胡義陽 楊忠明（泉州市第一醫(yī)院，泉州362000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病，其特征在于自身抗體的產(chǎn)生、全身性炎癥以及對血管和器官的損害［1-2］。SLE是由遺傳和環(huán)境因素引起的多因素疾病。許多SLE易感基因負(fù)責(zé)維持免疫耐受性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，如抗原加工和呈遞、細(xì)胞凋亡、白細(xì)胞表面受體以及細(xì)胞信號傳導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄的分子［3-4］。近年來，氧化應(yīng)激因其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)理中的潛在作用而引起了廣泛關(guān)注。狼瘡性腎炎是SLE患者腎功能衰竭的主要原因，其氧化狀態(tài)受損，與狼瘡性腎炎的進(jìn)展有關(guān)。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡狀態(tài)，可通過激活NF-κB（NFκB）并刺激隨后產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和趨化因子以促進(jìn)慢性腎病而誘發(fā)炎癥。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的抗氧化信號通路在細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的防御中發(fā)揮重要作用，并且已證明Nrf2基因的消融可引起狼瘡樣自身免疫性腎炎。Nrf2通過調(diào)控抗氧化物質(zhì)的表達(dá)，減輕活性氧和親電體引起的細(xì)胞損傷，使細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，維持機(jī)體氧化還原動(dòng)態(tài)平衡［5］。在人類和小鼠模型中有研究報(bào)道Nrf2參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制，但Nrf2在狼瘡性腎炎發(fā)展中的作用仍不清楚。積雪草酸是積雪草的三萜類衍生物，具有諸如抗氧化劑和抗炎等生物學(xué)作用，有很大的研究價(jià)值［6-7］。既往已報(bào)道積雪草酸的多種潛在治療作用，但積雪草對狼瘡性腎炎的作用了解甚少。本研究將探討積雪草酸對小鼠狼瘡性腎炎的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料積雪草酸購自上海自然標(biāo)準(zhǔn)研發(fā)與生物技術(shù)有限公司（純度98.0%、分子量488.70）。本實(shí)驗(yàn)一抗：Nrf2抗體、p47phox抗體、Histone H3抗體、β-actin抗體、CD3抗體、F4/80抗體、NF-κB抗體均購自Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）。TRIzol試劑購自Invitrogen；凝膠電泳系統(tǒng)購自北京六一儀器廠；凝膠電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購自BIO-RAD；PVDF膜購自美國Millipore；化學(xué)發(fā)光蛋白檢測顯影液購自美國Borad。BALB/c小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。MRL/lpr雌性小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。熒光顯微鏡（IX53）購自日本奧林巴斯。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組選擇20只8周野生型雌性BALB/c小鼠為正常組（Normal組），分別選擇20只易患狼瘡的MRL/lpr雌性小鼠給予生理鹽水［10 ml/（kg·d）］和積雪草酸［10 ml/（kg·d）］，作為對照組（Vehicle組）和實(shí)驗(yàn)組（Asiatic acid組），均以灌胃方式給藥。實(shí)驗(yàn)中對動(dòng)物的處置符合3R規(guī)則。所有操作遵循動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)（動(dòng)物倫理批號：2019016）。各組手術(shù)過程和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用單盲模式。將動(dòng)物維持在12 h光照/12 h黑暗交替環(huán)境中并自由獲取食物和水，在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)條件至少7 d。各組小鼠12周齡進(jìn)行灌胃，至34周采用頸椎脫臼處死法迅速處死小鼠進(jìn)行取材。

