鮑丙溪 劉 健 萬(wàn) 磊 黃 旦 張 穎 龍 琰 孫廣瀚

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥230031）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是關(guān)節(jié)疾病中較常見(jiàn)的，全球約有2.5億人，占所有關(guān)節(jié)疾病的40%左右［1-2］。近年來(lái)，骨關(guān)節(jié)炎的患病率和負(fù)擔(dān)大大增加，生活水平的提高、人口老年化和肥胖人口的增加也成為發(fā)病率增高的因素［3-4］。

關(guān)節(jié)軟骨的破壞是OA最顯著的特征，包括滑膜、Ⅱ型膠原、聚集蛋白多糖、軟骨下骨和關(guān)節(jié)周圍軟組織的破壞，并伴有關(guān)節(jié)功能障礙［5-6］。骨關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、壓痛、僵硬，嚴(yán)重活動(dòng)性腫脹，甚至不能活動(dòng)［7］。除了關(guān)注疾病，我們還需要關(guān)注與疾病相關(guān)的生理、心理和社會(huì)互動(dòng)。與其他慢性疾病相比，OA患者的歲數(shù)相對(duì)較低。OA不僅給患者帶來(lái)疼痛，而且對(duì)其自身的社會(huì)交往也有很大影響，造成負(fù)面情緒，導(dǎo)致患者感受降低［8］。

本研究采用Raybiotech抗體芯片檢測(cè)OA患者體內(nèi)與免疫炎癥相關(guān)蛋白的變化情況，應(yīng)用ELISA進(jìn)行驗(yàn)證，并探究中醫(yī)藥對(duì)OA患者變化的差異蛋白及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的影響，探究其改善OA的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料 收集10例OA患者和10例健康人，利用蛋白芯片進(jìn)行關(guān)鍵蛋白篩選。30例OA治療前后患者和30例健康人，利用ELISA進(jìn)行關(guān)鍵蛋白驗(yàn)證，所有實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)樣本均來(lái)自2018年12月至2019年2月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科住院患者，健康對(duì)照組來(lái)自醫(yī)院健康體檢中心。兩組數(shù)據(jù)在年齡、性別上無(wú)差異。本研究獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理審查號(hào)：2014AH-06），患者知情且簽署同意書。①診斷標(biāo)準(zhǔn)：西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)按照1995年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］及2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)骨關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南［10］。②排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并其他風(fēng)濕性疾病，排除嚴(yán)重原發(fā)性心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病、妊娠期及哺乳期婦女、患有精神疾病無(wú)法配合的患者。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)組：新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥飲片口服（新風(fēng)膠囊：由薏苡仁、黃芪、蜈蚣、雷公藤組成，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑，皖藥制Z20050062，規(guī)格：0.34 g∕粒，3粒∕次，3次∕d；中藥湯劑內(nèi)服，1劑∕d，早晚分服），對(duì)照組：僅內(nèi)服中藥湯劑，1劑∕d。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.2.1 OA患者免疫炎癥差異蛋白篩選 芯片掃描得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Raybiotech軟件進(jìn)行芯片背景去除、芯片間歸一化處理。然后選擇Result數(shù)據(jù)來(lái)做分析。兩組間比較分析方法為moderated t-statistics，數(shù)據(jù)包為limma，來(lái)自R∕Bioconductor；采用adjustPvalue（或Pvalue）和logFC（表達(dá)差異倍數(shù)，以2為底）對(duì)差異蛋白進(jìn)行篩選；3組比較分析方法為One-way ANOVA，數(shù)據(jù)包為stats。

1.2.2.2 生物信息學(xué)分析 主成分分析（PCA）和基因本體分析（GO）分別鑒定了差異表達(dá)蛋白及其功能。京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析差異表達(dá)蛋白具有的主要生物學(xué)功能及其參與的主要生化代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。層次聚類分析差異蛋白表達(dá)模式。PCA數(shù)據(jù)包“ggfortify”、GO及KEGG富集分析數(shù)據(jù)包“clusterProfiler”、層次聚類分析數(shù)據(jù)包“gplots”。

1.2.2.3 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 關(guān)聯(lián)規(guī)則中將治療后指標(biāo)改善設(shè)為T，反之為F，前項(xiàng)為中藥或新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥，后項(xiàng)為關(guān)鍵蛋白和免疫炎癥實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。設(shè)定最小支持度及置信度，若生成的關(guān)聯(lián)規(guī)則中所有數(shù)據(jù)大于最小設(shè)定值，則被稱為強(qiáng)關(guān)聯(lián)規(guī)則［11］，計(jì)算公式如下［12］：

