張小宇 靳衛(wèi)平 王文輝 吳 杰 盧 佳 孟勝利 王澤鋆 申 碩

（武漢生物制品研究所有限責任公司病毒性疫苗研究一室，國家聯(lián)合疫苗工程技術研究中心，武漢430207）

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是由人腸道病毒（human enterovirus，HEV）引起的嬰幼兒感染為主的流行性傳染病，在我國丙類傳染病中發(fā)病率位居第一，主要癥狀包括患兒手、足、口腔等處皮膚皰疹、潰瘍，并伴有發(fā)熱、乏力和精神萎靡等全身癥狀，少數(shù)患者可出現(xiàn)嚴重中樞神經系統(tǒng)癥狀，嚴重危害嬰幼兒健康和生命安全［1］。武漢生物制品研究所于2016～2017年在湖北省襄陽市進行的HFMD病原學研究表明，3 216例HFMD患兒臨床樣本中柯薩奇病毒A組5型（Coxsackievirus A5，CV-A5）感染呈高比例，且與CV-A2、CV-A6、CVA10、CV-A16和腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV-71）共同流行，是HFMD的主要病原體之一［2-5］。CVA5屬小RNA病毒科腸道病毒屬，呈20面體球形對稱，為單股正鏈RNA，長度為7 400～7500 nt，編碼多聚蛋白。基因組5?末端至3?末端依次排列5?UTR，編碼區(qū)為P1、P2、P3、3?UTR及多聚腺苷酸尾。P1編碼主要結構蛋白，終產物為VP1～VP4。VP1～VP3暴露于病毒粒子表面，VP4存在于病毒內部［6］。CV-A5與諾如病毒（norovirus，NoV）GⅡ.4共同感染可能誘發(fā)間歇性楓糖尿癥（MSUD）6歲患兒首次嚴重急性腦??；CV-A5與乙型流感病毒共同感染可能引發(fā)瑞氏綜合征，對肝臟和大腦產生巨大損傷，如不及時治療將迅速導致肝腎衰竭、腦損傷，甚至死亡；CVA5原型株與EV-71重組可能導致HFMD暴發(fā)，并伴有嚴重神經系統(tǒng)癥狀［7-9］。研發(fā)包含CV-A5的HFMD多價疫苗，對預防和控制CV-A5及其他腸道病毒暴發(fā)及引發(fā)的重癥具有重要意義?？乖瓩z測是疫苗工藝穩(wěn)定、質量可控的重要保證，是質控方法不可缺少的環(huán)節(jié)。本研究通過制備高效價CV-A5兔多克隆抗體及單克隆抗體，建立ELISA抗原檢測方法，對其準確度、精密度、特異性、耐用性及穩(wěn)定性進行方法學驗證，并應用于非洲綠猴腎（Vero）細胞基質十層細胞工廠純化病毒液過程中樣品的抗原檢測。

1 材料與方法

1.1 材料CV-A5、狂犬病毒疫苗（rabies virus vaccine，RV）、輪狀病毒疫苗（rotavirus vaccine，Rota）、NoV、CV-A2、CV-A4、CV-A6、?？刹《?1型（echovirus 11，Echo11）、CV-A16、EV-71、SP2∕0骨髓瘤細胞、Vero細胞由武漢生物制品研究所有限公司保存；SPF級雌性BALB∕c小鼠、雄性日本大耳白兔由武漢生物制品研究所有限責任公司實驗動物室提供；HAT鹽、HT鹽、PEG∕DMSO（Mw，1450）、羊抗小鼠HRP-IgG和 羊抗兔HRP-IgG購自武漢博士德公司；抗體亞類鑒定試劑盒購自洛陽賽爾維實驗器材有限公司；氯化銫（CsCl）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；Pierce BCA定量分析試劑盒購自美國Thermo公司；ELISA相關試劑為本實驗室配制。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備及鑒定 取CV-A5（7.68 lgC CID50∕ml）按照0.001 MOI接種十層細胞工廠培養(yǎng)，37℃培 養(yǎng)48～72 h，細 胞 病 變（cytopathic effect，CPE）達90%時收獲病毒液，濃縮，20%（W∕V）蔗糖墊底，蔗糖密度梯度離心、CsCl密度梯度離心等得到CV-A5純化抗原，12% SDS-PAGE和透射電鏡鑒定蛋白純度和顆粒完整性，BCA法測定蛋白濃度，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多克隆抗體和單克隆抗體制備、純化及鑒定

