王 娜 龔莉莉 葉春梅（武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心乳腺外科，武漢430014）

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤，其異質(zhì)性和轉(zhuǎn)移性導(dǎo)致患者死亡率居高不下［1］。研究乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)其精準(zhǔn)治療具有重要意義。

研究表明，IL-17a（interleukin-17a）在部分乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中高表達(dá)，體外可促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲［2］。IL-17在乳腺癌血清樣本中高表達(dá)，可促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展［3］。miR-146在乳腺癌患者中表達(dá)下調(diào)并與乳腺癌的發(fā)生和惡化有關(guān)［4］，miR-146b-5可通過靶向抑制IL-6表達(dá)抑制乳腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的致癌作用［5］。ZNRF2與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生有關(guān)［6］，參與miR-100抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖和耐藥過程［7］，且抑制ZNRF2表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)［8］。而ZNRF2在乳腺癌中的表達(dá)和作用尚不明確，其與miR-146b-5p和IL-17a在乳腺癌中是否存在關(guān)系還未可知。

本研究假設(shè)miR-146b-5p和ZNRF2參與IL-17a誘導(dǎo)乳腺癌進(jìn)展的過程，以期為乳腺癌的靶向治療提供新的研究靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料 選取本院病理科資料完整、診斷確切的女性乳腺癌手術(shù)切除癌癥組織20例和正常癌旁組織20例，患者年齡23～68歲，平均（45.4±9.6）歲，術(shù)前未進(jìn)行放療、化療及免疫治療。人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自美國(guó)ATCC；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和四氮唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；IL-17a抗體、ZNRF2抗體、MMP-2抗體、MMP-9抗體、STAT3抗體、p-STAT3抗體和β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；引物、miR-146b-5p模擬物（miR-146b-5p）、miR-146b-5p抑制劑（anti-miR-146b-5p）、ZNRF2抑制物（si-ZNRF2）、陰性對(duì)照（miR-con、anti-miR-con、si-con）及雙熒光素酶ZNRF2突變和野生型載體購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；雙熒光素報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒酶購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Total RNA提取試劑盒、real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RTPCR）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化測(cè)乳腺癌組織和癌旁組織中的IL-17a將乳腺癌組織和癌旁組織于4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，然后石蠟包埋、切片，按常規(guī)程序脫蠟和水化，再用3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min，枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，10%血清37℃封閉30 min，加入1∶200的IL-17a一抗4℃孵育過夜，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用PBS緩沖液沖洗3次×10 min，加入稀釋的二抗，37℃孵育30 min，洗3次，加DAB顯色液，避光顯色，終止顯色。蘇木素襯染胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，37℃干燥48 h，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和IL-17a處理 細(xì)胞培養(yǎng)：配制含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231培養(yǎng)于上述配制好的培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞成長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰蛋白酶消化傳代。

IL-17a處理：用培養(yǎng)液稀釋對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDAMB-231細(xì) 胞，以1×104個(gè)/孔 接 種于96孔板培 養(yǎng)24 h，然后在培養(yǎng)液中加入終濃度為0、10、50、100及300 μg/L的IL-17a，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h或72 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液不添加IL-17a。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將稀釋的MDA-MB-231細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書操作，將無(wú)血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體和各組片段及載體（包括miR-con、miR-146b-5p、anti-miRcon、anti-miR-146b-5p、si-ZNRF2、si-con、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體），將稀釋的脂質(zhì)體和各組載體片段等體積輕柔混勻，室溫孵育20 min后加入培養(yǎng)好的MDA-MB-231細(xì)胞中，混勻后培養(yǎng)6 h后，換成DMEM高糖完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4 Real-time PCR檢 測(cè)miR-146b-5p和ZNRF2 mRNA表達(dá) 收集IL-17a處理后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，根據(jù)RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒操作要求進(jìn)行cDNA合成，再以cDNA為模板按照real-time PCR說(shuō)明書進(jìn)行反應(yīng)，合成miR-146b-5p和ZNRF2 mRNA。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃2 min；94℃30 s、58℃40 s、72℃40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。以2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 Western blot收集各組實(shí)驗(yàn)MDA-MB-231細(xì)胞，裂解細(xì)胞，收集蛋白并檢測(cè)濃度。進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗，ZNRF2抗體（1∶2 000）、MMP-2抗體（1∶1 500）、抗MMP-9抗體（1∶1 000）、STAT3抗體（1∶5 000）、p-STAT3抗體（1∶2 000）和抗β-actin抗體（1∶3 000），4℃孵育過夜，PBST洗膜3次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h，顯影。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 MTT測(cè)定細(xì)胞活性 按照1.2.2的方法對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行IL-17a處理，分別在培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)，每孔加入20 μl MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔再加入150 μl DMSO，室溫振蕩5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm處吸光度（A）值。