1.2.2.4 觀察指標(biāo) 關(guān)鍵蛋白：B7-1、ICOS、PD-L2；免疫炎癥指標(biāo)：免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、血沉（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）；患者感受相關(guān)指標(biāo)：患者焦慮量表（SAS）、患者抑郁量表（SDS）、SF-36量表（生理機(jī)能PF、生理職能RP、軀體疼痛BP、一般健康GH、精力VT、社會(huì)功能SF、情感職能RE、精神健康MH）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料以率表示，治療前后應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白芯片篩選OA免疫炎癥相關(guān)蛋白 選取OA組10例，男1例，女9例，平均年齡（59.8±9.5）歲；對(duì)照組10例，女8例，男2例，平均年齡（58.0±9.3）歲，兩組年齡、性別基線差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ELISA驗(yàn)證OA免疫炎癥相關(guān)蛋白，選取OA患者治療前及治療后30例，女24例，男6例，平均年齡（60.6±10.6）歲；對(duì)照組30例，女性26例，男性4例，平均年齡（55.3±8.9）歲，兩組年齡、性別基線差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 抗體芯片檢測(cè)OA患者血清蛋白表達(dá)譜

2.2.1 OA潛在生物標(biāo)志物的鑒定 通過(guò)火山圖（圖1A）和散點(diǎn)圖（圖1B）對(duì)OA組蛋白與Control組蛋白進(jìn)行比較，結(jié)果表明，OA組血清蛋白表達(dá)與Control組有顯著差異。其中OA組3個(gè)蛋白較Control組有顯著變化，OA組B7-1、ICOS、PD-L2均下調(diào)。

2.2.2 OA患者血清蛋白表達(dá)譜 圖1A火山圖表示有3個(gè)差異蛋白表達(dá)；圖1B中藍(lán)色表示下調(diào)蛋白，紅色表示上調(diào)蛋白；圖1C中紅色表示對(duì)照組，藍(lán)色表示OA患者，其中各樣本前兩個(gè)主成分（PC1和PC2）顯示，總變異率為84.05%和15.03%（圖1C），提示OA患者與對(duì)照組的蛋白表達(dá)模式存在差異；圖1D為差異蛋白熱圖，將樣本分為4個(gè)主要類群，第一類群包括3例OA患者和6例對(duì)照組，第二類群包括3例OA患者和1例對(duì)照組，第三類群僅包括3例OA患者，第四類群包括1例OA患者和3例對(duì)照組。

圖1 OA患者和對(duì)照組蛋白表達(dá)譜Fig.1 Protein expression profiles of OA patients and con?trols

2.2.3 生物信息學(xué)分析 通過(guò)GO富集分析顯示，有顯著功能項(xiàng)25個(gè)，其中BP功能項(xiàng)20個(gè)（圖2A），MF功能項(xiàng)3個(gè)（圖2B），CC功能項(xiàng)2個(gè)（圖2C）。KEGG富集分析顯示，DEPs在12個(gè)途徑中顯著富集（圖2D）。以上富集的信息和信號(hào)通路可能反映了OA的發(fā)病機(jī)制。

圖2 OA生物信息學(xué)分析Fig.2 OA bioinformatics analysis

2.3 關(guān)鍵蛋白驗(yàn)證 選取30例治療前后OA患者，通過(guò)ELISA對(duì)芯片篩選出的3個(gè)與OA免疫驗(yàn)證相關(guān)的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，OA組與對(duì)照組相比較，B7-1、ICOS、PD-L2（圖3）3個(gè)蛋白顯著下調(diào)（P＜0.01）。

圖3 ELISA驗(yàn)證差異蛋白變化Fig.3 Changes of DEPs were verified by ELISA

2.4 OA患者治療前關(guān)鍵蛋白與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析 利用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示ICOS與ESR、CRP、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4及BP呈顯著負(fù)相關(guān)，B7-1與SAS呈顯著正相關(guān)（圖4）。

圖4 關(guān)鍵蛋白與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of key proteins and related indexes

2.5 OA患者治療前后差異蛋白及相關(guān)指標(biāo)改善情況 選取30例治療前后OA患者，比較OA患者治療前后差異蛋白及相關(guān)指標(biāo)改善情況，結(jié)果顯示OA患者治療后B7-1、ICOS和PD-L2（P＜0.01），ESR、補(bǔ)體C4、SAS和BP（P＜0.05）均有明顯改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。

圖5 OA患者治療前后蛋白及相關(guān)指標(biāo)變化情況Fig.5 Changes of protein and related indexes in OA patients before and after treatment

