韓少杰 鄭經(jīng)武

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所，杭州 310058）

大豆（Glycine max）是世界范圍內(nèi)種植最多的豆科作物，是優(yōu)質(zhì)植物油料來源和食用、飼用蛋白質(zhì)主要來源。中國(guó)是大豆的原產(chǎn)國(guó)，有豐富的大豆飲食文化和悠久的大豆消費(fèi)習(xí)慣，目前大豆在我國(guó)的商用食用油、畜牧蛋白源飼料等領(lǐng)域需求量巨大，但我國(guó)受耕地、種植條件限制，大豆種植的效益較差，大豆種植規(guī)模不大，供需缺口主要依賴進(jìn)口。大豆主要種植國(guó)家有巴西、美國(guó)、阿根廷和中國(guó)。公開數(shù)據(jù)顯示，2020年度，我國(guó)大豆總進(jìn)口量超過1億t，創(chuàng)歷史新高，同期我國(guó)大豆產(chǎn)量1 920萬t。目前大豆作為國(guó)際重要貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)、對(duì)外貿(mào)易交往中扮演重要角色。

大豆孢囊線蟲病是威脅世界范圍內(nèi)大豆主要產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)安全的重大病害［1-2］。其病原物大豆孢囊線蟲（soybean cyst nematode，SCN，Heterodera glycinesIchinohe）系一種土傳、定居性、專性寄生的病原線蟲。僅美國(guó)1996-2016年期間，SCN造成的經(jīng)濟(jì)損失累計(jì)超過320億美元，平均每年超過15億美元以上［3］。SCN在美國(guó)大豆上造成的經(jīng)濟(jì)損失比其他所有大豆病害加起來的總和要多。

大豆孢囊線蟲在我國(guó)主要分布于東北、黃淮海、長(zhǎng)江中下游等主要的大豆產(chǎn)區(qū)，此外在浙江、江蘇、云南、貴州等20個(gè)省份都有報(bào)道，截止到2016年研究顯示該線蟲已擴(kuò)散到西北內(nèi)蒙等偏遠(yuǎn)地區(qū)，防控形勢(shì)嚴(yán)峻［4-5］。在我國(guó)，大豆孢囊線蟲可造成顯著產(chǎn)量損失：10%-50%減產(chǎn)［4］；東北和黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)危害土地面積大：每年危害達(dá)267萬hm2以上［5］；經(jīng)濟(jì)損失較大：大豆孢囊線蟲病每年可給我國(guó)造成1.2億美元經(jīng)濟(jì)損失［6］。因此，對(duì)大豆孢囊線蟲的防控研究意義重大。

在對(duì)大豆孢囊線蟲防控的諸多治理措施中，最綠色、經(jīng)濟(jì)的是作物輪作和抗性品種應(yīng)用，其中抗性品種的應(yīng)用是綠色防控最關(guān)鍵措施［1，8］。目前SCN抗性品種中的抗性相關(guān)基因，包括源于抗性大豆品種PI88788的rhg1-b以及源于PI548402/Peking的rhg1-a和Rhg4［9］，和其他一系列微效數(shù)量性狀抗性位點(diǎn)（QTL），如來源于PI468916的cqSCN-006和cqSCN-007，以及來源于PI567516C的Chr10-QTL等。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）和分離群體研究，目前已有報(bào)道超過300個(gè)SCN抗性相關(guān)QTLs，廣泛分布于大豆20個(gè)染色體中（圖1）。

圖1 已知SCN相關(guān)QTLs在大豆基因組圖譜中的分布示意圖Fig. 1 Distribution diagram of known SCN-related QTLs in soybean genetic map

大豆孢囊線蟲作為一種專性寄生線蟲，存在明顯的生理分化現(xiàn)象，按照其對(duì)不同抗性背景寄主表現(xiàn)出的致病力差異可以細(xì)分為不同的生理小種［10］。國(guó)內(nèi)外隨著單一抗性位點(diǎn)在田間連年應(yīng)用，SCN生理小種群體也在抗性篩選壓力下隨之不斷進(jìn)化，導(dǎo)致現(xiàn)有的天然抗性基因抗性降低［11-14］。在天然抗性原本就有限，面臨失效而枯竭的大背景下，如何深入研究現(xiàn)有抗性位點(diǎn)的抗性機(jī)制、發(fā)掘轉(zhuǎn)基因株系的優(yōu)質(zhì)抗性基因靶標(biāo)，是我國(guó)乃至全世界大豆孢囊線蟲綠色防控研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。近年來越來越多的研究者在大豆對(duì)SCN抗性相關(guān)基因的發(fā)掘、相關(guān)基因的生理生化功能以及抗性機(jī)制等方面的研究有許多突破。本文概述近年來有關(guān)大豆對(duì)SCN抗性相關(guān)基因的功能研究進(jìn)展，并對(duì)未來研究的前景和發(fā)展方向進(jìn)行了探討。

