娪懻摌嫵杉毎诳剐缘哪举|素的生物合成與大豆孢囊線蟲抗性之間的關聯(lián)非常必要。

1.3 大豆孢囊線蟲防控

大豆孢囊線蟲的防治目前集中在輪作、生物防治及利用分子生物學手段進行抗性育種幾個方面。輪作指在大豆種植地區(qū)種植非宿主植物或抗感混種的方法，但輪作效果受到輪作植物、年限以及種植順序的影響，且由于線蟲在土壤中的久居性不能短時間內(nèi)從根本上控制線蟲，也不是防治線蟲達到增產(chǎn)的最佳方式。生物防治主要包括食線蟲真菌、內(nèi)寄生真菌、產(chǎn)生抗生素的真菌、調節(jié)植物應答反應的真菌及其誘導大豆系統(tǒng)獲得性抗性和誘導防御反應的真菌［19］，是一種更加友好的方式［20］。而利用分子生物學手段探究抗性機制，進行抗性育種是目前研究者進行大豆孢囊線蟲研究的一種方法，也是目前線蟲防治領域比較經(jīng)濟有效的手段之一［21］。大豆對SCN的抗性主要包括遺傳學分析中Rhg1編碼的氨基酸轉運體（amino acid transporter，GmAAT）、α-可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白（alphasoluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein，α-SNAP）、創(chuàng)傷誘導蛋白（N-ethylmaleimidesensitive factor，NSF）以及編碼絲氨酸羥甲基（serine hydroxymethyl-transferase，GmSHMT）的Rhg4。研究發(fā)現(xiàn)，過表達Rhg1、Rhg4編碼的序列導致該位點對大豆孢囊線蟲的抗性［22-26］，此外抗性基因也包括比較基因組［4］產(chǎn)生的GmHs1pro-1以及轉錄組測序發(fā)現(xiàn)的線蟲侵染后造成的不同代謝途徑差異表達基因［27-28］等。大豆抵御大豆孢囊線蟲的分子機制是一個復雜的過程，其涉及到線蟲生理小種、大豆品種以及自然選擇的調控。大豆孢囊線蟲的這種不可控性使得輪作、生物防治和抗性品種對大豆孢囊線蟲的治理都存在一定的時間局限性，其可能會隨著時間的增長使得線蟲產(chǎn)生抗性，故期望通過把線蟲抗性與木質素沉積導致的細胞壁增厚聯(lián)系起來，探究宿主植物的分子機制，延長植物的抗性周期［13，29］。

2 細胞壁抗性與木質素

2.1 木質素

木質素作為植物細胞壁主要組分之一，參與植物應對生物和非生物脅迫的響應。細胞壁是植物抵御病原侵染的物理障礙，也是病原與植物互作的重要場所，是一個動態(tài)的結構［30］。細胞壁主要由初生細胞壁、次生細胞壁組成［31］，初生細胞壁由纖維素、果膠等組成，次生細胞壁由木質素等組成。研究表明，線蟲在入侵宿主時會分泌纖維素降解酶和纖維素結合蛋白等效應因子，降解宿主細胞壁組分：纖維素，從而協(xié)助線蟲建立取食位點［31］。作為植物次生細胞壁的組分之一，木質素在細胞壁分解中具有重要作用［32］。次生細胞壁上的木質素可通過阻礙纖維素酶對纖維素的結合，抑制纖維素酶對纖維素的降解作用，并且與纖維素、半纖維素相連構成細胞骨架［33］，賦予細胞壁機械強度［34］，可見木質素是細胞壁抗性的重要組成部分。