2.6 兩組患者治療前后差異蛋白及相關(guān)指標(biāo)改善情況 選取30例治療后OA患者，其中對(duì)照組19例，實(shí)驗(yàn)組11例，比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組患者治療后相關(guān)指標(biāo)情況，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組治療后患者的CRP和IgA的改善情況相比對(duì)照組（圖6），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 兩組患者治療前后差異蛋白及相關(guān)指標(biāo)變化情況Fig.6 Changes of DEPs and related indexes before and after treatment in two groups

2.7 中藥與患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及其他相關(guān)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 選取30例OA患者，調(diào)取患者使用中藥情況，設(shè)定前項(xiàng)為單味中藥，設(shè)定后項(xiàng)為免疫炎癥相關(guān)差異蛋白和免疫炎癥實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，設(shè)置最小支持度為50%，最低置信度為90%，經(jīng)Aprior模塊分析，差異蛋白B7-1的上升與陳皮、蒲公英有強(qiáng)關(guān)聯(lián)；ICOS的上升與牡丹皮、蒲公英、丹參有強(qiáng)關(guān)聯(lián)；PD-L2的上升與桃仁、山藥和薏苡仁有強(qiáng)關(guān)聯(lián)，以上結(jié)果支持度均＞50%，置信度＞90%，提升＞1，見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組與差異蛋白的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Tab.1 Analy association rules between control group and related indexes

設(shè)定前項(xiàng)為新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥，設(shè)定后項(xiàng)為免疫炎癥相關(guān)差異蛋白和免疫炎癥實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，設(shè)置最小支持度為30%，最低置信度為70%，經(jīng)Aprior模塊分析，IgA、IgG、ESR和CRP的下降及差異蛋白ICOS、PDL2的上升均與新風(fēng)膠囊聯(lián)合山藥有強(qiáng)關(guān)聯(lián)，以上結(jié)果支持度均＞30%，置信度＞70，提升＞1，見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組與差異蛋白及免疫炎癥實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Tab.2 Association rule analysis of experimental group and relevant laboratory indexes

3 討論

OA是一種退行性骨關(guān)節(jié)疾病，以慢性滑膜炎、關(guān)節(jié)軟骨變性和軟骨下骨重塑為特征［13］。紅細(xì)胞沉降率（ESR）和c反應(yīng)蛋白（CRP）是顯著反映炎癥變化的指標(biāo)。ESR和CRP濃度是診斷膝關(guān)節(jié)疼痛（包括并發(fā)癥）的重要診斷方法。另外補(bǔ)體系統(tǒng)是先天免疫的重要組成部分，在OA患者滑膜和滑膜組織中可以檢測(cè)到［14］。修復(fù)軟骨紊亂引起的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的釋放以及軟骨細(xì)胞凋亡特征的改變所致的病理變化，與激活補(bǔ)體系統(tǒng)有一定的關(guān)聯(lián)，能顯著增強(qiáng)OA的病理反應(yīng)［15］。

ICOS是CD28家族的一員。ICOS信號(hào)在維持T淋巴細(xì)胞效應(yīng)和記憶細(xì)胞活化、免疫球蛋白轉(zhuǎn)換、調(diào)節(jié)Th細(xì)胞極化等方面發(fā)揮重要作用［16］。ICOS及其特異性配體（ICOSL）有激活誘導(dǎo)和調(diào)控免疫應(yīng)答的特征，推測(cè)ICOS∕ICOSL信號(hào)可能參與OA的發(fā)生發(fā)展，從而參與調(diào)節(jié)OA的免疫損傷和免疫紊亂［17］。B7-1蛋白表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面，在固有免疫系統(tǒng)中的作用是在免疫激活和免疫抑制之間建立平衡關(guān)系。B7-1及其受體，包括CD28、CTLA4和PD-L1，對(duì)機(jī)體的穩(wěn)定起著調(diào)節(jié)控制作用［18］。PDL2是B7-DC家族成員，是抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要調(diào)控分子，參與多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制［19］。關(guān)于B7-1和PD-L2在骨關(guān)節(jié)炎中的作用，相關(guān)文獻(xiàn)較少，尚需進(jìn)行大量的臨床研究或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

