王西勇 丁陳波 戴 玉 夏宏林（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院（宿州市立醫(yī)院），宿州234000）

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位于所有腫瘤首位［1］。早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是肺癌高死亡率的主要原因，其原因為肺癌細(xì)胞遷移和侵襲促進(jìn)肺癌腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［2］。血管生成素樣蛋白1（angiopoietin-likeprotein1，ANGPTL1）是維持血管完整和穩(wěn)定的重要因子，在腫瘤形成、血管生成和重塑過程中扮演重要角色［3-4］。目前臨床已證明ANGPTL1在胃癌、乳腺癌等腫瘤中異常表達(dá)，且與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其在肺癌中的表達(dá)及其生物學(xué)特性尚未見報道［5-6］。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析ANGPTL1在肺癌和癌旁組織中的表達(dá)與其與預(yù)后的關(guān)系，同時構(gòu)建過表達(dá)ANGPTL1的肺癌細(xì)胞系，觀察其對腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株NCI-H292、NCI-H460、LTEP-A-2，人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購自美國菌種保藏中心ATCC；NCI-H460-ANGPTL1 mimic及陰性對照NCI-H460-NC質(zhì)粒、Drp1、PGAM5、Bax和GAPDH引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成；DMEM∕F12培養(yǎng)基（D8900）、DMEM培養(yǎng)基（D777）、1640培養(yǎng)基（R6504）、L15培養(yǎng)基（L4386）購自Sigma；SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒（QPK-201）購自Toyobo；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（RG027）購自碧云天；Trizol reagent（9009）購自TaKa-Ra；Matrigel基質(zhì)膠（356234）購自BD；MCO-15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱購自SANYO；Ti-U∕Ti-s倒置熒光顯微鏡購自Nikon；R480實時熒光定量PCR儀購自Roche。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)來源 從生物信息數(shù)據(jù)庫TCGA中的腫瘤大數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站GEPIA中查詢ANGPTL1在肺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)（癌旁組織52例，肺癌組織503例），同時分析肺癌患者中ANGPTL1高表達(dá)和低表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

1.2.2 RT-PCR檢測ANGPTL1 mRNA表達(dá) 收集人肺癌細(xì)胞株NCI-H292、NCI-H460、LTEP-A-2、正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細(xì)胞系NCI-H460-ANGPTL1 mimic和NCI-H460-NC，Trizol法 提 取 總RNA，反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行RTPCR檢測，檢測ANGPTL1 mRNA在多種人肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參，各樣本重復(fù)實驗3次。

1.2.3 MTT和EdU檢測細(xì)胞增殖 將肺癌NCIH460、NCI-H460-ANGPTL1 mimic和NCI-H460-NC細(xì)胞以500～1 000個∕孔鋪至96孔板，輕輕混勻，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，20 μl∕孔加入MTT溶液，37℃避光孵育4 h，棄孔內(nèi)液體，加入DMSO 100 μl，置于37℃搖床快速振蕩15 min，充分溶解，酶標(biāo)儀檢測492 nm處OD值。

將上述2種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞以5×103個∕孔鋪于24孔板孵育48 h，棄培養(yǎng)基，加入含有EdU的培養(yǎng)基（1：1 000稀釋），多聚甲醛固定，甘氨酸清洗，含0.5%Triton X-100的PBS清洗，阿波羅染色，依次采用0.5%Triton X-100的PBS、甲醛和PBS清洗，DAPI染色，PBS清洗，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲 實驗前12 h更換為無血清培養(yǎng)基，將40 μl matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室，消化細(xì)胞，1×PBS清洗2次，將500 μl完全培養(yǎng)基加入24孔板，計數(shù)，取5×105個細(xì)胞重懸，向Transwell小室中加入200～250 μl細(xì)胞懸液，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無氣泡。置于培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)48 h，加入甲醇配制、PBS稀釋的0.1%結(jié)晶紫染液500 μl染色，室溫避光15 min，PBS漂洗，棉棒擦拭Transwell小室內(nèi)部，倒置晾干，倒置熒光顯微鏡下拍照并計數(shù)。