木質素作為細胞壁成分可以維持細胞結構、運輸養(yǎng)分以及抵御病原物的入侵［35］，是植物生長發(fā)育的重要物質［36］。木質素作為植物次生細胞壁的主要成分［37］，是世界上僅次于纖維素的第二高分子聚合物［38］。木質素的基本結構單位是苯丙烷［39］，是通過莽草酸途徑、苯丙烷代謝途徑和木質素合成特異途徑產(chǎn)生的，其中苯丙烷代謝是植物次生物質合成的共有途徑，也是由次生代謝轉向木質素合成的關鍵代謝通路，而且病原體（包括大豆孢囊線蟲在內(nèi)）對細胞壁的刺激會觸發(fā)苯丙烷代謝的防御反應［40］。

木質素生物合成與苯丙烷代謝是上下游的連接關系，木質素來源于植物的苯丙烷代謝，由香豆醇、松柏醇、芥子醇衍生而來［41］。而這3種醇是由香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸等經(jīng)過一系列酶促反應產(chǎn)生的。2007年研究發(fā)現(xiàn)，在Williams82接種SCN3后，35 611個大豆轉錄本中的429個基因均有不同程度的響應，包括基礎代謝、苯丙烷代謝和木質素合成等［32-42］，可見木質素響應SCN3的脅迫。木質素與線蟲的響應目前在水稻、番茄、大豆［43-45］均有涉及，研究表明SCN4處理后抗病品種灰皮支中的木質素含量高于感病品種，增加了25.27%［45-46］，而Veronico和Khanam等［43-44］分別對番茄和水稻接種南方根結線蟲和水稻莖線蟲發(fā)現(xiàn)，抗病品種木質素的間苯三酚染色響應強于感病品，且抗病水稻接種后相對于感病品種其木質素含量上升，可見木質素沉積在抵御線蟲脅迫中發(fā)揮了重要的作用。

2.2 4CL參與苯丙烷代謝合成木質素

由莽草酸途徑起始的苯丙烷代謝途徑是植物合成木質素、黃酮、生物堿、水楊酸等次生代謝產(chǎn)物的重要途徑，主要是從苯丙氨酸起始，在苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化下生成相應的肉桂酸及其衍生物［5］，肉桂酸在肉桂酸羥化酶（C4H）作用下生成香豆酸及其衍生物，香豆酸及其衍生物在4CL催化作用下進行下一步代謝反應，其中木質素類高分子聚合物是苯丙烷代謝中重要一環(huán)［47］。

PAL與C4H、4CL是合成酚類、黃酮、木質素等次生代謝物質的關鍵酶［48］。其中PAL和C4H被認為是苯丙烷代謝途徑的通用調控酶［49］，PAL也是連接初生代謝和次生代謝的關鍵酶，也被稱為苯丙烷類代謝的中心酶，研究最為廣泛［50-51］，C4H是催化反式肉桂酸向對羥基香豆酸轉化的關鍵酶，屬于細胞色素P450單加氧酶，為下游木質素合成提供反應前體［52-54］。而4CL處于苯丙烷代謝分支點，是苯丙烷代謝途徑向木質素單體合成特異途徑的重要催化酶，決定了木質素單體的類型，保證了下游途徑的順利進行。此外除苯丙氨酸在PAL和C4H催化作用產(chǎn)生木質素合成的香豆酸前體之外，酪氨酸也可以不需羥基化酶的作用直接產(chǎn)生合成木質素通路的香豆酸［55］，也就是說不經(jīng)過PAL和C4H的催化也可以進行木質素的生物合成，因此4CL是苯丙烷代謝通路的重要調控物質，也是合成木質素單體的重要催化酶。

3 4CL的研究進展

3.1 4CL的起源和分類

4CL是?；せ蠲赶党蚣易宄蓡T［56-57］。其可以通過ATP活化羧酸酯的底物從而形成?；佘账岬闹虚g體，而此酰基腺苷酸中間體會與CoA形成相應的硫酯進而對木質素過程中的羧酸類底物進行催化［56］（圖1）。

