何麗杰 陳會(huì)佳 王靜 常丹丹 呂丹丹 李海娜（天津市第五中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津300450）

宮頸癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)癌癥，是嚴(yán)重威脅婦女生命的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，女性患者死亡率較高［1］。微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性單鏈小RNA，可通過(guò)翻譯后修飾在人類(lèi)腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究報(bào)道，miRNA與宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等密切相關(guān)，是宮頸癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的新靶點(diǎn)［2-3］。miRNA-200是一類(lèi)抑制腫瘤的miRNA家族，包括miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c等，促進(jìn)miR-200家族表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移［4］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200b在上皮性卵巢癌中異常表達(dá)，且血漿miRNA-200b水平可作為早期診斷上皮性卵巢癌的分子標(biāo)志物［5］。RhoA是具有GTP酶活性的小分子G蛋白，參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，RhoA在胃癌組織及肺腺癌組織中均存在過(guò)度表達(dá)，參與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、侵襲［6-7］。Bax為Bcl-2家族成員，具有促凋亡作用，過(guò)表達(dá)Bax可促進(jìn)多種細(xì)胞自發(fā)凋亡，還可增加由多種因素引起的細(xì)胞凋亡［8］。CyclinD1在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［9］。目前關(guān)于miRNA-200b及RhoA蛋白對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響鮮有報(bào)道。因此，本研究驗(yàn)證miRNA-200b與RhoA蛋白在宮頸癌細(xì)胞中的靶向關(guān)系，并探討其在宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡中的作用，為宮頸癌治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液、CCK8試劑盒均購(gòu)自碧云天生物有限公司；兔抗人RhoA單克隆抗體（克隆號(hào)：EPR18134）、兔抗人CyclinD1單克隆抗體（克隆號(hào)：EPR2241）、兔抗人Bax單克隆抗體（克隆號(hào)：EPR18283）、兔抗人VEGF單克隆抗體（克隆號(hào)：Y103）、小鼠抗人TGF-β1單克隆抗體（克隆號(hào)：TB21）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（二抗）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)SHELDON公司；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；搖床（TS-8）購(gòu)自上海精密儀器制造公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），37℃、5%CO2培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)處理方法不同將HeLa細(xì)胞分為5組：空白對(duì)照組、mimic-NC組、miRNA-200b mimic組、RhoA-NC組和RhoA過(guò)表達(dá)組，HeLa細(xì)胞以1×106個(gè)/ml接種于6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。取2管，第1管加45μl DMEM分別與5 μl miRNA-200b模擬物、過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照、RhoA空白對(duì)照質(zhì)粒、RhoA過(guò)表達(dá)質(zhì)?；靹颍坏?管加45μl DMEM和5μl Lipofectamine2000混勻，放置5 min，融合20 min，加至6孔板，建立miRNA-200b mimic組、mimic-NC組、RhoA-NC組和RhoA過(guò)表達(dá)組，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照組。分別于轉(zhuǎn)染后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miRNA-200b表達(dá)Trizol法提取各組HeLa細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，miRNA-200b以U6為內(nèi) 參，采 用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞miRNA-200b表達(dá)。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，miRNA-200b F：5'-GGGGTAATACTGCCTGGT-3'，R：5'-TGCGTGTCGTGGCGTC-3'；U6 F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。各樣本重復(fù)檢測(cè)3次，2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-200b相對(duì)表達(dá)。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)采用生物信息學(xué)軟件TargetScan等數(shù)據(jù)庫(kù)分析miRNA-200b的靶基因，結(jié)果顯示，RhoA基因3′端存在miRNA-200b的結(jié)合位點(diǎn)，提示RhoA是miRNA-200b的直接靶基因。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證該結(jié)果，分別擴(kuò)增出含miRNA-200b結(jié)合位點(diǎn)的RhoA 3′UTR及miRNA-200b結(jié)合位點(diǎn)突變的RhoA 3′UTR系列，將其插入熒光素酶報(bào)告基因載體上，構(gòu)建野生型RhoA-Wt和突變型RhoA-Mut重組質(zhì)粒。將HeLa細(xì)胞接種于96孔板，37℃培養(yǎng)24 h，分別將RhoA-Wt重組質(zhì)粒、RhoA-Mut重組質(zhì)粒與miRNA-200b mimic（5'-UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3'）或mimic-NC（5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′）共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)48 h，收集并裂解細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因分析。

