王賀雙 紀 軍 吳園園 潘艷艷 高雁艷 楊 晉 孫曉彤 張 利

（大連市中心醫(yī)院中心實驗室，大連116033）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是臨床上常見的呼吸道腫瘤疾病之一［1］。有研究報道顯示，NSCLC的發(fā)病率約占肺癌的85%以上［2］。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，NSCLC的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，臨床中主要表現(xiàn)為胸部脹痛、咳血、低熱、疲乏、體重減輕等［3］。NK細胞屬于大顆粒T淋巴細胞，同時也是人體免疫系統(tǒng)重要的效應(yīng)細胞，在患者的腫瘤的入侵過程中，具有預(yù)先致敏效果［4］。在對患者的治療中，用于免疫治療的NK細胞主要來自患者的外周血。臨床研究發(fā)現(xiàn)，異體NK細胞的輸注治療效果優(yōu)于自體輸注?？钩绦蛐约毎劳龅鞍?（programmed cell death protein 1，PD-1）治療已經(jīng)在血液腫瘤系統(tǒng)的治療中得到確認［5］。PD-1主要表達于患者抗原呈遞細胞，對于患者的免疫系統(tǒng)的調(diào)控具有負性作用。在對NK細胞的擴增過程中，PD-1阻斷增強作用，對于患者的治療具有積極的意義［6］。本研究通過對PD-1阻斷增強體外擴增的NK細胞對NSCLC殺傷作用的研究，為臨床診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 本研究所采用的外周血單個核細胞主要來自健康人群的外周靜脈血；NSCLC主要來自中國科學(xué)院的HCC827細胞。所有健康人群均簽署知情同意書。將以上兩種細胞接種于含有10%的胎牛血清的RPMI1640的培養(yǎng)基中，37℃，CO2培養(yǎng)箱孵育過夜，間隔1 d進行營養(yǎng)液更換。

1.2 方法

1.2.1 NK細胞的體外擴增90% NK培養(yǎng)液采用10%FBS、2 mmol∕L GlutaMAX、10 μg∕ml的青霉素進行混勻。將外周血單個核細胞置于離心管中，放入等量的Ficoll液體，形成明顯的分離液體層。1 800 r∕min離心20 min，使用移液槍將分離層中間的白膜層取出，將白膜層放于其體積為3倍的PBS液體中，混勻，再次1 800 r∕min離心20 min，棄去上清液，使用PBS液體清洗，再次1 800 r∕min，離心20 min，取出對實驗有影響的混雜血小板成分。將以上得到的細胞分別接種于6孔板中，分別在6孔板中加入PBS液體稀釋的CD16抗體（5 μg∕ml）以及重組IL-2（500 U∕ml），溫箱培育5 d，孵育溫度設(shè)定為37℃，孵育第5天，采用臺盼藍進行染色，顯微鏡下進行計數(shù)，隨后添加重組IL-2。從第6天開始，隔天進行計數(shù)，繼續(xù)對其進行培養(yǎng)，第9天，根據(jù)細胞的數(shù)量，及時將以上培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中添加重組IL-2，分別在培養(yǎng)過程中的0 d、14 d、21 d以及25 d采用流式細胞儀進行NK細胞純度檢測［7］。

1.2.2 NK細胞的PD-1阻斷增強 分別將細胞加入離心管1、2、3中，向離心管2中加入5 μl PD-L1抗體，向離心管3中加入5 μl PD-L2抗體，混合均勻后，在4℃下靜置30 min后，分別向離心管1～3中加入1%的PBS液體再次1 800 r∕min離心20 min。棄去上清液，分別向離心管2～3中加入5 μl抗鼠IgGPE抗體，混合均勻后，室溫下靜置30 min。再次向離心管1～3中加入PBS液體再次1 800 r∕min離心20 min。棄去上清液，加入1%的PBS液體500 μl，重懸細胞，采用流式細胞儀進行NK細胞純度檢測。

1.2.3 PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的殺傷作用 取HCC827細胞置于96孔板中，貼壁后，使用1.2.1培養(yǎng)10 d的PD-1阻斷增強NK細胞以及未進行PD-1阻斷增強NK細胞，濃度分別為0.25、0.5、1 μmol∕L（HCC821細胞與NK細胞的比例設(shè)定為1：5），分別培養(yǎng)24 h、48 h、96 h，培養(yǎng)結(jié)束后，去掉培養(yǎng)基后，使用酶標(biāo)儀對HCC827細胞的抑制率進行分析。本研究中以PD-1阻斷增強NK細胞培養(yǎng)的HCC827細胞作為觀察組，以未進行PD-1阻斷增強NK細胞培養(yǎng)的HCC827細胞作為對照組，以培養(yǎng)24 h、48 h、96 h的細胞分別作為觀察組和對照組的凋亡組。（HCC827細胞與NK細胞的比例設(shè)定為1：5）HCC827細胞的生長抑制率=［1-（觀察組吸光度值-觀察組凋亡吸光度值）∕（對照組吸光度值-對照組凋亡吸光度值）］×100%［8］。

1.2.4 觀察指標(biāo)

1.2.4.1 PD-1阻斷增強NK細胞毒性分析 分別對離心管1、2、3中的PD-L1以及PD-L2表達水平進行比較。PD-L1以及PD-L2表達水平采用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4.2 PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平比較 分別對0.25、0.5、1 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平使用流式細胞儀進行檢測。在實驗過程中，NK細胞的純度在80%以上，數(shù)量為1×106個。

