蔣 慧 邵樂(lè)健 楊樹(shù)坤 宋 瑞（皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，宿州234000）

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高和死亡速度較快的原發(fā)性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命和身體健康［1-2］。非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的80%，包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌，癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂較快，且擴(kuò)散轉(zhuǎn)移較早［3］。非小細(xì)胞肺癌早期癥狀為發(fā)熱、咳嗽、胸痛等，多數(shù)患者因以上初期癥狀被誤診，約75%患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)［4］。非小細(xì)胞肺癌臨床治療方法以手術(shù)為主，以放化療、中藥治療為輔，但患者生存率仍然較低。靶向治療逐漸成為研究熱點(diǎn)，為非小細(xì)胞肺癌治療提供了新思路。miR-1204異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。DEK蛋白是高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，被確認(rèn)為是一種癌基因，其過(guò)表達(dá)已被證實(shí)與多種人類惡性腫瘤相關(guān)，可作為腫瘤治療靶點(diǎn)［5］。本文旨在研究miR-1204靶向調(diào)控DEK蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制，為非小細(xì)胞肺癌靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)）；兔抗大鼠Bak抗體（Invitrogen公司）；大鼠抗小鼠Bcl-2抗體（Dako公司）；兔抗小鼠caspase-7抗體（Selleck公司）；兔抗人DEK抗體（武漢博士德生物）；BCA蛋白定量試劑盒、MTT試劑盒（天根生化）；磷酸鹽緩沖液、胎牛血清、DMSO（北京中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，85%融合時(shí)傳代。

1.2.2 慢病毒載體構(gòu)建及分組 根據(jù)質(zhì)粒特點(diǎn)設(shè)計(jì)miR-1204引物序列，引入SacⅠ酶切位點(diǎn)，F(xiàn)：5'-UCGUGGCCUCCUCUCCAUUAU-3'，R：5'-AGCACCGGACCAGAGGUAAUA-3'，由寶生物工程（大連）有限公司合成，將正反鏈混合后加入退火緩沖液，94℃反應(yīng)4 min，冷卻至室溫，生成雙鏈。采用Eco31Ⅰ酶切線性化質(zhì)粒pGenesil-1，將退火產(chǎn)物100倍稀釋后與其連接，22℃孵育過(guò)夜，采用大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化，第2天采用單克隆菌落接種于30 μg/ml Kana的LB培養(yǎng)液，200 r/min離心，37℃振動(dòng)混合過(guò)夜。抽提少量質(zhì)粒，采用SacⅠ酶切鑒定（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成），分為空白組、miR-1204上調(diào)組和miR-1204下調(diào)組，重懸，分別加入4 μg生理鹽水、pcDNA3.1-miR-1204、miR-1204siRNA，電擊，室溫存放120 min，將各組細(xì)胞加入6孔、96孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，加入含800 μg/ml G418的培養(yǎng)基再次培養(yǎng)。

1.2.3 ELISA檢測(cè)DEK表達(dá) 將待檢細(xì)胞采用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液。50 mmol/L碳酸鹽稀釋抗DEK，置于聚苯乙烯反應(yīng)孔，4℃放置24 h，次日洗滌3次，甩干，各孔中加入稀釋液稀釋的待測(cè)標(biāo)本0.1 ml，同時(shí)加入陰性陽(yáng)性的對(duì)照標(biāo)本，45℃放置60 min，洗滌3次，移除液體，各孔中加入0.1 ml DEK酶標(biāo)抗體，45℃放置60 min，洗滌3次，移除液體，各孔中加入0.1 mol/L Na2HPO4和0.05 mol/L枸櫞酸混勻，加入0.1 ml鄰苯二胺，遮光保存20 min，加入0.05 ml H2SO4（2 mol/L）終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)DEK水平。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將待測(cè)細(xì)胞置于96孔板，12 h、24 h、72 h后加入MTT溶液常溫孵育4 h，加入DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)497 nm處各孔OD值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將培養(yǎng)好的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗3次，各組取樣本細(xì)胞加入5 μl AnnexinV染液和10 μl碘化丙啶染液，常溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 將培養(yǎng)好的細(xì)胞用70%乙醇溶液固定，4℃保存過(guò)夜，離心5 min去除固定液，磷酸鹽緩沖液清洗3次。加入100 μl RNA酶（100 μg/ml），常溫保存30 min，加入100 μl碘化丙啶染色液，低溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.2.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)細(xì)胞侵襲、遷移情況 細(xì)胞侵襲情況：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前2 h濕化小室，上室加入細(xì)胞懸液200 μl，下室加入含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛中放置30 min。細(xì)胞遷移情況：胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板，10槍尖垂直于孔板底部劃直線，PBS緩沖液清洗3次，常溫培養(yǎng)24 h，拍照，計(jì)算劃痕。