1.2.4 Western blot和RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞RhoA蛋白及mRNA表達(dá)分別收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液于冰上提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，沸水浴加熱變性，取等量變性蛋白樣品加入上樣孔，行SDS-PAGE凝膠電泳。待蛋白分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜，加入RhoA一抗（1∶1 500），4℃雜交過(guò)夜，TBST洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶3 000），室溫雜交1 h，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光，暗室成像拍照，以β-actin為內(nèi)標(biāo)蛋白，Image J軟件計(jì)算各組細(xì)胞RhoA蛋白表達(dá)，RhoA mRNA檢測(cè)方法參照1.2.2。引物設(shè)計(jì)：RhoA F：5'-TGATTGTTGGTGATGGAGCCT-3'；R：5'-ACTCTACCTGCTTTCCATCCAC-3'；β-actin F：5'-GATTGGAATCTGGCTACT-3'，R：5'-TAGGGCTGAAGCACAGGG-3'。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡取轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，PBS離心洗滌3次。將細(xì)胞重懸于預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，加入1.25μl Annexin V-FITC輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，用0.5 ml預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液重懸，加入10μl Ptopidium Iodide，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.6 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖分別收集各組細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種至96孔板，37℃常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h，各孔細(xì)胞中加入混有10% CCK8檢測(cè)試劑的培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處各孔光密度（OD）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot和RT-PCR檢測(cè)Bax、CyclinD1和VEGF、TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)檢測(cè)方法參照1.2.2和1.2.4。Bax F：5'-GTGGAGGAGCTCTT

CAGGGA-3'，R：5'-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3'；CyclinD1 F：5'-GCCGAATTCATGGAACACCAGCT-3'，R：5'-TGCACCTGTAGACTGAGCTCGC-3'；VEGF F：5'-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3'；R：5'-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3'；TGF-β1 F：5'-CTACTACGCCAAAGAAGTCACC-3'，R：5'-GAAATCGGCCCTGTACCGTCTCT-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，結(jié)果以±s表示，多樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miRNA-200b后HeLa細(xì)胞miRNA-200b表達(dá)比較與空白對(duì)照組和mimic-NC組相比，miRNA-200b mimic組miRNA-200b表達(dá)顯著升高（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組與mimic-NC組miRNA-200b mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 各組miRNA-200b表達(dá)Fig.1 miRNA-200b expressions in each group

2.2 miRNA-200b對(duì)RhoA的靶向調(diào)控作用驗(yàn)證雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miRNA-200b與RhoA基因3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，miRNA-200b和RhoA可靶向結(jié)合。熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型RhoA基因表達(dá)載體WT-3′UTR后再轉(zhuǎn)染miRNA-200b mimic細(xì)胞的熒光素酶活性與再轉(zhuǎn)染mimic-NC組顯著降低；而轉(zhuǎn)染突變性RhoA基因 表達(dá)載 體Mutant-3′UTR后，再轉(zhuǎn) 染miRNA-200b mimic的HeLa細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯抑制作用（圖2）。

圖2 miRNA-200b結(jié)合位點(diǎn)的保守性分析及熒光素酶活性分析Fig.2 Conservative analysis of miRNA-200b binding sites and activity analysis of luciferase

2.3 各組細(xì)胞RhoA蛋白和mRNA表達(dá)比較與空白對(duì)照組和mimic-NC組相比，miRNA-200b mimic組RhoA蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低，與RhoA-NC組相比，過(guò)表達(dá)RhoA，RhoA蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。空白對(duì)照組與mimic-NC組、RhoA過(guò)表達(dá)組RhoA蛋白及mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 各組RhoA蛋白和mRNA表達(dá)Fig.3 RhoA protein and mRNA expressions in each group

2.4 各組細(xì)胞增殖和凋亡水平與空白對(duì)照組和mimic-NC組相比，miRNA-200b mimic組細(xì)胞凋亡比例顯著升高，細(xì)胞增殖受到抑制，RhoA過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡比例降低，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)（P＞0.05）；空白對(duì)照組、mimic-NC組、RhoA-NC組細(xì)胞凋亡、增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4、5）。

圖4 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后增殖能力Fig.4 Cell proliferation ability after transfection in each group

圖5 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡能力Fig.5 Cell apoptotic ability in each group after transfection

2.5 各組細(xì)胞增殖相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較與空白對(duì)照組和mimic-NC組相比，miRNA-200b mimic組細(xì)胞Bax mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，而CyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與RhoA-NC組相比，RhoA過(guò)表達(dá)組Bax mRNA和蛋白表達(dá)下降，而CyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，圖6）。

圖6 各組CyclinD1和Bax mRNA、蛋白表達(dá)Fig.6 CyclinD1 and Bax mRNA and protein expressions in each group