1 SCN抗性相關(guān)QTL位點(diǎn)基因功能的研究

由于植物病原線蟲的獨(dú)特屬性，其與已知的病原-植物寄主互作機(jī)制可能有所不同。一個(gè)明顯的例子就是現(xiàn)知SCN抗性位點(diǎn)編碼的抗性蛋白沒有傳統(tǒng)病原微生物表面分子模式受體蛋白（pattern recognition receptors，PRRs）或者胞內(nèi)NLR受體蛋白（nucleotide-binding-leucine-rich-repeat，NLR），并且?guī)讉€(gè)已知的重要QTL附近的LRR-RKLs激酶都被離體的抗性實(shí)驗(yàn)證明沒有抗SCN的功能［15-16］。這些結(jié)果都暗示大豆孢囊線蟲可能由于其動(dòng)物屬性，在與寄主互作過程中，更具有活力和主動(dòng)性，在病原識(shí)別機(jī)制上可能有獨(dú)立于傳統(tǒng)植物微生物免疫識(shí)別激活機(jī)制的特殊機(jī)制。近年來，隨著大豆基因芯片、二代轉(zhuǎn)錄測(cè)序和顯微激光切割等技術(shù)的應(yīng)用，以及全基因組測(cè)序普及大豆基因組圖譜的不斷精細(xì)化完善，越來越多的SCN抗性相關(guān)潛在基因和其功能被報(bào)道［17-23］。通過EMS突變經(jīng)典的感病或抗性品種，得到遺傳穩(wěn)定的二代突變體后代，再結(jié)合傳統(tǒng)定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)（targeting-induced local lesions in genomes，TILLTING）或TILLTING加二代測(cè)序方法，進(jìn)行正向或反向遺傳學(xué)篩選也是一個(gè)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證潛在抗性基因的有效手段［24-25］。目前，隨著對(duì)一些已知重要抗性位點(diǎn)編碼的基因和表達(dá)受SCN侵染調(diào)控的相關(guān)基因的深入研究，SCN與大豆互作的機(jī)制也逐步完善。

大豆抗性相關(guān)QTL中，研究最充分的是最重要的兩個(gè)主效抗性位點(diǎn)Rhg1和Rhg4。下面，將分別從兩個(gè)位點(diǎn)編碼基因的功能、基因結(jié)構(gòu)特征以及二者協(xié)作機(jī)制等方面做詳細(xì)介紹。

1.1 Rhg1

Rhg1（Resistance to Heterodera glycines 1）是 最早源于經(jīng)典品種PI88788的主效抗性位點(diǎn)，位于18號(hào)染色體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)SCN主栽抗性的品種中，95%以上（共810種）品種抗性均來自于PI88788株系中Rhg1位點(diǎn)［26］，可見該位點(diǎn)提供抗性的穩(wěn)定性和實(shí)用性。Cook等［27-28］通過染色體熒光原位雜交（FISH）等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)，Rhg1是一段長(zhǎng)31.2 kb的基因片段，其多拷貝化與SCN抗性產(chǎn)生有直接關(guān)系。該研究發(fā)現(xiàn)，以Williams 82為代表的野生型感病品種Rhg1只有一個(gè)拷貝，稱作Rhg1單拷貝型或rhg1-c型；以PI548402/Peking為代表的抗性品種有2-3個(gè)串聯(lián)多拷貝，稱作Rhg1低拷貝或rhg1-a型；以PI88788為代表的抗性品種有7-10個(gè)串聯(lián)多拷貝，稱作Rhg1多拷貝或rhg1-b型。最近，隨著大豆泛基因組測(cè)序注釋成功，發(fā)現(xiàn)基因的多拷貝化在大豆泛基因組中廣泛存在［29］，該文正好是對(duì)大豆基因多拷貝化的生物學(xué)意義的一個(gè)注解。對(duì)不同Rhg1拷貝數(shù)大豆樣品中Rhg1編碼的4個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未侵染條件下，越多拷貝數(shù)Rhg1，有越高的轉(zhuǎn)錄水平［28］。不同拷貝數(shù)的Rhg1表現(xiàn)出各自獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)的差異，如SNP、片段插入、缺失的多態(tài)性。DNA的變異對(duì)基因表達(dá)、抗性的影響仍待研究。

