陳伯斯，高 尚，張宏斌，王堂花，楊汶菱

（海鴻農(nóng)牧（廣州）有限公司，廣東 廣州510000）

馬立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）是少數(shù)幾種能在自然宿主中誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤的皰疹病毒之一，屬于皰疹病毒科皰疹病毒亞科。由其引起雞馬立克氏病可以普遍發(fā)生在病雞的各種組織和器官中，以外周神經(jīng)淋巴樣細胞浸潤和包括虹膜、皮膚在內(nèi)的各種器官和組織的單核細胞浸潤、腫大，進而形成腫瘤為主要特征，給雞群帶來的發(fā)病率一般為1%～30%不等，有時甚至可高達60%。

在現(xiàn)在以及可預(yù)見的未來，疫苗接種是防控MD的中心策略。隨著MDV毒力在過去幾十年間的不斷增強，致使疫苗的使用也在發(fā)生改變，HVT等凍干苗使用量在不斷減少。目前，國內(nèi)廣泛使用的馬立克氏病活疫苗主要包括CVI988-Ris pens株及814株。雖然馬立克氏病活疫苗的免疫已經(jīng)相對成熟，但臨床免疫中卻往往出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象。本文通過814株的病例追蹤并結(jié)合生產(chǎn)實際，總結(jié)了該疫苗免疫失敗的原因，為同行免疫該疫苗提供依據(jù)。

1 疫苗及稀釋液的保存運輸

由于馬立克氏病病毒是一種嚴格的細胞結(jié)合性病毒，所以由其制成的活疫苗，必須嚴格保存在－196℃的液氮中，任何使得疫苗暴露在液氮之外的操作都會引起疫苗溶解而失效。這就要求疫苗在運輸過程中必須保證液氮罐直立狀態(tài)，并減少碰撞。接收疫苗的第一時間，需要檢查液氮面是否位于疫苗之上，否則棄用。由于在日常使用中需要反復(fù)打開液氮罐口，導(dǎo)致液氮揮發(fā)，為保證疫苗質(zhì)量，日常管理中需要及時檢查液氮高度并添補液氮。

稀釋液作為稀釋疫苗的溶液，可避光常溫保存。因其具備很高的營養(yǎng)成分，容易受到病原微生物的污染，所以在運輸及保存過程中需要嚴格篩除包裝破損、溶液渾濁變色的稀釋液。目前，不同廠家稀釋液的配制方法不同，對疫苗的保護效果也不同。以科前生物公司的馬立克氏病疫苗（814株）專用稀釋液為例，稀釋配套疫苗40min后檢測效價，疫苗的損失率在5%之內(nèi)，而改變配方成分的稀釋液和進口稀釋液在稀釋完疫苗的40min內(nèi)，疫苗的損失率在30%～50%?？梢姙楸ＷC免疫效果，切不可混用不同廠家的稀釋液。

2 疫苗免疫

2.1 免疫前準(zhǔn)備

在免疫前，需要檢查疫苗的規(guī)格。目前馬立克氏?。?14株）疫苗具備2000羽/瓶及1000羽/瓶兩種規(guī)格，若將1000羽份規(guī)格錯當(dāng)2000羽份使用，則會造成免疫的蝕斑數(shù)降低，引起免疫失敗。取出規(guī)范保存的疫苗后，首先需要觀察安瓿瓶瓶身的完整性，對出現(xiàn)瓶身不完整疫苗，應(yīng)當(dāng)廢棄處理。若觀察發(fā)現(xiàn)安瓿瓶小頭端有疫苗殘留，說明該瓶疫苗出現(xiàn)凍融情況，也應(yīng)廢棄處理。稀釋液則檢查包裝完整性及液體是否澄清，若是冷藏保存，則應(yīng)在稀釋前回溫至37℃。

取出的疫苗應(yīng)立即放入預(yù)先調(diào)好的37℃水浴鍋中溶解，整個過程控制在5s左右。手指捏住安瓿瓶小頭端，按一個方向做緩速圓周劃動，使疫苗受熱均勻溶解，并在45s內(nèi)溶解完疫苗。使用5mL注射器吸取3mL稀釋液，再緩慢吸出疫苗并注入稀釋液中。反復(fù)3次吸取稀釋液洗滌瓶身，以減少疫苗損失。從取出疫苗到稀釋完成，整個過程應(yīng)控制在2min以內(nèi)，時間過長則會降低疫苗效價。

2.2 免疫操作

免疫過程的時間長短決定了免疫的效果。有研究表明，室溫存放時間對馬立克氏?。?14）疫苗的蝕斑單位及病毒存活率有影響，存放時間越長，容易造成免疫失敗。馬立克氏?。?14）液氮疫苗生產(chǎn)廠家對2000羽份規(guī)格疫苗不同存放時間下的蝕斑單位計數(shù)及病毒存活率進行比較試驗。結(jié)果表明，室溫存放超過45min即對疫苗蝕斑單位及病毒存活率造成很大影響（見表1）。

表1 室溫存放MD疫苗的蝕斑單位計數(shù)及病毒存活率

因此，針對2000羽份規(guī)格的疫苗免疫時間應(yīng)控制在45min內(nèi)，1000羽份規(guī)格的疫苗免疫時間應(yīng)控制在30min以內(nèi)。在免疫過程中，細胞的沉降特性會使細胞逐漸向疫苗瓶的底部沉降，為保證免疫的均一性，需要在免疫過程中每隔10min輕輕搖晃疫苗瓶，以維持細胞的均勻懸浮。同時，免疫部位位于雛雞的頸背部皮下，漏打錯打均會引起免疫失敗甚至雛雞的死亡，需要定期對操作人員進行培訓(xùn)。