本研究使用蛋白芯片來(lái)分析OA患者和對(duì)照組血清中關(guān)鍵免疫炎癥蛋白的表達(dá)，獲得3個(gè)差異蛋白并進(jìn)行相關(guān)蛋白分析（GO、KEGG pathway、PCA），以了解OA新的發(fā)病機(jī)制。GO和KEGG富集分析表明，免疫炎癥的關(guān)鍵蛋白在OA的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。蛋白芯片篩選結(jié)果顯示，與OA相關(guān)的關(guān)鍵蛋白為ICOS、B7-1和PD-L2，經(jīng)ELISA驗(yàn)證，其表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)（P＜0.01）。中醫(yī)治療OA以安全、費(fèi)用低、患者痛苦小，可以改善患者關(guān)節(jié)功能及生活質(zhì)量而更容易被患者所接受。本次研究結(jié)果顯示：通過(guò)相關(guān)性分析，ICOS與ESR、CRP、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4及BP呈顯著負(fù)相關(guān)，B7-1與SAS呈顯著正相關(guān)，與臨床實(shí)際相符合；OA患者治療后B7-1、ICOS、PD-L2、ESR、補(bǔ)體C4、SAS和BP均有明顯改善（P＜0.05）；比較單純中藥組和中藥聯(lián)合新風(fēng)膠囊組患者治療后相關(guān)指標(biāo)情況，結(jié)果顯示使用中藥聯(lián)合新風(fēng)膠囊治療后患者的CRP和IgA的情況較使用單純中藥治療后改善較好；通過(guò)中藥與相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，結(jié)果顯示差異蛋白B7-1的上升與陳皮、蒲公英有強(qiáng)關(guān)聯(lián)；ICOS的上升與牡丹皮、蒲公英、丹參有強(qiáng)關(guān)聯(lián)；PD-L2的上升與桃仁、山藥和薏苡仁有強(qiáng)關(guān)聯(lián)，IgA、IgG、ESR和CRP的下降及差異蛋白ICOS、PD-L2的上升均與新風(fēng)膠囊聯(lián)合山藥有強(qiáng)關(guān)聯(lián)。研究表明陳皮、蒲公英、丹參、桃仁和山藥等有抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫的作用［20-24］，對(duì)調(diào)節(jié)差異蛋白有著重要作用；新風(fēng)膠囊是延續(xù)新安從脾治痹思想的基礎(chǔ)上研制的中成藥［25-27］，通過(guò)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析可知新風(fēng)膠囊與山藥聯(lián)合使用可以對(duì)免疫炎癥指標(biāo)及關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)有重要的作用，這與新風(fēng)膠囊的藥物組成可能有密切聯(lián)系。新風(fēng)膠囊主要由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等組成。組方中各藥都具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛的效果。黃芪、薏苡仁有益氣健脾作用，能夠調(diào)節(jié)雷公藤的毒副作用造成患者免疫力低下的不良反應(yīng)?，F(xiàn)代藥理研究證明，黃芪能增加巨噬細(xì)胞的數(shù)量以及提高其吞噬能力［28］。雷公藤具有祛風(fēng)濕、活血化瘀、通絡(luò)止痛的作用，能抗炎鎮(zhèn)痛、抑制白介素等細(xì)胞因子的表達(dá)，從而達(dá)到良好的治療效果［29］。文建庭等［30］通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘的方法研究新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥與單純中藥治療OA療效差別，研究顯示經(jīng)過(guò)隨機(jī)行走模型的分析，新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥在降低OA患者ESR和hs-CRP的效果優(yōu)于單純中藥組；汪元等［31］觀察中藥內(nèi)服外敷對(duì)OA的療效，發(fā)現(xiàn)新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥內(nèi)服與外敷在改善ESR、ALP、PLT、SOD等方面優(yōu)于硫酸氨基葡萄糖組，對(duì)患者的生活質(zhì)量也有一定的改善；談冰等［32］研究也發(fā)現(xiàn)新風(fēng)膠囊治療OA患者，在降低P65、TRAF、IL-17、hs-CRP、ESR，升高IL-4方面明顯優(yōu)于硫酸氨基葡萄糖組。新風(fēng)膠囊在臨床應(yīng)用數(shù)年，在治療骨關(guān)節(jié)炎上療效顯著。

應(yīng)用蛋白芯片檢測(cè)OA患者血清中與免疫炎癥相關(guān)的蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步明確RA的發(fā)病機(jī)理，發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)志物。從上述研究可知，中醫(yī)藥對(duì)改善骨關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵蛋白的表達(dá)有重要的作用，尤其是新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥不僅在改善關(guān)鍵蛋白上有明顯作用，在對(duì)免疫炎癥實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的改善上同樣發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。由于骨關(guān)節(jié)炎的蛋白表達(dá)研究相對(duì)較少，其機(jī)制還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。