Rhg1位點(diǎn)編碼的4個(gè)基因其中有3個(gè)被證明參與了Rhg1高拷貝品種對(duì)SCN的抗性反應(yīng)［27］。這3個(gè)基因分別是：Glyma.18G022400（Wm82.a1，Glyma18g02580）編碼一個(gè)可能的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白GmAAT；Glyma.18G022500（Wm82.a1，Glyma18g02590）編碼參與細(xì)胞囊泡運(yùn)輸過程的功能保守蛋白α-SNAP（α-soluble NSF attachment protein，也稱SNAP18）；以及Glyma.18G022700（Wm82.a1，Glyma18g02610）編碼一個(gè)含有WI12損傷誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的蛋白WIP。擬南芥和茄科馬鈴薯轉(zhuǎn)化大豆源Rhg1位點(diǎn)后，分別表現(xiàn)出對(duì)甜菜孢囊線蟲（Heterodera schachtii）、馬鈴薯金線蟲（Globodera rostochiensis）和馬鈴薯白線蟲（G. pallida）相應(yīng)抗性的增加［30］。

Rhg1位點(diǎn)編碼的α-SNAP蛋白以不同機(jī)制參與到以上兩種不同類型的抗性反應(yīng)中，是大豆對(duì)SCN抗性互作中研究較為深入的功能蛋白［31-33］。α-SNAP是參與細(xì)胞囊泡運(yùn)輸過程的功能保守蛋白，與NSF（N-ethylmaleimide sensitive factor）蛋 白 互作形成復(fù)合體參與SNARE（soluble NSF attachment protein receptor）的回收。α-SNAP在SCN侵染的抗性反應(yīng)中能夠特異性聚集表達(dá)在SCN的取食細(xì)胞合胞體中［31，34］。不同Rhg1拷貝數(shù)大豆品種編碼的α-SNAP存在氨基酸多態(tài)性差異，這些C末端變異導(dǎo)致了其與NSF結(jié)合能力發(fā)生差異，間接影響了細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸回流機(jī)制。過表達(dá)多拷貝Rhg1編碼的α-SNAP可以造成植物細(xì)胞死亡，而野生型感病品種的α-SNAP則不能［31］。而α-SNAP本身作為細(xì)胞生命活動(dòng)必須的看家基因，抗性類型α-SNAP發(fā)生的突變，對(duì)植物自身生命活動(dòng)也產(chǎn)生了威脅；研究發(fā)現(xiàn)，為了平衡抗性品種中突變?chǔ)?SNAP對(duì)植物細(xì)胞的毒性，幾乎所有已知含有抗性類型α-SNAP的大豆品種都共同進(jìn)化出一個(gè)與其結(jié)合能力更強(qiáng)的NSFRan07，以此保持基本的細(xì)胞生命活動(dòng)不受影響［33］。α-SNAP的不同突變型發(fā)揮不同生理功能，從一個(gè)角度說明Rhg1不僅拷貝數(shù)差異，也可以通過自身基因序列變異共同影響對(duì)SCN抗性［32，35］。α-SNAP在11號(hào)染色體上的同源基因SNAP11（Glyma.11G234500）被證實(shí)是參與SCN抗性的微效基因，一同參與了Peking類型抗性的大豆寄主對(duì)SCN的抗性［36-37］。