1.2.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

1.2.7.1 遷移實(shí)驗(yàn) 將MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至5×105個(gè)/ml。在Transwell上層加入100 μl稀釋好的細(xì)胞，下層小室加入500 μl含10%FBS和IL-17a終濃度為100 μg/L的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，棄去培養(yǎng)液，用棉簽拭去上層小室未遷移的細(xì)胞，甲醛固定遷移的細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。

1.2.7.2 侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel用4℃無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶10比例稀釋，加入上層小室，37℃烘干3 h，以下步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，上層小室加入100 μl細(xì)胞，下層加入含10%FBS和IL-17a終濃度為100 μg/L的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，固定細(xì)胞，染色，計(jì)數(shù)。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)好的MDAMB-231細(xì)胞按照1.2.3步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的ZNRF2野生型（WT）和突變型（MUT）雙熒光素酶報(bào)告載體分別與miR-con或miR-146b-5p共轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)好的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，RIPA裂解液室溫裂解轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞20 min，離心收集裂解上清，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算螢火蟲熒光素相對(duì)酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17a在乳腺癌患者組織中高表達(dá) 檢測(cè)20例乳腺癌腫瘤組織和癌旁組織，結(jié)果表明，與癌旁組織相比，在大多乳腺癌腫瘤組織中IL-17a的表達(dá)呈陽(yáng)性（P＜0.05），見圖1。說(shuō)明IL-17在乳腺癌組織中高表達(dá)。

圖1 乳腺癌組織及癌旁組織中IL-17的表達(dá)（免疫組化染色，×200）Fig.1 Expression of IL-17 in breast carcinoma tissue and adjacent tissues（IHC staining，×200）

2.2 IL-17a處理促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移 分別用終濃度為0、10、50、100和300 μg/L的IL-17a處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株。結(jié)果表明，與對(duì)照組（0 μg/L）相比，經(jīng)IL-17a處理后MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性在48 h和72 h均明顯升高（P＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增多（P＜0.05），且呈劑量依賴趨勢(shì)。說(shuō)明IL-17a可促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和經(jīng)濟(jì)原則，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇100 μg/L的IL-17a處理細(xì)胞72 h（圖2）。

圖2 IL-17a處理促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲Fig.2 IL-17a treatment promoted proliferation，migration and invasion of breast cancer cell line MDAMB-231

2.3 IL-17a處理MDA-MB-231細(xì)胞抑制miR-146b-5p表達(dá)，促進(jìn)ZNRF2表達(dá) 與對(duì)照組相比，IL-17a處理后MDA-MB-231細(xì)胞中miR-146b-5p的表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），ZNRF2蛋白和mRNA表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），遷移侵襲蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。說(shuō)明IL-17a處理MDAMB-231細(xì)胞可抑制細(xì)胞中miR-146b-5p表達(dá)并促進(jìn)ZNRF2的表達(dá)（圖3）。

圖3 IL-17a處理MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)miR-146b-5p、ZNRF2、MMP-2和MMP-9含量的影響Fig.3 Effects of IL-17a treatment on levels of miR-146b-5p，ZNRF2，MMP-2 and MMP-9 in MDA-MB-231 cells

2.4 miR-146b-5p靶向調(diào)控ZNRF2 ZNRF2的3'-UTR序列中含有與miR-146b-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖4A。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果如圖4B所示，過表達(dá)miR-146b-5p時(shí)，WT型ZNRF2螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性明顯降低（P＜0.05）；而MUT型ZN-RF2的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯變化。Western blot結(jié)果表明，過表達(dá)miR-146b-5p時(shí)ZNRF2蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；抑制miR-146b-5p表達(dá)時(shí)ZNRF2蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），見圖4C。

經(jīng)檢測(cè)，與癌旁組織相比，在20例乳腺癌組織中，miR-146b-5p含量明顯降低（P＜0.05），ZNRF2蛋白含量明顯升高（P＜0.05），IL-17a表達(dá)量與miR-146b-5p呈負(fù)相關(guān)，miR-146b-5p與ZNRF2含量呈負(fù)相關(guān)，見圖4D～G。