1.2.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

提取蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，離心10 min，取上清電泳5 min，10%牛奶封閉90 min。加入一抗孵育1 d，清洗，加入二抗孵育1 h，清洗，顯色，檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bak、Bcl-2、caspase-9表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s描述，3組間比較采用F檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-1204靶向調(diào)控DEK表達(dá)miR-1204下調(diào)組DEK表達(dá)高于空白組（P＜0.05）。miR-1204上調(diào)組DEK表達(dá)低于空白組、miR-1204下調(diào)組（P＜0.05，表1）。

表1 miR-1204靶向調(diào)控DEK表達(dá)（±s）Tab.1 miR-1204 targeting regulated DEK expression（±s）

表1 miR-1204靶向調(diào)控DEK表達(dá)（±s）Tab.1 miR-1204 targeting regulated DEK expression（±s）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05；compared with down-regulated miR-1204 group，2）P＜0.05.

Groups Blank Down-regulated miR-1204 Up-regulated miR-1204 DEK 0.85±0.22 1.34±0.421）0.69±0.101）2）

2.2 各組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖率、凋亡率比較miR-1204下調(diào)組細(xì)胞增殖率高于空白組（P＜0.05）；miR-1204上調(diào)組細(xì)胞增殖率低于空白組、miR-1204下調(diào)組（P＜0.05）。miR-1204下調(diào)組細(xì)胞凋亡率低于空白組（P＜0.05）；miR-1204上調(diào)組細(xì)胞凋亡率高于空白組、miR-1204下調(diào)組（P＜0.05，表2）。

表2 各組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖率、凋亡率比較（±s，%）Tab.2 Comparison of proliferation rate and apoptosis rate of NSCLC cells in each group（±s，%）

表2 各組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖率、凋亡率比較（±s，%）Tab.2 Comparison of proliferation rate and apoptosis rate of NSCLC cells in each group（±s，%）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05；compared with down-regulated miR-1204 group，2）P＜0.05.

Groups Blank Down-regulated miR-1204 Up-regulated miR-1204 Proliferation rate 24 h 47.23±5.07 53.39±6.471）40.02±5.341）2）48 h 50.87±5.15 59.52±6.631）33.11±4.271）2）72 h 53.14±5.23 65.29±6.691）20.94±3.751）2）Apoptosis rate 24 h 24.18±5.06 20.39±5.171）25.02±5.341）2）48 h 26.83±4.75 23.12±5.611）33.11±4.271）2）72 h 29.14±5.23 25.02±4.391）40.94±5.751）2）

2.3 各組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期分布情況比較miR-1204下調(diào)組細(xì)胞處于G1期的比例高于空白組（P＜0.05）；miR-1204上調(diào)組細(xì)胞處于G1期的比例低于空白組、miR-1204下調(diào)組，（P＜0.05，表3）。

表3 各組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期分布情況比較（±s，%）Tab.3 Comparison of cell cycle distribution of NSCLC in each group（±s，%）

表3 各組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期分布情況比較（±s，%）Tab.3 Comparison of cell cycle distribution of NSCLC in each group（±s，%）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05；compared with down-regulated miR-1204 group，2）P＜0.05.

Groups Blank Down-regulated miR-1204 Up-regulated miR-1204 G1 22.25±4.12 25.35±3.831）20.67±3.511）2）S 26.95±3.08 30.49±3.751）17.34±2.161）2）G2 29.11±2.93 38.32±3.251）12.24±2.181）2）

2.4 各組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 空白組、miR-1204上調(diào)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于miR-1204下調(diào)組（P＜0.05）；空白組與miR-1204上調(diào)組遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于miR-1204下調(diào)組（P＜0.05，表4、圖1）。

表4 細(xì)胞侵襲、遷移情況（±s，%）Tab.4 Cell invasion and migration（±s，%）

表4 細(xì)胞侵襲、遷移情況（±s，%）Tab.4 Cell invasion and migration（±s，%）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05；compared with down-regulated miR-1204 group，2）P＜0.05.

Groups Blank Down-regulated miR-1204 Up-regulated miR-1204 Invasive cells number 63.87±12.59 82.64±16.751）51.66±9.851）2）Migrating cells number 66.72±11.37 79.66±13.551）55.67±8.761）2）

2.5 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bak、Bcl-2、caspase-9表達(dá) 如表5、圖2所示，miR-120下調(diào)4組細(xì)胞Bcl-2、caspase-9蛋白表達(dá)高于空白組，Bak蛋白表達(dá)低于空白組（P＜0.05）；miR-1204上調(diào)組細(xì)胞Bcl-2、caspase-9蛋白表達(dá)低于空白組、miR-1204下調(diào)組，Bak蛋白表達(dá)高于空白組、miR-1204下調(diào)組（P＜0.05）。

表5 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bak、Bcl-2、caspase-9表達(dá)（±s）Tab.5 Expressions of apoptosis related proteins Bak，Bcl-2 and caspase-9 in each group（±s）

表5 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bak、Bcl-2、caspase-9表達(dá)（±s）Tab.5 Expressions of apoptosis related proteins Bak，Bcl-2 and caspase-9 in each group（±s）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05；compared with down-regulated miR-1204 group，2）P＜0.05.