1.2.2.1 多克隆抗體制備 將純化的CV-A5抗原與等體積弗氏佐劑混合（初次免疫和第1次加強免疫佐劑為弗氏完全佐劑，后續(xù)加強免疫佐劑為弗氏不完全佐劑）［10］，背部皮下多點注射免疫日本大耳白兔，200 μg∕劑，免疫間隔為0、3、14、28、42 d各免疫1次，末次免疫10 d后，頸動脈采血，分離血清，即兔抗CV-A5多克隆抗體。

1.2.2.2 單克隆抗體制備 將純化的CV-A5抗原與等體積弗氏佐劑混合（首次免疫佐劑為弗氏完全佐劑，后續(xù)加強免疫佐劑為弗氏不完全佐劑），背部皮下及腹腔注射免疫雌性BALB∕c小鼠，60 μg∕劑，分別于0、14、28、42 d各免疫1次，第52天眼眶采血，分離血清，間接ELISA和中和試驗檢測血清效價。選擇ELISA效價和中和抗體效價較高的小鼠進行沖擊免疫，3 d后按照常規(guī)細胞融合技術將小鼠脾細胞與SP2∕0骨髓瘤細胞進行融合。采用間接ELISA法和中和試驗方法篩選雜交瘤細胞，篩選出的陽性雜交瘤細胞經3次克隆后進行擴大培養(yǎng)，制備腹水。

1.2.2.3 抗體純化及鑒定 采用三步飽和硫酸銨法純化CV-A5兔多克隆抗體和CV-A5單抗腹水，間接ELISA法測定抗體效價［11］，SDS-PAGE法分析抗體純度。

1.2.3 CV-A5內參制備 取1.2.1制備的CV-A5抗原，采用蛋白保護劑稀釋至10 μg∕ml，分裝保存作為內參。

1.2.4 CV-A5抗原檢測法建立 包被CV-A5兔多克隆抗體從800 ng∕孔開始進行2倍系列陪比稀釋，檢測抗體2C2-HRP按照1：200進行2倍系列倍比稀釋，方陣滴定法確定包被抗體和酶標抗體最佳工作濃度，建立CV-A5抗原檢測方法。

1.2.4.1 包被抗體和檢測抗體選擇 為保證雙抗體夾心ELISA體系最大程度捕獲待測CV-A5抗原，選擇高效價CV-A5兔抗血清純化后的多抗作為包被抗體。為保證雙抗體夾心ELISA體系的特異性，選擇特異性強的單克隆抗體2C2作為檢測抗體，采用過碘酸鈉氧化法對2C2進行標記，偶聯(lián)辣根過氧化物酶分子制備2C2-HRP。

1.2.4.2 CV-A5抗原檢測方法建立 通過對ELISA檢測條件的優(yōu)化，建立CV-A5抗原檢測方法。將純化的CV-A5兔多抗用0.05 mol∕L碳酸鹽緩沖液（pH=9.6）稀釋至1 μg∕ml，包被微孔板，100 μl∕孔，4℃包被過夜。PBST洗板3次，加入封閉液（PBST配制的1% BSA），200 μl∕孔，37℃封閉1 h，棄封閉液37℃干燥2 h制備包被微孔板。加入稀釋的待測樣品，100 μl∕孔，37℃孵育1 h；洗板5次，加入2C2-HRP（1：1 000），100 μl∕孔，37℃孵育1 h；TMB顯色30 min，2 mol∕L H2SO4終止反應，讀取A450∕A630值，繪制CV-A5抗原含量與A450∕A630均值的標準曲線，得到標準品的線性公式，代入A450∕A630均值，計算CV-A5抗原含量。

1.2.5 CV-A5抗原檢測方法驗證 按照《中國藥典》四部（2015版）通則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則要求進行方法學驗證［12］。

1.2.5.1 線性范圍及靈敏度 采用含1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBST將CVA5內參依次稀釋至1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.6 ng∕ml，按照1.2.4進行檢測，確定線性范圍，重復檢測5次。