Rhg1位點(diǎn)編碼的另外一個(gè)抗性相關(guān)基因GmAAT的抗性機(jī)制研究目前仍處于初級(jí)階段。與α-SNAP不同，GmAAT在不同Rhg1單倍型（haplotype）中不存在氨基酸序列的差異，暗示了其兩者可能存在截然不同的作用機(jī)制。沉默GmAAT可以導(dǎo)致大豆對(duì)SCN抗性受損［27］；GmAAT含有保守的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，但尚沒有直接證據(jù)證明該蛋白在大豆中可以直接行使轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能。過表達(dá)GmAAT的大豆對(duì)過量谷氨酸的耐受度增加，間接證明其有影響谷氨酸耐受度的相關(guān)功能［38］。過表達(dá)GmAAT能夠激活茉莉酸信號(hào)通路，可能通過激活植物激素通路影響抗性，具體的互作機(jī)制仍未知［38］。通過GmAAT特異抗體，應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)觀察GmAAT在SCN侵染下的原生表達(dá)定位狀態(tài)，在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)SCN入侵根系的侵染前期，只有在被SCN穿過的細(xì)胞內(nèi)會(huì)特異性增加GmAAT蛋白的聚集，并在線蟲直接接觸的細(xì)胞內(nèi)形成含有GmAAT免疫定位的抗性囊泡。Rhg1的拷貝數(shù)與前期GmAAT在相關(guān)結(jié)構(gòu)中的富集倍數(shù)正相關(guān)，這種GmAAT表達(dá)量與囊泡聚集的程度與Rhg1介導(dǎo)的抗性相關(guān)［39］。進(jìn)一步蛋白互作篩選發(fā)現(xiàn)，植物先天免疫ROS產(chǎn)生機(jī)制中的重要起始蛋白組分RBOHC2可以與GmAAT在囊泡中發(fā)生特異性蛋白互作，二者共同表達(dá)可以在植物細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS前體超氧陰離子O2-。這些可能產(chǎn)生于線蟲周邊囊泡的O2-可以進(jìn)一步在體外被轉(zhuǎn)化成過氧化氫，直接其作用于線蟲或者作為二級(jí)信號(hào)因子誘發(fā)下游更強(qiáng)烈的抗性反應(yīng)［39］。Chen等［40］也報(bào)道Rhg1不同拷貝數(shù)抗性品種間ROS積累的速度和程度有差異，且ROS的產(chǎn)生機(jī)制與寄主對(duì)SCN抗性直接相關(guān)。GmAAT形成的抗性囊泡的生理生化屬性以及GmAAT以怎樣的分子機(jī)制參與其他植物激素信號(hào)通路如SA、乙烯等仍待進(jìn)一步研究?，F(xiàn)有的研究表明GmAAT與α-SNAP雖同屬一個(gè)主效抗性位點(diǎn)，但二者從蛋白定位和生理功能的角度看，產(chǎn)生抗性的機(jī)制截然不同。

Rhg1位點(diǎn)編碼的第三個(gè)抗性相關(guān)蛋白WIP研究較少，其他物種同源蛋白的相關(guān)研究也比較缺失；由于其蛋白序列較短，難以發(fā)現(xiàn)更有價(jià)值的功能結(jié)構(gòu)域。其含有疑似損傷誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的具體生理功能也待證實(shí)。但WIP很可能通過與其他蛋白（包括Rhg1位點(diǎn)編碼的其他蛋白）互作而參與損傷誘導(dǎo)病程相關(guān)分子模式（wound-inducible DAMPs，damage associated molecular patterns）在植物與植物線蟲互作中扮演SCN侵染預(yù)警的作用。

1.2 Rhg4

Rhg4位于第8號(hào)染色體，是源于Peking和PI437654的主效、顯性QTL之一［41-43］。劉世名等［44］在2012年通過TILLTING經(jīng)典反向遺傳學(xué)方法，鑒定到了Rhg4位點(diǎn)基因絲氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxymethyltransferase，SHMT，也 稱SHMT08）。SHMT的突變可影響Peking抗性類型寄主的抗性反應(yīng)。類似于α-SNAP，SHMT是一個(gè)行使看家功能的蛋白，是參與體內(nèi)葉酸合成信號(hào)通路的生化酶。野生型和Peking類型抗性大豆中SHMT基因只有五處序列變異，但產(chǎn)生顯著感病和抗性的生物學(xué)差異，突變位點(diǎn)與表型之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。值得注意的是，類似于α-SNAP，SHMT特異表達(dá)在線蟲侵染所形成的合胞體細(xì)胞中［44］。通過遺傳篩選，SHMT的結(jié)構(gòu)和抗性功能得到了進(jìn)一步驗(yàn)證［45］。