1.2.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 將NCI-H460、NCI-H460-ANGPTL1 mimic和NCI-H460-NC細(xì) 胞 以5×105個∕孔均勻鋪至6孔板，用10 μl白槍頭劃線并以格尺輔助，加入PBS沖洗細(xì)胞碎片，加入含1%血清的培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照并標(biāo)記，此時記為0 h，繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞運(yùn)動情況并拍照。

1.2.6 Western blot檢測 采用細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，每組提取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳（70 V，30 min；100 V，90 min），轉(zhuǎn)至PVDF膜（200 mA，3 h），5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗孵育過夜，第2天加入HRP標(biāo)記的羊兔抗IgG，37℃孵育2 h，ECL發(fā)光液顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計數(shù)資料采用χ2檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA查詢ANGPTL1在肺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系TCGA查詢結(jié)果顯示，肺癌組織中ANGPTL1表達(dá)明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05），ANGPTL1高表達(dá)肺癌患者生存時間明顯長于ANGPTL1低表達(dá)患者（P＜0.05，圖1）。

圖1 TCGA查詢ANGPTL1在肺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系Fig.1 Expression of ANGPTL1 in lung cancer tissues and normal tissues adjacent to cancer and its relation?ship with prognosis by TCGA

2.2 ANGPTL1在細(xì)胞中的表達(dá)RT-PCR結(jié)果見圖2，ANGPTL1 mRNA在多種人肺癌細(xì)胞株中呈低表達(dá)，與人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B相比差異顯著（P＜0.05），其中NCI-H460細(xì)胞中ANGPTL1 mRNA表達(dá)最高，因此，選擇NCI-H460細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。NCIH460-ANGPTL1 mimic組細(xì)胞ANGPTL1 mRNA表達(dá)明顯高于NCI-H460和NCI-H460-NC組（P＜0.05），提示過表達(dá)ANGPTL1細(xì)胞系構(gòu)建成功。

圖2 ANGPTL1在各細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.2 Expression of ANGPTL1 in various cell lines

2.3 ANGPTL1過表達(dá)對肺癌細(xì)胞株NCI-H460增殖能力的影響MTT實驗結(jié)果顯示，第2、3、4天NCI-H460-ANGPTL1 mimic組細(xì)胞增殖率明顯低于NCI-H460和NCI-H460-NC組（P＜0.05，圖3），NCIH460-ANGPTL1 mimic組48 h EdU陽性率明 顯 低于NCI-H460和NCI-H460-NC組（P＜0.05，圖4）。

圖3 MTT檢測細(xì)胞增殖能力Fig.3 MTT assay for cell proliferation

圖4 EdU檢測細(xì)胞增殖能力（×400）Fig.4 EdU detects cell proliferation ability（×400）

2.4 ANGPTL1過表達(dá)對肺癌細(xì)胞株NCI-H460侵襲能力的影響Transwell結(jié)果顯示，NCI-H460-ANGPTL1 mimic組通過matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯少于NCI-H460和NCI-H460-NC組（P＜0.05，圖5）。

圖5 ANGPTL1過表達(dá)對肺癌細(xì)胞株NCI-H460侵襲能力的影響（×400）Fig.5 Effect of ANGPTL1 overexpression on invasive ability of lung cancer cell line NCI-H460（×400）

2.5 ANGPTL1過表達(dá)對肺癌細(xì)胞株NCI-H460遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，NCIH460-ANGPTL1 mimic組細(xì)胞遷移率明顯低于NCIH460和NCI-H460-NC組（P＜0.05，圖6）。

圖6 ANGPTL1過表達(dá)對肺癌細(xì)胞株NCI-H460遷移能力的影響Fig.6 Effect of ANGPTL1 overexpression on migration ability of lung cancer cell line NCI-H460

2.6 ANGPTL1過表達(dá)對肺癌細(xì)胞株NCI-H460中Drp1、PGAM5和Bax蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，NCI-H460-ANGPTL1 mimic組細(xì)胞中PGAM5和Bax蛋白表達(dá)明顯高于NCI-H460和NCI-H460-NC組，而Drp1表達(dá)明顯低于NCI-H460和NCI-H460-NC組（P＜0.05，圖7）。