2.5 IL-17a可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-146b-5p對(duì)MDAMB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及STAT3信號(hào)通路的影響 結(jié)果顯示，與Control組相比，IL-17a組MDAMB-231細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲數(shù)及細(xì)胞中ZNRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)升高，磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表達(dá)升高；與Control組或miR-con組相比，miR-146b-5p組MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中ZNRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），p-STAT3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與miR-146b-5p組 相 比，IL-17a+miR-146b-5p組MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中ZNRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），p-STAT3蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖5。說(shuō)明IL-17a可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-146b-5p對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及STAT3信號(hào)通路的抑制作用。

圖5 IL-17a可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-146b-5p對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響Fig.5 IL-17a reversed effects of miR-146b-5p overexpression on proliferation，migration and invasion of MDA-MB-231 cells

2.6 IL-17a可逆轉(zhuǎn)沉默ZNRF2對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及STAT3信號(hào)通路的影響 結(jié)果顯示，與si-con組相比，si-ZNRF2組MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲細(xì)胞及細(xì)胞中NRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），p-STAT3蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）；與si-ZNRF2組相比，si-ZNRF2+IL-17a組MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲細(xì)胞及細(xì)胞中NRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），p-STAT3蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），見圖6。說(shuō)明IL-17a可逆轉(zhuǎn)沉默ZNRF2對(duì)MDAMB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及STAT3信號(hào)通路的抑制作用。

圖6 IL-17a可逆轉(zhuǎn)沉默ZNRF2對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及STAT3信號(hào)通路的影響Fig.6 IL-17a reversed effects of miR-146b-5p overexpression on STAT3 signaling pathway of MDA-MB-231 cells

3 討論

IL-17由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥效應(yīng)物和抗微生物蛋白等因子，參與免疫性疾病和炎癥的發(fā)生。近年研究表明，IL-17也在腫瘤中發(fā)揮促癌或抗癌效應(yīng)［9-10］。IL-17a是IL-17家族成員之一，其單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與中國(guó)女性患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)［11］，而IL-17與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［12-13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-17a在乳腺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，IL-17a可在體外抑制乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231的增殖、遷移和侵襲，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致［14］，表明IL-17a可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

miRNA是一類小分子非編碼RNA，在真核生物體內(nèi)廣泛存在，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)過程，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［15］。研究顯示，上調(diào)miR-146b-5p通過靶向抑制MMP-16表達(dá)降低腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［16］。姜黃素可通過上調(diào)miR-146b-5p表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。本研究結(jié)果表明，在乳腺癌組織中miR-146b-5p表達(dá)水平下降，過表達(dá)miR-146b-5p可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致，表明miR-146b-5p作為抑癌基因參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，是乳腺癌治療的潛在分子靶點(diǎn)［18］。本研究還顯示，IL-17a可抑制MDA-MB-231細(xì)胞中miR-146b-5p表達(dá)，過表達(dá)miR-146b-5p可降低IL-17a對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用，與肖慶等［19］報(bào)道的IL-17a通過抑制miR-195-5p表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的結(jié)果一致。

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZNRF2的3'-UTR序列中含有與miR-146b-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，miR-146b-5p可能靶向調(diào)控ZNRF2表達(dá)。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot證實(shí)了miR-146b-5p在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控ZNRF2表達(dá)，這也與IL-17a抑制MDA-MB-231細(xì)胞中miR-146b-5p表達(dá)，促進(jìn)ZNRF2表達(dá)的結(jié)果一致。ZNRF2是環(huán)超家族E3泛素連接酶，可與細(xì)胞膜上的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mTOR）協(xié)同作用感知氨基酸供應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，在多種癌癥中發(fā)揮作用［20］。但目前，ZNRF2在乳腺癌中的表達(dá)和作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，ZNRF2在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，IL-17a可促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞中ZNRF2的表達(dá)，沉默ZNRF2可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，表明ZNRF2作為促癌基因參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，靶向抑制其表達(dá)可延緩乳腺癌發(fā)展進(jìn)程。

STAT3信號(hào)通路在多種惡性腫瘤中處于高度激活狀態(tài)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲過程，如膀胱癌、肺癌［21-22］。本研究顯示，IL-17a可激活乳腺癌細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致［23］。本研究還顯示，過表達(dá)miR-146b-5p或沉默ZNRF2可抑制IL-17a對(duì)乳腺癌細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的激活作用，進(jìn)一步表明過表達(dá)miR-146b-5p可能通過負(fù)調(diào)控ZNRF2抑制STAT3信號(hào)通路的激活從而降低IL-17a對(duì)乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。

綜上所述，IL-17a可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，過表達(dá)miR-146b-5p可通過靶向抑制ZNRF2表達(dá)降低IL-17a對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用。