1.2.4.3 不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較 分別對0.25、0.5、1 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率進行比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0軟件進行分析。其中計量資料以±s表示，計數(shù)資料以［n（%）］表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1阻斷增強NK細胞的細胞毒性分析 本研究中，通過對NK細胞的純度進行分析，0、14、21及25 d NK細胞的 純 度分別為（0.12±0.03）%、（25.33±4.11）%、（39.94±4.58）%、（79.85±6.97）%。通過對離心管1～3中的PD-L1以及PD-L2表達水平進行比較，以及對NK細胞的PD-1阻斷增強作用，其PD-L1以及PD-L2表達水平顯著下降，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 PD-1阻斷增強NK細胞的細胞毒性分析（±s，μg/ml）Tab.1 PD-1 blockade enhances cytotoxicity of NK cells（±s，μg/ml）

表1 PD-1阻斷增強NK細胞的細胞毒性分析（±s，μg/ml）Tab.1 PD-1 blockade enhances cytotoxicity of NK cells（±s，μg/ml）

Groups TUBE1 TUBE2 TUBE3 F P PD-L1 2.55±0.23 0.15±0.16 1.26±0.29 12.632 0.000 PD-L2 2.69±0.52 1.51±0.51 0.26±0.29 13.069 0.000

2.2 PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平比較 通過對不同濃度的PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平比較，不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。通過分析，在0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞的細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平達到高峰。

表2 PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平比較（±s，%）Tab.2 PD-1 blockade enhances expression of granzyme B，perforin and CD107a in NK cells（±s，%）

表2 PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平比較（±s，%）Tab.2 PD-1 blockade enhances expression of granzyme B，perforin and CD107a in NK cells（±s，%）

Groups 0.25 μmol∕L 0.5 μmol∕L 1 μmol∕L F P Granzyme B 80.88±2.33 90.03±2.02 86.23±2.11 9.887 0.000 Perforin 86.27±2.72 94.22±1.84 89.32±2.12 5.998 0.000 CD107a 68.17±2.34 71.20±2.92 69.83±1.39 6.791 0.000

2.3 不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較 如表3所示，通過不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較，三組PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率顯著高于其他兩組。

表3 不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較（±s，%）Tab.3 Comparison of inhibition rate of NK cells on HCC827 cells by PD-1 blockade at different con?centrations（±s，%）

表3 不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較（±s，%）Tab.3 Comparison of inhibition rate of NK cells on HCC827 cells by PD-1 blockade at different con?centrations（±s，%）

Groups 0.25 μmol∕L 0.5 μmol∕L 1 μmol∕L F P Inhibition rate 40.20±2.91 80.91±3.23 60.77±1.13 11.033 0.000

3 討論

NSCLC是臨床較為常見的肺癌類型之一，在對腫瘤細胞的抑制性治療中，NK細胞的含量在一定程度上反應(yīng)機體的免疫功能以及對腫瘤細胞的殺傷作用。NK細胞的活性最早發(fā)現(xiàn)于19世紀70年代，隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，人們對于NK細胞的生物學(xué)功能以及抗腫瘤作用的研究有了飛躍的發(fā)展，有研究報道顯示NK細胞在免疫系統(tǒng)以及對抗惡性腫瘤中發(fā)揮重大作用［8］。NK細胞主要分布在外周血以及脾臟中，在患者遭遇病毒、細菌以及腫瘤侵入過程中，起到預(yù)先致敏作用［9-10］。近年來的研究顯示，NK細胞的免疫記憶功能，也進一步增強機體的適用性免疫功能［11］。在以往的研究中，通過對抗PD-1的NK細胞治療，已經(jīng)在血液腫瘤細胞的治療中得到證實。

通過對離心管1～3中的PD-L1以及PD-L2表達水平進行比較，PD-L1以及PD-L2表達水平顯著下降，分析認為，PD-L1以及PD-L2作為PD-1的配體，其含量顯著降低，提示，本研究采用的NK細胞的PD-1阻斷增強作用顯著成功。通過不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較，不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率顯著高于其他兩組，提示，0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞與HCC827細胞充分接觸后，降低PD-1、PD-L1以及PD-L2的連接性，T細胞的PD-L1以及PD-L2的活性顯著性抑制，對于非小細胞肺癌腫瘤細胞的增殖具有顯著的抑制性作用。生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PD-1陽性的T細胞通常被認為是較為疲憊的效應(yīng)細胞，在腫瘤患者中，通過與T細胞PD-L1連接［12-14］。通過對功能效應(yīng)以及擴增指數(shù)的降低，進而在一定程度上增強患者腫瘤細胞的擴增。同時在對患者的治療過程中，最為合適的NK細胞的治療劑量尚未明確，之前的動物實驗中，通過對動物的NK細胞的輸注，尚未發(fā)現(xiàn)劑量依賴性的不良反應(yīng)，而在治療中，目前治療劑量為108～109個∕kg，在正常情況下，PD-1、PD-L1以及PD-L2的相互作用可導(dǎo)致磷酸酶的活化從而抑制T細胞的受體信號的傳導(dǎo)，以及對免疫應(yīng)答的負性調(diào)節(jié)［15］。同時，PD-1、PD-L1以及PD-L2的連接性作用，還可以通過對亮氨酸的AFP的轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)作用，進而對T細胞的增殖以及細胞因子的分泌進行抑制。而通過對NK細胞的細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平的分析，在0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞的細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平達到高峰。提示在PD-1阻斷作用能顯著提升對腫瘤細胞的脫顆粒以及溶細胞功能。范曉杰等［16］通過對三陰性乳腺癌患者的分析認為，對患者的PD-1阻斷有望成為日后治療的方向，與本研究相互印證。

但是本研究還存在一定的局限性，由于倫理學(xué)的限制，尚未進行人體試驗，有望在日后的研究中進行。

綜上所述，0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞對小細胞肺癌的細胞阻斷作用顯著，其對腫瘤細胞的殺滅作用的機制主要與活化型受體的升高有關(guān)。