圖1 4CL的催化機制［56］Fig.1 Catalytic mechanism of 4CL［56］

4CL常以基因家族的形式存在，具有廣泛的催化底物［58］，已在桂花［59］、擬南芥［60］、銀杏［61］、大豆［62］、金銀花［63］、水稻［64］、高粱［65］、毛白楊［66］等進行了克隆和功能分析，擬南芥具有At4CL1、At4CL2、At4CL3、At4CL4［60］四個基因家族成員，系統(tǒng)發(fā)育表明該基因家族被分為class1和class2［67-68］，class1主要負責木質素的生物合成，class2主要負責黃酮的生物合成。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的4CL1、4CL2、4CL3、4CL4均參與木質素的沉積，但4CL1是木質素沉積的主要參與者，4CL3主要負責黃酮的生物合成，只有在4CL1不存在時4CL2、4CL3、4CL4才可能會參與木質素合成［60，69］，因此4CL在植物體內(nèi)具有重疊但又不同的功能［69］，是黃酮和木質素單體合成過程中重要的調節(jié)物質［66］，可能受逆境影響發(fā)揮不同的生物學功能，進而決定了木質素合成的走向和木質素單體的類型。

3.2 4CL參與植物響應生物和非生物逆境脅迫

4CL是木質素合成途徑的限速酶［70］，主要催化香豆酸（coumalic acid）、阿魏酸（ferulic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、芥子酸（sinapic acid）等各類羥基肉桂酸生成相應的硫脂［39］，然后在肉桂酰CoA還原酶（cinnamoyl CoA reductase，CCR）、肉桂酰乙醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）等酶促反應下合成相應的單體醇，最后在過氧化物酶（peroxidase，POD）和漆酶（laccase，LAC）作用下氧化合成相應的木質素聚合物沉積在細胞壁中［41，55］，與纖維素、半纖維素共同形成了植物細胞壁的抗性屏障［71］。需要注意的一點是在諸如大豆孢囊線蟲等逆境脅迫下，植物會產(chǎn)生一系列的活性氧導致氧爆發(fā)。其中POD不僅參與了植物清除活性氧的過程［72-73］，而且木質素的降解也受到木質素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）、通用過氧化物酶（general peroxidase，GP）、錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）的調控［74-76］，由此推測，在大豆孢囊線蟲入侵植物根部時產(chǎn)生氧爆發(fā)，這誘導了POD的表達從而降解木質素使植株感病，而合成木質素的4CL為了抑制木質素的降解或病原物的侵染可能也會參與這一過程。

4CL通過催化輔酶A硫脂的形成在植物生長發(fā)育中發(fā)揮一定的作用［77］。Chen等［77］為了分析4CL對干旱脅迫的響應以及相應的代謝變化，將水曲柳Fm4CL-like1轉化煙草發(fā)現(xiàn)，轉化植株的木質素含量相對于野生型提高了39.5%，其他指標也有相應的優(yōu)勢，表明4CL參與了細胞壁的發(fā)育和木質素的合成，進而抵御非生物的脅迫。同時，2015年有研究發(fā)現(xiàn)，在應對鹽脅迫時楊樹中4CL2、4CL11、4CL12發(fā)生了明顯上調［78］?？梢?，4CL在應對非生物脅迫時產(chǎn)生了積極的脅迫響應。除參與非生物脅迫，Oliveira等［79］和Chen等［80］研究發(fā)現(xiàn)，在菌核盤菌與菜豆互作的基因表達譜也出現(xiàn)了4CL的響應情況，且在大豆中過表達4CL可顯著提高大豆對大豆疫霉菌的抗性。此外，趙晶［81］利用生防細菌Sneb159誘導木質素抗性的研究表明，4CL響應大豆孢囊線蟲的脅迫。

現(xiàn)有研究表明，4CL的基因表達受到LTF、PtoMYB216、PtrMYB3和PtrMYB20等MYB類轉錄因子的調控，在植物受到環(huán)境刺激時上述轉錄因子與4CL基因的啟動子結合激活4CL 基因的表達和正調控木質素的合成，以響應包括蚜蟲、干旱、機械損傷等在內(nèi)的各類生物和非生物脅迫［69，82-88］。綜上，4CL通過木質素的生物合成參與了植物的逆境調控過程。