圖7 ANGPTL1過表達(dá)對肺癌細(xì)胞株NCI-H460中Drp1、PGAM5和Bax蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of ANGPTL1 overexpression on Drp1，PGAM5 and Bax proteins expressions in lung can?cer cell line NCI-H460

3 討論

近30年內(nèi)我國肺癌發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，位居惡性腫瘤死亡率榜首，多個城市中肺癌是第一位死亡原因，備受臨床與流行病學(xué)研究者關(guān)注［7］。肺癌臨床治療多采用手術(shù)、放療與化療等傳統(tǒng)方法，隨分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，肺癌靶向治療迅速發(fā)展，但高敏感性生物靶點(diǎn)尚未明確［8］。腫瘤侵襲和遷移是多因素、多階段和多步驟過程，文獻(xiàn)報道稱肺癌細(xì)胞脫落可順著間隙侵襲蔓延至淋巴管，經(jīng)淋巴循環(huán)擴(kuò)散增殖，多個肺癌細(xì)胞發(fā)展形成微轉(zhuǎn)移病灶，從而導(dǎo)致患者病情惡化甚至死亡［9］。研究認(rèn)為，腫瘤發(fā)生發(fā)展與促癌基因和抑癌基因、DNA去甲基化密切相關(guān)［10］。ANGPTL1是血管正常生長必需因子，多中心研究認(rèn)為其在惡性腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。探索ANGPTL1在肺癌中的作用機(jī)制，有助于肺癌早期診斷與靶向治療。

ANGPTLs作為分泌性糖蛋白家族，包括氨基酸C-端纖維蛋白原類似結(jié)構(gòu)域、N-端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域及疏水性分泌信號肽，研究表明其與血管生成素結(jié)構(gòu)域相似，可與VEGF協(xié)同調(diào)控血管生成［13-14］。采用免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，ANGPTL1在直腸癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，且與腫瘤分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［15］。本研究TCGA查詢結(jié)果顯示，肺癌組織中ANGPTL1表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，ANGPTL1高表達(dá)肺癌患者生存時間明顯長于ANGPTL1低表達(dá)患者，提示ANGPTL1在肺癌中可能是抑癌基因。為進(jìn)一步觀察ANGPTL1在肺癌中的作用機(jī)制，本研究采用RTPCR證實ANGPTL1在多種人肺癌細(xì)胞株中呈低表達(dá)，與人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B相比差異顯著，提示ANGPTL1可能在肺癌中發(fā)揮抑制作用，其中NCI-H460細(xì)胞中ANGPTL1表達(dá)最低，因此選擇NCI-H460進(jìn)行后續(xù)實驗。MTT、EdU實驗、Transwell和劃線遷移實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)ANGPTL1，NCIH460細(xì)胞增殖能力、遷移能力和侵襲能力顯著降低，提示ANGPTL1對肺癌細(xì)胞具有抑制作用，進(jìn)一步提示ANGPTL1在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，有望成為肺癌治療及預(yù)后的標(biāo)志物。

腫瘤細(xì)胞異常增殖和血管形成均離不開細(xì)胞生物能量，線粒體是ATP的主要產(chǎn)生部位［16］。Drp1是參與線粒體凋亡分裂的活化蛋白，在線粒體動力學(xué)調(diào)控過程中扮演重要角色，其表達(dá)下調(diào)可引起線粒體延伸，從而抑制線粒體分裂［17］。文獻(xiàn)報道，敲除Drp1可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力［18］。PGAM5作為線粒體上的重要能量酶，是一種糖酵解酶，其異常激活可導(dǎo)致活性氧簇（ROS）增多，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。近期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壞死期間PGAM5和Drp1可形成“線粒體攻擊復(fù)合物”［19］。Bax是Bcl-2家族成員，是促細(xì)胞凋亡基因［20］。本研究Western blot檢測結(jié)果顯示，NCI-H460-ANGPTL1 mimic組細(xì)胞中PGAM5和Bax蛋白表達(dá)明顯高于NCI-H460和NCI-H460-NC組，而Drp1表達(dá)明顯低于NCI-H460和NCI-H460-NC組，提示過表達(dá)ANGPTL1可能通過抑制Drp1、激活PGAM5和Bax抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，ANGPTL1可作為新型腫瘤標(biāo)志物和潛在肺癌治療靶點(diǎn)。