1.2.5.2 特異性 采用建立的方法分別檢測CVA5收獲液、CV-A5空心顆粒（empty particles，EP）、CV-A5實心顆粒（full particles，F(xiàn)P）、RV、Rota、NoV、CV-A2、CV-A4、CV-A6、Echo11、CV-A16、EV-71、BSA、Vero細胞裂解液，各待檢抗原的蛋白濃度均調整為10 μg∕ml。

1.2.5.3 準確度 將CV-A5內參稀釋至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3個濃度，采用CV-A5抗原檢測法分別對3個濃度樣品進行檢測，各樣品平行檢測5孔，試驗重復測定2次，計算回收率。

1.2.6 精密度檢測

1.2.6.1 重復性 將CV-A5內參稀釋至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3個濃度，同一試驗人員不同時間采用CV-A5抗原檢測法分別對3個濃度樣品進行3次檢測，計算同一濃度樣品測定結果的CV。

1.2.6.2 中間精密度 將CV-A5內參稀釋至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3個濃度，不同試驗人員采用CV-A5抗原檢測法分別對3個濃度樣品進行檢測，計算同一濃度樣品測定結果的CV。

1.2.7 耐用性檢測 ①孵育時間變化檢測每步孵育時間偏差對最終檢測結果的影響，即每組操作加入待檢抗原、酶結合物、底物A和B的孵育時間分別為55 min～55 min～25 min；60 min～60 min～30 min；65 min～65 min～35 min。②孵育溫度變化檢測孵育溫度偏差對最終檢測結果的影響，即每組操作中采用的孵育溫度分別為35℃、37℃、39℃。③加樣體積變化檢測每步加樣體積偏差對最終檢測結果的影響，即每組操作中采用的加樣體積分別為95 μl、100 μl、105 μl。

1.2.8 穩(wěn)定性檢測 將包被的酶標板置于37℃孵育3 d，將CV-A5內參稀釋至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3個濃度，37℃孵育3 d和4℃放置的CV-A5抗原檢測試劑分別對3個濃度樣品進行檢測，比較37℃孵育3 d和4℃放置試劑的檢測結果差異。

1.2.9 建立檢測方法的初步應用 用建立的方法檢測CV-A5細胞工廠純化過程樣品1～7［CV-A5 Vero細胞病毒收獲液、濃縮液、濃縮后廢液、20%（W∕V）蔗糖墊底上清樣品及重懸樣品、CsCl密度梯度離心后樣品］的抗原含量。

2 結果

2.1 CV-A5全病毒顆?？乖b定12% SDSPAGE結果顯示，純化的CV-A5抗原在相應位置出現(xiàn)VP1、VP2和VP3目的蛋白條帶，其他位置未出現(xiàn)明顯條帶（圖1A）。電鏡分析結果顯示，純化的CVA5全病毒顆粒直徑為27～30 nm，形態(tài)完整，大小均一（圖1B）。

圖1 病毒顆粒純化鑒定Fig.1 Purification identification of virus particle

2.2 單克隆抗體篩選鑒定 間接ELISA法共篩選出9株CV-A5單克隆抗體，9株單抗同時進行中和實驗，結果顯示，均無法中和CV-A5病毒，表明這9株單抗均無中和活性。其中，1A11和1H4可識別其他型別腸道病毒，為群特異性廣譜單抗。其他與CV-A5特異性結合的單抗中，2C2僅與CV-A5反應，且ELISA效價最高，經抗體亞類鑒定其亞型為IgG2b（圖2）。

圖2 單克隆抗體特異性分析Fig.2 Specific identification of monoclonal antibody

2.3 CV-A5多克隆抗體和單克隆抗體純化鑒定ELISA結果顯示，抗CV-A5兔多抗及抗CV-A5單抗2C2腹水的效價分別為107和106。SDS-PAGE顯示，純化的CV-A5兔多抗及CV-A5單抗2C2腹水在相對分子質量50 kD～25 kD分別可見與預期重鏈、輕鏈相對分子質量一致的條帶，其他位置未見明顯條帶（圖3）。

圖3 抗體純化鑒定Fig.3 Purification identification of antibody

2.4 CV-A5抗原檢測方法驗證

2.4.1 標準曲線范圍及靈敏度 重復檢測3次的標準曲線方程分別為：y=514.48x-68.45，y=509.45x-64.57，y=502.11x-64.78，r2分 別 為0.98、0.98、0.97。檢測范圍為15.6～1 000.0 ng∕ml，檢測范圍內抗原含量與相應A值呈顯著相關，r2＞0.97。