4 小結與展望

大豆孢囊線蟲嚴重影響了大豆的產(chǎn)量，除了線蟲自身危害，還包含線蟲所導致的其他微生物對大豆的二次危害。因此，為了降低線蟲的危害，探索線蟲的致病機理和大豆本身的防御反應顯得刻不容緩。大豆孢囊線蟲的二齡幼蟲是其侵染階段，在17-23℃較為活躍，在其識別到宿主后開始入侵，其入侵的關鍵是需要二齡幼蟲不斷移動，到達植物組織的中柱定殖建立取食位點，形成合胞體。而定殖的關鍵是線蟲的移動，細胞壁作為細胞的保護組織具有機械保護性，線蟲想要定殖就必須溶解細胞壁才可以完成其生命周期，因此細胞壁對線蟲的定殖起到了限制作用。而細胞壁中的木質素是細胞壁發(fā)揮作用的重要成分，可見木質素的生物合成與線蟲侵染密切相關。

4CL作為一個基因家族，是苯丙烷代謝通路中關鍵酶，響應病原對大豆的脅迫［89］。目前關于4CL與木質素相關性的分析主要集中在組織特異 性［59，90］、正相關、負相關［91］或相同趨勢幾個方面，研究發(fā)現(xiàn)玉米的Zm4CL1［92］和柳枝稷的Pv4CL1突變體［93］與對照相比，均表現(xiàn)為木質素含量下降且Pv4CL1突變體次生細胞壁相對較薄，可見該基因的確參與了木質素和次生壁厚薄形成的生物過程，進而對植物自身的防御能力有積極的作用。在大豆孢囊線蟲研究領域，Itha等［94］和 Hosseini等［95］研究發(fā)現(xiàn)，合胞體發(fā)育過程中，木質素生物合成中的4CL在接種后的2、5、6、8、10 d響應了大豆孢囊線蟲的脅迫；過表達該基因時，其對線蟲的雌性指數(shù)幾乎沒有影響，但在抗病品種中4CL的確被誘導表達［96］，同時，根結線蟲處理后，4CL也響應表達［97］，可見在線蟲侵染過程中4CL響應線蟲脅迫。此外，線蟲、細菌、真菌等在入侵植物時也會分泌與苯丙烷代謝相關的分支酸變位酶等分泌物，因此線蟲分泌的分支酸變位酶可能與植物本身的分支酸變位酶存在競爭性從而抑制了植物本身的苯丙烷代謝所引起的防御反應，進而利于大豆孢囊線蟲的成功寄生?？梢?，線蟲和大豆之間競爭關系可能影響線蟲的抗性。根據(jù)以上特點，如若以4CL為媒介探討木質素的合成是否會影響細胞壁抗性進而抵御大豆孢囊線蟲的侵染非常必要。大豆孢囊線蟲的防治非常復雜，以木質素為出發(fā)點對抗線機制進行研究不僅可以從細胞壁角度對抗線蟲進行分析，而且通過4CL與木質素的研究也對木質素降解和細胞壁在逆境脅迫中的作用有一定的推動［98］。

木質素合成是一個復雜的通路，其受到多種酶的調控，而4CL作為其生物合成通路中重要轉折酶，其決定了木質素單體的類型，對其研究不僅可以了解其在應對不同條件脅迫下的響應，也可以對其基因家族成員的生物學功能及對大豆孢囊線蟲的抗性機制有更加清楚的認識。此外，由于線蟲自身分泌的分支酸變位酶與宿主的競爭從而影響木質素的生物合成，對4CL的研究可以明確該基因對抑制線蟲的競爭性互作具有積極作用。綜上，對大豆孢囊線蟲脅迫下4CL的潛在抗性機制進行研究具有重要的意義。