2.6 各組細(xì)胞VEGF、TGF-β1表達(dá)比較與空白對(duì)照組和mimic-NC組相比，miRNA-200b mimic組細(xì)胞VEGF、TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與RhoA-NC組相比，RhoA過(guò) 表 達(dá) 組VEGF、TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖7）。

圖7 各組VEGF和TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)Fig.7 VEGF and TGF-β1 mRNA and protein expressions in each group

3 討論

宮頸癌是一種常見(jiàn)婦科惡性腫瘤，是全世界女性，特別是發(fā)展中國(guó)家女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，因此，深入了解參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，探討其分子機(jī)制具有重要意義。研究表明，miRNA在轉(zhuǎn)錄后通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因穩(wěn)定性或翻譯效率調(diào)節(jié)基因表達(dá)，起致癌或抑癌作用［10］。miRNA-200b家族可在多種人類(lèi)癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用［11］。miRNA-200b異常表達(dá)在乳腺癌、結(jié)直腸癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和轉(zhuǎn)移中起重要作用［12-13］。RhoA在人類(lèi)多種癌癥中異常表達(dá)，并參與腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移［14-15］。MA等［16］研究發(fā)現(xiàn)，RhoA是miR-200b下游靶基因，miR-200b通過(guò)直接靶向RhoA調(diào)節(jié)血腫瘤屏障滲透性。本研究選擇人宮頸癌細(xì)胞HeLa，采用生物信息學(xué)驗(yàn)證miRNA-200b與RhoA的靶向關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-200b與RhoA基因3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；在轉(zhuǎn)染miRNA-200b模擬物后，RhoA表達(dá)水平顯著降低。上述結(jié)果均提示RhoA是miRNA-200b的下游靶基因，可能參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展。

miRNAs可通過(guò)靶向作用mRNA的3′UTR抑制其轉(zhuǎn)錄翻譯，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種功能［17］。彭彪等［18］研究報(bào)道，miRNA-200b可通過(guò)靶向調(diào)控PROM1表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。LIU等［19］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-144通過(guò)雙重靶向RhoA和ROCK1在體外顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程復(fù)雜，通常是由于抑癌基因失活和癌基因激活導(dǎo)致細(xì)胞周期和生存相關(guān)分子改變。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合因子，是促進(jìn)腫瘤血管生成的關(guān)鍵刺激因子［20］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是一種具有雙向調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子，在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸及免疫抑制過(guò)程中發(fā)揮重要負(fù)性調(diào)節(jié)作用［21-22］。研究表明，惡性腫瘤患者中血清VEGF水平升高，細(xì)胞免疫功能異常減弱；VEGF水平越高，惡性腫瘤患者病情越嚴(yán)重，轉(zhuǎn)移和侵襲風(fēng)險(xiǎn)越高［23］。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、Foxp3蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)增高，可能在促使宮頸癌細(xì)胞免疫逃逸、促進(jìn)宮頸癌形成及轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用［24-25］。miRNAs被認(rèn)為是基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要分子，在不同來(lái)源的腫瘤中有差異表達(dá)，不僅具有抑癌和致癌潛能，且具有免疫調(diào)節(jié)功能［26］。研究報(bào)道，miRNA可參與癌細(xì)胞免疫逃逸，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免于凋亡而無(wú)限增殖［27］。羅衛(wèi)民等［28］發(fā)現(xiàn)，miR-200b可能通過(guò)靶向VEGF抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲。LADAK等［29］研究表明，miR-200b可調(diào)控TGF-β1表達(dá)保護(hù)氣道上皮細(xì)胞免受EMT影響。因此，從miRNA參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸角度研究腫瘤增殖、遷移的分子機(jī)制，可為腫瘤轉(zhuǎn)移治療提供理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-200b模擬物后，HeLa細(xì)胞VEGF、TGF-β1基因表達(dá)及細(xì)胞增殖能力顯著降低，凋亡水平升高；過(guò)表達(dá)RhoA基因表達(dá)后，VEGF、TGF-β1基因表達(dá)及細(xì)胞增殖能力明顯升高，凋亡水平下降。提示miRNA-200b通過(guò)靶向RhoA抑制HeLa細(xì)胞增殖能力并促進(jìn)其凋亡，可能通過(guò)抑制宮頸癌細(xì)胞免疫逃逸抑制宮頸癌發(fā)展。

綜上所述，miRNA-200b可通過(guò)靶向調(diào)控RhoA抑制HeLa細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制可能為miRNA-200b抑制宮頸癌細(xì)胞免疫逃逸。因此，從腫瘤免疫逃逸角度為miRNA-200b治療宮頸癌提供了重要依據(jù)，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。