與Rhg1發(fā)生多拷貝化類似，最近通過全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)Rhg4也存在約長(zhǎng)35.7 kb的串聯(lián)重復(fù)序列，多高倍化也可導(dǎo)致其編碼基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)［46］。該段Rhg4位點(diǎn)包含了3個(gè)基因：Glyma.08g108800（Wm82.a1，Glyma08g11480），Glyma.08g108900（S H M T，Wm82.a1，Glyma08g11490）和Glyma.08g109000（Wm82.a1，Glyma08g11500）。此外，Rhg4也同樣存在單倍型變異，主要分為以野生型為代表的Rhg4-b（單拷貝）和以Peking為代表的抗性Rhg4-a（1-4.3個(gè)拷貝數(shù)）［46］。SHMT08在Peking和PI88788等抗性品種中存在一個(gè)與感病品種不同的抗性類型啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子變異與更廣譜的SCN抗性相關(guān)［46］；PI548655（Forrest，Peking類型的抗性品種）和PI88788等抗性品種中SHMT08在SCN侵染早期的轉(zhuǎn)錄水平也都較野生型升高約2倍［47］。說明抗性類型的啟動(dòng)子可能在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮侵染早期調(diào)控作用。Rhg1、Rhg4基因組學(xué)結(jié)合SCN抗性表型的功能基因組學(xué)研究再次證明大豆普遍地通過對(duì)自身特定基因位點(diǎn)的多拷貝化和序列結(jié)構(gòu)變異來適應(yīng)外界病原物的入侵?；蜃兓cSCN抗性之間對(duì)關(guān)聯(lián)，尤其是表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

1.3 Rhg1和Rhg4協(xié)作

Rhg1和Rhg4同屬于重要的抗性位點(diǎn)，雖然作用機(jī)制各不相同，但二者有著很大的關(guān)聯(lián)性和相似性，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，這兩個(gè)位點(diǎn)編碼的功能蛋白SHMT8和α-SNAP之間存在互作，共同存在于一個(gè)蛋白復(fù)合體中，行使的具體功能及作用機(jī)制仍未知［48］。其次，Rhg1拷貝數(shù)少于5.6倍時(shí)，不能獨(dú)立提供足夠的SCN廣譜抗性，必須要與Rhg4協(xié)作，這種Rhg1低拷貝加抗性Rhg4的組合統(tǒng)稱為Peking型抗性（Rhg1-a+Rhg4-a/Rhg4-c），具體協(xié)作機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究［43，46，49］。第三，隨著進(jìn)化，抗性品種中的Rhg1與Rhg4都有多個(gè)不同抗性類型的同源基因，表現(xiàn)為存在豐富的導(dǎo)致氨基酸序列變化的單核苷酸多態(tài)性變化（non-synonymous SNPs），這些變異帶來的基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)功能變化仍待深入研究。第四，二者都通過多拷貝化發(fā)揮額外抗性功能。越高拷貝數(shù)的Rhg4，能產(chǎn)生對(duì)多種不同毒力小種的SCN更廣譜的抗性；Rhg1有更多拷貝數(shù)時(shí)，可以獨(dú)立提供足夠的抗性。第五，對(duì)106個(gè)大豆品系的全基因組重測(cè)序結(jié)果顯示，Rhg1和Rhg4基因位點(diǎn)啟動(dòng)子和基因序列中的特定突變以及拷貝數(shù)差異共同決定了對(duì)不同SCN生理小種的抗性［46］，這種抗性基因與病原生物共進(jìn)化的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

2 囊泡運(yùn)輸與SCN抗性

囊泡運(yùn)輸泛指生物細(xì)胞通過細(xì)胞膜包被運(yùn)輸活性物質(zhì)與其他細(xì)胞或者外部環(huán)境發(fā)生交流的進(jìn)程，包括胞內(nèi)吞和外排等復(fù)雜的過程［50］。囊泡運(yùn)輸對(duì)植物免疫意義重大，細(xì)胞間隙中的游離抗性蛋白分子通過該進(jìn)程被分泌后而發(fā)揮作用；植物表面抗性分子受體通過該進(jìn)程被內(nèi)吞后發(fā)揮激活下游通路的作用，囊泡運(yùn)輸通路的蛋白組分往往是病原物攻擊挾持抗性的靶標(biāo)［51］。