2.4.2 特異性 采用所建立的方法檢測抗原，結果顯示，抗原僅識別CV-A5收獲液、EP、FP，而不識別其他型別腸道病毒、Rota、NoV、RV，說明所建立的抗原檢測方法特異性良好（圖4）。

圖4 特異性驗證結果Fig.4 Specific verification results

2.4.3 準確度CV-A5內參高、中、低3個濃度樣品回收率分別為99.4%～128.7%，93.2%～103.1%，88.5%～95.0%，表明該方法準確度良好（表1）。

表1 準確度驗證結果Tab.1 Accuracy verification results

2.4.4 定量檢測方法精密度分析

2.4.4.1 重復性CV-A5內參高、中、低3個濃度樣品CV分別為1.3%、3.2%、1.2%，表明該方法重復性良好（表2）。

表2 重復性驗證結果Tab.2 Repeatability verification results

2.4.4.2 中間精密度CV-A5內參高、中、低3個濃度樣品測定結果的CV分別為2.1%、2.2%和3.5%，表明該方法中間精密度良好（表3）。

表3 中間精密度驗證結果Tab.3 Intermediate precision verification results

2.4.5 耐用性 理想操作即全程孵育溫度為37℃，孵育時間60 min～60 min～30 min，加樣體積為100 μl；偏差下限即全程孵育溫度為35℃，孵育時間55 min～55 min～25 min，加樣體積為95 μl；偏差上限即全程孵育溫度為39℃，孵育時間65 min～65 min～35 min，加樣體積為105 μl。高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3個濃度不同檢測條件下，回收率為97.4%～127.6%，表明該方法耐用性良好（圖5）。

圖5 耐用性驗證結果Fig.5 Durability verification results

2.4.6 穩(wěn)定性CV-A5抗原檢測試劑37℃孵育3 d后，用于檢測500.0、250.0、125.0 ng∕ml的CVA5抗原含量，樣品回收率為101.7%～106.9%，表明CV-A5抗原檢測試劑穩(wěn)定性良好（圖6）。

圖6 穩(wěn)定性驗證結果Fig.6 Stability verification results

2.5 方法應用 采用CV-A5抗原檢測方法檢測Vero細胞基質十層細胞工廠純化過程樣品檢測，結果顯示其可用于CV-A5純化過程不同階段樣品的抗原含量監(jiān)測（圖7）。

圖7 方法應用驗證結果Fig.7 Method application verification results

3 討論

近年來，CV-A5在中國大陸地區(qū)腸道病毒病原譜中日益活躍，但國內外對CV-A5的研究較少，CVA5單克隆抗體研制及相關抗原檢測方法的建立鮮有報道。目前針對抗病毒類抗體的免疫原主要為全病毒和重組蛋白，重組蛋白作為免疫原制備的抗體存在反應性不佳、穩(wěn)定性差、不與病毒發(fā)生反應等問題。本研究采用全病毒作為免疫原，制備高效價的單克隆抗體和多克隆抗體，并建立ELISA抗原檢測方法。ELISA法檢測病毒抗原具有快速、簡單和成本低等優(yōu)點，是目前應用廣泛的方法［13］。ELISA反應體系易受外界因素影響，如加樣體積、反應溫度、反應時間、試劑穩(wěn)定性等。本研究考慮到不同試驗人員的操作誤差，在最大誤差波動范圍內進行試驗，回收率為97.4%～127.6%，并對其準確度、精密度、特異性及穩(wěn)定性進行方法學驗證，可初步應用于Vero細胞基質十層細胞工廠純化過程及各階段樣品的抗原檢測?？乖瓩z測結果提示，抗原純化過程中，不同純化步驟存在不同程度抗原損失，可針對損失抗原較多的純化方法進行改良，以減少不必要損失。

綜上所述，本研究以CV-A5多克隆抗體為捕獲抗體，以單克隆抗體2C2為檢測抗體，初步建立了快速檢測CV-A5抗原的雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法。該方法準確性、精密度、特異性、耐用性等均符合《中華人民共和國藥典》四部（2015年版）通則9101要求，可用于CV-A5抗原的定量檢測，可為包含CV-A5的HFMD多價疫苗的質量控制和工藝開發(fā)提供參考。