1.2.2 RT-PCR從腎臟組織提取總mRNA，分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度，按試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA。qPCR引物序列如下（Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)），GAPDH-F：5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，GAPDH-R：5'-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3'；HO-1-F：5'-AGGTACACATCCAAGCCGAGA-3'，HO-1-R：5'-CATCACCAGCTTAAAGCCTTCT-3'；NQO1-F：5'-GTGATATTCCAGAGTAAGAAGGCAG-3'，NQO1-R：5'-ATTCTCCAGGCGTTTCTTCCAT-3'。LightCycler?80 SYBR GreenⅠMaster用于上機(jī)檢測還原型輔酶Ⅰ醌氧化還原酶1［NAD（P）H quinine oxidoreductase，NQO1］和血紅素氧化酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）mRNA表達(dá)水平，使用GAPDH的mRNA表達(dá)量作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即以NQO1/GAPDH和HO-1/GAPDH表示結(jié)果。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定的腎臟組織脫水，石蠟包埋切片后，在60℃烤箱中烘烤30 min以上，經(jīng)脫蠟水合后用檸檬酸鹽高壓修復(fù)。8%羊血清封閉60 min減少非特異性染色。用CD3、F4/80、NF-κB一抗孵育過夜，二抗孵育60 min后，每個(gè)組織加DAB工作液進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染后中心樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Western blot將各組小鼠腎臟組織溶于裂解緩沖液中，采用BCA法測量蛋白濃度。組織裂解產(chǎn)物使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。孵育一抗4℃過夜。37℃孵育二抗40 min后用ECL進(jìn)行顯影。使用Image J軟件對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量，GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.2.5 HE染色標(biāo)本采集：將小鼠仰臥捆綁于小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，取腎臟組織，置于4%多聚甲醛溶液中，固定72 h后將其進(jìn)行乙醇梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，切成5μm薄片，進(jìn)行后續(xù)組織HE染色。

1.2.6 活 性 氧（reactive oxygen species，ROS）測定通過Dihydroethidium（DHE）染色檢測活性氧的產(chǎn)生。將腎臟石蠟切片與DHE（5 μmol/L）在37℃孵育1 h，用熒光顯微鏡（IX53）觀察熒光圖像，由Image-Pro plus軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示。兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎臟HE染色結(jié)果如圖1所示，對照組小鼠顯示典型的腎小球增生、新月體、腎小球硬化和間質(zhì)性炎癥，表現(xiàn)為腎小球周圍單核白細(xì)胞浸潤以及伴有蛋白管型的腎小管萎縮，而正常組小鼠無異常表現(xiàn)。在積雪草酸實(shí)驗(yàn)組小鼠中，上述腎臟損傷大幅減少，但與正常組小鼠比較仍表現(xiàn)出輕度腎小球增生和輕度間質(zhì)性炎癥。

圖1 各組小鼠腎臟HE染色（×400）Fig.1 HE staining of mice kidney in each group（×400）

2.2 各組小鼠腎臟活性氧的測量為了特異性地檢測各組腎臟中的局部活性氧產(chǎn)生情況，采用DHE染色法檢測各組小鼠腎臟中ROS表達(dá)水平。如圖2所示，DHE熒光在正常組小鼠腎臟中較低，陽性細(xì)胞率??；在對照組小鼠中顯著增加（P＜0.05），與正常小鼠相比ROS水平顯著增加。在積雪草酸處理后ROS產(chǎn)生較少（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠腎臟DHE染色（×400）Fig.2 DHE staining of kidney of mice in each group（×400）

2.3 各組小鼠腎臟組織中的氧化應(yīng)激蛋白相對表達(dá)水平比較為確定積雪草酸給藥是否影響狼瘡性腎炎的氧化應(yīng)激反應(yīng)，對腎臟中Nrf2向細(xì)胞核的移位和NAD（P）H氧化酶亞單位p47phox水平以及Nrf2下游酶進(jìn)行了檢測。如圖3所示，與正常組相比，對照組小鼠細(xì)胞核中的Nrf2蛋白水平顯著低于正常對照組（P＜0.05），然而與對照組小鼠相比，積雪草酸處理的小鼠Nrf2向細(xì)胞核的移位明顯增多（P＜0.05），其水平與正常組接近。另外與正常小鼠相比，對照組小鼠中p47phox的水平顯著增加（P＜0.05），而經(jīng)過積雪草酸治療的小鼠其p47phox的水平顯著降低（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠腎臟氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)水平Fig.3 Expression level of oxidative stress protein in kidney of mice in each group