外排囊泡（exocyst）作為受體蛋白行使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)生理功能。具體功能機(jī)制為：作為“橋梁”直接連接外來囊泡和受體蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)SNARE蛋白復(fù)合物聚集，調(diào)節(jié)膜融合的過程。外排囊泡結(jié)構(gòu)上是一個(gè)八聚物復(fù)合體，在酵母中的相關(guān)研究已鑒定出8個(gè)蛋白組分：分別為Sec3p（EXOC1）、Sec5p（EXOC2）、Sec6p（EXOC3）、Sec8p（EXOC4）、Sec10p（EXOC5）、Sec15p（EXOC6）、Exo70p（EXOC7）和Exo84p（EXOC8）。外排囊泡每個(gè)分子組分都有各自參與植物抗性的分子機(jī)制。在大豆中，外排蛋白PR-1（Glyma.15g062400）被直接證明參與對(duì)SCN抗性，暗示外排囊泡途徑參與對(duì)SCN抗性［52］；Sec4p可以與Sec15p（EXOC6）互作而調(diào)控外排囊泡的組裝，通過類似機(jī)制，大豆中過表達(dá)Sec4直接增強(qiáng)對(duì)SCN抗性［53］。大豆中外排囊泡所有組分蛋白同源基因都被鑒定出，且合胞體中每個(gè)組分都有代表性的基因表達(dá)顯著上調(diào)，暗示外排囊泡參與了大豆對(duì)SCN抗性。在感病品種Williams 82中過表達(dá)外排囊泡組分基因能給增強(qiáng)抗性，而在抗性品種Peking中沉默相關(guān)基因則能夠使植物變得更感?。?4］。

SNARE可以介導(dǎo)囊泡的融合，是囊泡運(yùn)輸重要一環(huán)。而膜融合完成后，SNARE的解離和再利用需要NSF和α-SNAP蛋白，這三者共同形成一個(gè)超級(jí)復(fù)合物20S，參與囊泡運(yùn)輸組分再利用的過程［55］。通過對(duì)SCN侵染后根系細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析得知，20S復(fù)合體相關(guān)組分的表達(dá)發(fā)生特異上調(diào)［52］。前文已有介紹，α-SNAP是Rhg1位點(diǎn)編碼的重要抗SCN蛋白。綜上說明囊泡融合機(jī)制組分可能是SCN侵染重要靶標(biāo)，囊泡融合進(jìn)程可能是抗性產(chǎn)生的關(guān)鍵。

突觸融合蛋白（syntaxin，SYN）屬于SNARE蛋白復(fù)合體的一部分，這意味著syntaxin與α-SNAP蛋白存在物理互作。大豆中，過表達(dá)α-SNAP可以引起SYN 31表達(dá)上調(diào)，且SYN 31在大豆與SCN抗性反應(yīng)中合胞體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，過表達(dá)SYN 31可使感病品種轉(zhuǎn)化根系獲得對(duì)SCN抗性［56］。擬南芥PEN1大豆同源蛋白SYN 121的過表達(dá)可以產(chǎn)生SCN抗性，SYN 121與其他SNARE復(fù)合體相關(guān)基因在被侵染的大豆細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)［57］。最新研究表明，α-SNAP可與t-SNARE家族的兩個(gè)syntaxin蛋白互作（SYN 12，Glyma.12g194800和SYN 16，Glyma.16g154200），這兩個(gè)syntaxin蛋白均被報(bào)道位于SCN抗性QTL中。在Peking抗性品種大豆中應(yīng)用CRISPR技術(shù)沉默這兩個(gè)syntaxin基因，可以發(fā)現(xiàn)抗性受損［58］。20S粒體組分中的另一個(gè)與SNARE緊密互作的蛋白復(fù)合體COG參與調(diào)控膜融合進(jìn)程，也被報(bào)道直接影響SCN抗性反應(yīng)。過表達(dá)COG基因可以顯著抑制SCN寄生，在Peking抗性品種中沉默COG基因可以顯著影響抗性，說明COG參與到SCN抗性反應(yīng)中，而具體的抗性機(jī)制待研究［59］。綜上，囊泡運(yùn)輸對(duì)于SCN致病性和寄主抗性至關(guān)重要，但更直接的作用證據(jù)和詳細(xì)的作用機(jī)制仍待需繼續(xù)探究。

3 植物激素與SCN抗性

植物激素是指一類可以調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的小分子物質(zhì)，主要包括：生長(zhǎng)素、乙烯、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、油菜素內(nèi)酯、茉莉酸、水楊酸、獨(dú)腳金內(nèi)酯等。近年來，越來越多的小肽段也被證明參與植物的特定生命進(jìn)程，在本文中將其歸為植物激素的大類中加以討論。在SCN與寄主互作后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中，大量激素通路組分被發(fā)現(xiàn)受到了SCN侵染調(diào)控。植物激素通路的抗線蟲功能一直是本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