Groups Blank Down-regulated miR-1204 Up-regulated miR-1204 Bak 1.02±0.14 0.73±0.121）1.39±0.221）2）Bcl-2 1.18±0.19 1.44±0.231）0.71±0.111）2）caspase-9 0.94±0.15 1.16±0.181）0.62±0.101）2）

圖2 Bak、Bcl-2、caspase-9表達(dá)Fig.2 Expressions of Bak，Bcl-2 and caspase-9

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是肺原發(fā)性惡性腫瘤，位居我國(guó)城市人口惡性腫瘤死亡原因第一［6］。EGRF絡(luò)氨酸激酶抑制藥使分子靶向治療進(jìn)入人們的視野，為非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化治療注入了新的生命［7］。各類靶向藥物研究層出不窮，尋找有效治療靶點(diǎn)對(duì)非小細(xì)胞肺癌治療至關(guān)重要。研究證明，微小RNA（miRNA）參與多種復(fù)雜生物過(guò)程，具有組織特異性，其功能可根據(jù)靶基因作用不同調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展，具有癌基因或抑癌基因作用，可作為腫瘤診斷生物標(biāo)志物［8］。

miR-1204由非蛋白編碼PVTI基因座編碼，對(duì)相關(guān)基因具有負(fù)調(diào)控作用，參與多個(gè)復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，在細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮作用［9-10］。DEK蛋白普遍存在于部分蛋白及多細(xì)胞生物中，在急性髓系白血病亞型中以DEK-CAN融合蛋白形式分離，在結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌等多種人類腫瘤中呈高表達(dá)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。劉雙萍等［11］研究發(fā)現(xiàn)，DEK蛋白檢測(cè)可作為宮頸癌細(xì)胞增殖指標(biāo)之一，有望成為宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。本研究顯示，miR-1204上調(diào)組DEK蛋白表達(dá)較低，說(shuō)明上調(diào)miR-1204可降低DEK蛋白表達(dá)，對(duì)DEK具有靶向調(diào)控作用。

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞異常增殖可不斷產(chǎn)生新的癌細(xì)胞，促進(jìn)疾病發(fā)展。郭智慧等［12］研究認(rèn)為，Notch1靶向調(diào)控DEK基因可顯著抑制癌細(xì)胞增殖，抑制乳腺癌發(fā)展，提示靶向作用于DEK基因?qū)Π┘?xì)胞具有抑制效果。本研究顯示，miR-1204上調(diào)組12 h、24 h、72 h非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖率降低，說(shuō)明上調(diào)miR-1204可降低DEK基因表達(dá)，抑制癌細(xì)胞增殖。

細(xì)胞周期分為3個(gè)階段：DNA合成前期（G1）、合成期（S）、合成后期（G2），S期是細(xì)胞分裂增殖的關(guān)鍵時(shí)期，將細(xì)胞阻滯于S期之前可有效抑制癌細(xì)胞發(fā)展［13］。李偉偉等［14］研究發(fā)現(xiàn)，siRNA靶向調(diào)控DEK基因可改變癌細(xì)胞周期分布。本研究顯示，miR-1204上調(diào)組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞處于G1期的比例相對(duì)較高，說(shuō)明上調(diào)miR-1204可降低DEK基因表達(dá)，改變腫瘤細(xì)胞周期分布。

非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展與腫瘤組織細(xì)胞不斷侵襲、遷移密切相關(guān)，抑制癌細(xì)胞侵襲、遷移能力是抑制非小細(xì)胞肺癌發(fā)展的關(guān)鍵。本研究顯示，上調(diào)miR-1204表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)相對(duì)較少，說(shuō)明上調(diào)miR-1204表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲、遷移，抑制腫瘤組織發(fā)展、擴(kuò)散。

細(xì)胞異常凋亡與細(xì)胞異常增殖密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)性凋亡過(guò)程，與多種凋亡相關(guān)因子相互作用有關(guān)［15-16］。caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白等在凋亡信號(hào)中扮演重要角色［17-18］。Bcl-2家族蛋白分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白2類，Bak屬于促凋亡蛋白，Bcl-2屬于抗凋亡蛋白；caspase-9屬于凋亡執(zhí)行因子［19-20］。本研究顯示，miR-1204上調(diào)組12 h、24 h、72 h非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡率升高，且miR-1204上調(diào)組細(xì)胞Bcl-2、caspase-9蛋白表達(dá)降低，Bak蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明上調(diào)miR-1204可降低DEK基因表達(dá)，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bak、Bcl-2、caspase-9相對(duì)表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)展。

綜上所述，miR-1204上調(diào)可降低DEK表達(dá)，通過(guò)調(diào)控Bak、Bcl-2、caspase-9表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期分布，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。