3 抗生素添加

現(xiàn)場臨床經(jīng)驗表明，疫苗免疫操作問題，會使疫苗部分或全部失效，這是當(dāng)下免疫失敗的重要原因。此外，多數(shù)養(yǎng)殖場在疫苗中添加抗生素的例子已不罕見。但有些抗生素能夠改變稀釋液的滲透壓和pH值，加快疫苗的滅活。根據(jù)武漢科前生物有限公司實驗室檢測結(jié)果分析，受試抗生素絕大多數(shù)能夠?qū)︸R立克氏?。?14）疫苗產(chǎn)生影響，且不同廠家生產(chǎn)的同種抗生素影響效果不同（見表2）。

表2 不同抗生素對馬立克氏?。?14）疫苗效價的影響

本廠曾送檢丁胺卡那霉素至實驗室，以檢測其對疫苗的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稀釋液在加入該抗生素后明顯變黃（見圖1），pH值與滲透壓明顯變化，蝕斑單位影響較大（見表3）。

表3 丁胺卡那霉素對馬立克氏病活疫苗（814株）的影響

圖1 丁胺卡那霉素加入至稀釋液后表觀變化

因此，為確保免疫效果，在添加抗生素前，應(yīng)送至相關(guān)機構(gòu)進行檢測，選擇影響效果較小的抗生素使用。

4 遺傳背景

家禽的抗性以及抗病特征早在上世紀30年代就被育種科學(xué)家認知，但對于抗病力的研究遠落后于經(jīng)濟性狀的研究。對雞抗MD的研究，主要集中在主要組織相容性復(fù)合體（MHC）上。MHC是存在于脊椎動物的染色體上，編碼主要組織相容性抗原、控制細胞間的相互識別以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的一組緊密連鎖基因群。研究證實，MHC分子在動物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，其不同單倍型與動物疾病的抵抗力和生產(chǎn)性能有著密切的聯(lián)系。Hansen通過血型B19和B21組合雜交，感染MD后發(fā)現(xiàn)B21為優(yōu)勢基因。Briles等也通過試驗證明B21單倍型的抗病力最強。Bacon指出：在抗馬立克氏病中，抗性最強的是B21單倍型，中等抗力的的是B2、B6單倍型。易感的是B5、B13及B19單倍型。有研究通過選取24個雞種進行目標(biāo)捕獲測序，發(fā)現(xiàn)了其與MD的抗性關(guān)系（見表4）。

表4 不同雞種的MHC單倍型及與MD抗性關(guān)系

上表顯示了不同雞種對MD的不同抗性，提示易感及中等抗性雞種相對強抗性雞種更易感MD。同時，大部分地方雞種含有B21單倍型，相對于商業(yè)雞種來說顯示出較強抗性及疾病死亡率，臨床實際也表明商業(yè)雞種，例如海蘭蛋雞更易感MD，或與遺傳背景有關(guān)。

5 其他因素

在臨床MD免疫失敗經(jīng)驗中，除了上述因素外，還有其它因素也在影響著馬立克氏病活疫苗（814株））的免疫效果。筆者通過追溯免疫失敗案例，進行實驗室檢測分析病死原因，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)病死雞除患有MD外，還并發(fā)有禽白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增值病及肝炎-脾臟腫大綜合癥等免疫抑制疾病。因此，養(yǎng)殖場需要密切關(guān)注免疫抑制疾病的發(fā)生，避免此類疾病降低機體免疫能力，給MDV的感染提供機會。

對飼養(yǎng)期較短的商品肉雞，由于不易觀察到MD典型癥狀，致使部分肉雞養(yǎng)殖者忽視MD疫苗的重要性，這是造成目前MD疫苗在我國商品肉雞中流行較為嚴重的原因之一。調(diào)查顯示，我國商品肉雞MD死亡率高達5%，因早期感染MD表現(xiàn)嚴重免疫抑制或“早期急性死亡綜合癥”的所占比例是20%～25%。這些情況不僅致使雞群生長緩慢，易患其他疾病，甚至能夠衰弱其他疫苗的免疫效果。而隨著帶毒雞不斷排出羽屑上皮組織，存在于羽毛上皮碎屑中的MDV也隨之增加，從而造成環(huán)境中MDV毒量的累積，甚至出現(xiàn)了超超強毒株（vv+MDV）。目前，超超強毒株能夠突破免疫保護，引起免疫過MD的雞群發(fā)生該病，形成免疫失敗。因此，注重馬立克氏病的防制措施及嚴格的生物安全制度是降低免疫失敗的關(guān)鍵。

6 結(jié)束語

由于MD（814株）疫苗的使用，使我國暴發(fā)該病的病例在過去10年間已經(jīng)明顯減少。但疫苗并不能完全防止MD的發(fā)生，多種原因均可以引起免疫失敗。本文揭示臨床免疫MD失敗的部分原因，包括疫苗保存運輸不當(dāng)、免疫操作不當(dāng)、抗生素影響效果、雞種遺傳背景、免疫抑制病共生及超超強毒株出現(xiàn)。此外，還有疫苗質(zhì)量、母源抗體影響、免疫空白期等其他因素也可以引起免疫失敗。隨著養(yǎng)雞業(yè)集約化程度不斷提高，只有我們重視該病，積極預(yù)防，做好防控的每一環(huán)節(jié)，才能降低免疫失敗比率，營造健康的養(yǎng)殖環(huán)境。