3.1 乙烯

乙烯信號(hào)通路對(duì)植物根系發(fā)育至關(guān)重要，其參與對(duì)SCN抗性功能尚大部分未知。Hu等［60］報(bào)道了乙烯信號(hào)通路參與根系對(duì)SCN吸引的調(diào)控：乙烯抑制劑處理的大豆根系對(duì)SCN的吸引程度明顯增加。分子層面，一部分乙烯前體ACC合成酶家族基因的表達(dá)也受到SCN侵染的調(diào)控而上調(diào)［61］。此外，乙烯信號(hào)通路的下游轉(zhuǎn)錄因子也被證明在SCN侵染后表達(dá)上調(diào)：結(jié)合GCC-box的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子GmEREBP1在被SCN侵染的感病品種中表達(dá)下調(diào)，而在抗性品種中表達(dá)上調(diào)［62］。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明乙烯通路可能通過該類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控乙烯響應(yīng)基因，如PR3、PDF1.2等在SCN侵染后的表達(dá)［63］。

3.2 生長(zhǎng)素

生長(zhǎng)素信號(hào)通路參與對(duì)SCN抗性的相關(guān)研究較少。生長(zhǎng)素負(fù)調(diào)控基因ADR12在SCN侵染的大豆根系中表達(dá)下調(diào)［64］。SCN侵染后合胞體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜的測(cè)定證實(shí)了IAA和ARF等生長(zhǎng)素信號(hào)通路相關(guān)基因在大豆與SCN互作中表達(dá)受到顯著的調(diào)控［17］，而具體的作用機(jī)制未知。

3.3 水楊酸

植物水楊酸在植物早期響應(yīng)病原物侵染，激活下游防御信號(hào)通路中有重要作用。關(guān)于水楊酸參與大豆對(duì)SCN抗性證據(jù)來自于大豆水楊酸甲基轉(zhuǎn)移酶（GmSAMT1）的相關(guān)研究［65］。直接在感病品種中過表達(dá)GmSAMT1可以顯著抑制線蟲發(fā)育，增強(qiáng)抗性。過表達(dá)GmSAMT1的大豆根系中，SA信號(hào)通路相關(guān)基因（GmNPR1、GmICS1）的表達(dá)也被顯著激活［65］。因此，在抗性品種中，可能通過更快速積累SA的合成相關(guān)生化酶GmSAMT1來激活SA通路產(chǎn)生SCN抗性。

3.4 小肽類激素

植物頂端發(fā)育復(fù)合受體CLAVATA在莖尖和根尖分生組織發(fā)育中有重要作用。其配體是一段12氨基酸組成的小肽段激素CLV3，屬于CLE（Clavat Like Elements）家族。植物寄生線蟲廣泛分泌一類CLE模擬物效應(yīng)子，來調(diào)控植物根系發(fā)育幫助其侵染。大豆中CLV3受體蛋白被證實(shí)可以特異與SCN CLE類效應(yīng)子結(jié)合，沉默該受體后導(dǎo)致對(duì)SCN抗性增加［66］。最新研究表明，對(duì)SCN CLE類效應(yīng)子結(jié)構(gòu)功能分析得知，其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)特異的功能域（motif），負(fù)責(zé)將該類效應(yīng)子蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，線蟲CLE效應(yīng)子可以劫持植物細(xì)胞分泌系統(tǒng)進(jìn)行胞外輸出分子信號(hào)蛋白［67］。

此外，植物激發(fā)子肽（plant elicitor peptides，PEP）被證明參與調(diào)控SCN抗性。用PEP1、PEP2和PEP3處理大豆種子后，對(duì)SCN增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，PEP處理可以通過激活ROS誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生SCN抗性［68］。關(guān)于植物激發(fā)子肽誘導(dǎo)抗性的具體分子機(jī)制有很大研究潛力。