2.4 各組小鼠腎臟組織中mRNA相對表達(dá)水平比較既往研究表明，NQO1和HO-1的表達(dá)受Nrf2調(diào)控［8］。因此本研究檢測NQO1和HO-1的mRNA在各組小鼠腎臟組織中的表達(dá)。如圖4所示，與正常組小鼠相比，對照組小鼠中NQO1和HO-1的腎mRNA水平顯著降低（P＜0.05），在積雪草酸處理后的小鼠中NQO1和HO-1的腎mRNA水平與正常組相似（P＜0.05）。

圖4 各組小鼠腎臟組織中的mRNA相對表達(dá)水平Fig.4 Relative mRNA expression levels in kidney tissues of mice in each group

2.5 各組小鼠腎臟氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá)水平免疫組化結(jié)果（圖5）顯示，與正常組相比，對照組顯示出T細(xì)胞（CD3陽性細(xì)胞）和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（F4/80陽性細(xì)胞）顯著浸潤到腎間質(zhì)的腎小球周圍區(qū)域（P＜0.05），而積雪草酸處理的小鼠CD3和F4/80的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。與正常組相比，對照組小鼠腎臟中的NF-κB p65活性顯著增加（P＜0.05），且這種作用在積雪草酸處理的小鼠中被顯著抑制（P＜0.05）。

圖5 各組小鼠腎臟組織免疫組化染色結(jié)果Fig.5 Immunohistochemical staining results of kidney tissues of mice in each group

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)積雪草酸可抑制MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的發(fā)生發(fā)展。積雪草酸通過減少腎小球增殖、新月體、腎小球硬化和腎小球周圍單核白細(xì)胞浸潤，抑制MRL/lpr小鼠狼瘡腎炎的發(fā)展。進(jìn)一步機(jī)理研究表明，積雪草酸改善MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎是通過增強(qiáng)Nrf2抗氧化信號通路、抑制NF-κB炎癥信號通路以及抑制腎內(nèi)T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的浸潤實(shí)現(xiàn)的。

狼瘡性腎炎患者的氧化狀態(tài)受損且炎癥活動(dòng)明顯增加［9］。既往研究發(fā)現(xiàn)狼瘡腎炎的發(fā)展和加速都與受損的抗氧化防御系統(tǒng)有關(guān)［10-11］。積雪草酸是一種從積雪草中提取的生物活性化合物，具有多種諸如抗氧化和抗炎等藥理作用［7，12-13］。據(jù)報(bào)道，在創(chuàng)傷性腦損傷或急性肺損傷的小鼠模型中，Nrf2的破壞導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6的產(chǎn)生增加，并且Nrf2通過中和活性氧并負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB和TGFβ1信號通路來改善狼瘡性腎炎［14-16］。最近的一項(xiàng)研究表明，通過增加Nrf2水平和肝臟抗氧化酶活性，積雪草酸顯著改善了肝功能損傷［12］。阻斷氧化應(yīng)激可通過降低IL-1β和TNF-α的表達(dá)來改善腎臟炎癥［17-18］。本研究證明積雪草酸顯著抑制MRL/lpr小鼠活性氧生成，激活其Nrf2信號通路，抑制p47phox和NF-κB的表達(dá)，促進(jìn)血紅素氧合酶-1和NAD（P）H氧化酶下游的NQO1表達(dá)增加。另外，T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向腎臟的浸潤在腎小球腎炎中也起著重要作用［19-20］。免疫組化染色結(jié)果證實(shí)積雪草酸給藥可抑制MRL/lpr小鼠腎內(nèi)T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的浸潤。

綜上所述，本研究證明了積雪草酸通過Nrf2/NF-κB信號通路對系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎臟的氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用，具有治療狼瘡性腎炎的應(yīng)用前景。