4 其他作用機(jī)制

合胞體形成的一個(gè)顯著變化就是寄主細(xì)胞壁降解。很多線蟲的效應(yīng)子被認(rèn)為有細(xì)胞壁消化酶作用。而寄主的細(xì)胞壁合成通路參與SCN抗性少有報(bào)道。最近，細(xì)胞壁合成相關(guān)調(diào)控糖支鏈延長(zhǎng)的生化酶GmXTH43被發(fā)現(xiàn)在合胞體細(xì)胞中特異表達(dá)；在感病品種中過表達(dá)該酶，可以提高大豆抗性；推測(cè)這種酶可能通過影響細(xì)胞壁的形成而作用于合胞體［69］。這是又一例基礎(chǔ)生化酶參與到SCN抗性反應(yīng)的例子，但更深入的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

此外，最近有研究報(bào)道通過過表達(dá)一個(gè)質(zhì)膜定位的廣譜抗性基因disease resistance 1（GmDR1，Glyma.10g094800）可以增加植物對(duì)SCN、蚜蟲以及真菌病害的抗性，具體調(diào)控機(jī)制未知［70］。

5 總結(jié)及展望

大豆對(duì)SCN抗性基因的功能研究取得了較大進(jìn)展，但仍有不足。具體體現(xiàn)在：首先，目前抗性新基因的發(fā)現(xiàn)多從轉(zhuǎn)錄組學(xué)、功能基因組學(xué)出發(fā)，對(duì)于更精細(xì)的基因表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳學(xué)調(diào)控、線蟲特異啟動(dòng)子響應(yīng)機(jī)制等研究仍有欠缺。其次，潛在的抗性基因靶標(biāo)往往都是參與生命活動(dòng)必須的基因，對(duì)他們的沉默可能造成植物根系發(fā)育、生長(zhǎng)的缺陷，從而產(chǎn)生間接的抗性表型。因此單一通過基因沉默實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)基因的抗性功能時(shí)要注意轉(zhuǎn)基因的根系發(fā)育情況對(duì)SCN增殖的影響。第三，目前尚不清楚對(duì)SCN抗性相關(guān)基因與已知植物免疫通路之間的具體互作機(jī)制。線蟲侵染中損傷信號(hào)誘導(dǎo)的初級(jí)防御反應(yīng)與現(xiàn)知的PTI反應(yīng)通路的區(qū)別、聯(lián)系以及線蟲分泌到寄主細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)子是否也引起經(jīng)典的ETI反應(yīng)，這些問題都需要進(jìn)一步研究。在大豆體系內(nèi)以已知重要抗性參與蛋白為誘餌進(jìn)行互作蛋白篩選有助于回答上述問題，也可以幫助更好地厘清SCN與大豆寄主之間互作通路。第四，我國(guó)作為大豆原產(chǎn)國(guó)，有豐富的大豆種質(zhì)資源，野生型大豆Glycine soja可作為豐富的基因庫來源，極有可能蘊(yùn)含了豐富的與現(xiàn)有栽培品種不同的抗性基因，以野生型大豆為研究對(duì)象進(jìn)行的抗性基因發(fā)掘工作有待進(jìn)一步開展。第五，現(xiàn)階段單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅猛，可從單細(xì)胞尺度描繪生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄圖譜；線蟲侵染大豆的親和和不親和互作中也有幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在這些抗性發(fā)生質(zhì)變的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)選取合胞體細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序構(gòu)建更精細(xì)的轉(zhuǎn)錄圖譜有助于理解SCN對(duì)寄主的致病力和寄主的抗性防御反應(yīng)進(jìn)程。最后，以線蟲為中心的致病性研究同樣重要，尤其是線蟲效應(yīng)子的鑒定和功能驗(yàn)證相關(guān)工作，SCN分泌生化信息素如蛔甙（ascarosides）的分類和功能鑒定，以及針對(duì)植物病原線蟲開發(fā)相關(guān)基因操作技術(shù)都有極大的發(fā)展和應(yīng)用空間。

關(guān)于大豆孢囊線蟲抗性機(jī)制的研究有助于理解植物病原線蟲與寄主的互作機(jī)制，為傳統(tǒng)育種提供參考，也為抗性轉(zhuǎn)基因株系的構(gòu)建提供有價(jià)值的靶標(biāo)，對(duì)我國(guó)在相關(guān)育種和科研領(lǐng)域獲得自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)意義重大。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和我國(guó)對(duì)科技的不斷投入，大豆孢囊線蟲綜合綠色防控在理論、研究和實(shí)踐應(yīng)用中定會(huì)取得較大突破。新的理論、理念和實(shí)踐將在維護(hù)全球大豆生產(chǎn)安全、確保我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)安全中起重要作用。