左 強 歐云生 余浩洋 鐘申熹 張木子（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶400016）

骨肉瘤是青少年常見的骨原發(fā)惡性腫瘤之一，伴隨著醫(yī)療技術的進步及新輔助治療出現，患者的總體生存率有所提高，但骨肉瘤復發(fā)和轉移仍是治療的難題［1-2］。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）作為一種治療時間窗短、毒副反應小、可重復治療的新型治療惡性腫瘤的方法，已廣泛運用于臨床相關惡性腫瘤的治療［3-4］。

葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是一種關鍵的內質網管腔內分子伴侶，具有強大的抗凋亡特性，在多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的增殖和存活密切相關［5-7］；此外，有研究表明，GRP78也是腫瘤細胞抗性的關鍵調節(jié)因子，與腫瘤的耐藥、復發(fā)及轉移密切相關［8-9］。在乳腺癌及結腸癌研究中發(fā)現，沉默GRP78表達可增強腫瘤細胞對放化療的敏感性［10-11］，但GRP78在PDT治療骨肉瘤中的研究較少。本研究將運用siRNAGRP78干擾人骨肉瘤細胞HOS中GRP78的表達，并探討其對焦脫鎂葉綠酸-α甲酯介導的光動力療法（MPPα-PDT）作用下HOS細胞增殖活性、凋亡水平及Wnt通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑 人骨肉瘤HOS細胞株購自中國科學院上海細胞庫。焦脫鎂葉綠酸-α甲酯（pyropheophorbide-α methyl ester，MPPα）購于美國Sigma公司；胎牛血清、高糖DMEM細胞培養(yǎng)基等均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、Lipo8000TM轉染試劑及Hoechst凋亡試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司；Annexin V-PI雙染檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術股份有限公司；CCK-8試劑盒購自上海MedChemExpress公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；RNA提取試劑購自北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自上海東洋紡生物科技公司；PCR檢測試劑盒購自美國應用生物系統公司；干擾GRP78基因（siRNA-GRP78）由上海漢恒生物科技有限公司合成，序列如下：正義鏈5'-CCAAAGACGCUGGAACUAUTT-3'，反 義 鏈5'-AUAGUUCCAGCGUCUUUGGTT-3'，siRNA陰性對 照，序列如下：正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'，反義鏈5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'。兔抗人GRP78多克隆抗體、兔抗人βactin多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體均購自中國武漢三鷹公司；兔抗人Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3單克隆抗體均購自美國CST公司；兔抗人Ki67、兔抗人PCNA、兔抗人PKT、兔抗人GSK3β、兔抗人β-catenin多克隆抗體購自中國武漢賽維爾生物科技有限公司；兔抗人P-AKT、兔抗人P-GSK3β均購自中國博士德生物工程有限公司；Cy3標記的羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.1.2 儀器 光動力治療儀購自重慶京渝激光生物研究所；流式細胞儀購自美國B&D Biosciences公司；倒置熒光顯微鏡、正置熒光顯微鏡均購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 人骨肉瘤HOS細胞的培養(yǎng) 人骨肉瘤HOS細胞株用含有0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素與10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的孵箱中避光培養(yǎng)，待細胞密度達60%～70%時，常規(guī)傳代。

1.2.2 PDT處理HOS細胞 取對數生長期的人骨肉瘤HOS細胞，常規(guī)胰酶消化，按實驗分組傳代。待細胞生長密度為50%～60%時，避光加終濃度為0.15 μmol/L的光敏劑MPPα，繼續(xù)避光培養(yǎng)20 h，經波長630 nm、40 mW/cm2的連續(xù)輸出方式，光照120 s，繼續(xù)在37℃、體積分數為5%CO2的培養(yǎng)箱中根據實驗分組進行避光孵育［12］。

1.2.3 Hoechst染色檢測細胞凋亡 取對數生長期的人骨肉瘤HOS細胞，常規(guī)胰酶消化，6孔板中按Control組、MPPα組、LED組、MPPα-PDT 24 h組分組。MPPα-PDT處理后，根據操作說明每孔加入Hoechst固 定 液 固 定15 min，PBS洗 凈，每 孔 加 入Hoechst33342染料1 ml染色5 min，PBS洗凈殘余染料，倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞細胞核變化。

1.2.4 脂質體介導siRNA-GRP78轉染HOS細胞取對數生長期的HOS細胞，接種于6孔板，分組如下：Control組、siRNA-NC組、siRNA-GRP78組，取15 ml離心管，每孔HOS細胞加入125 μl DMEM培養(yǎng)基，加入100 pmol siRNA，混勻，加入4 μl Lipo8000TM轉染試劑，室溫靜置20 min，最后每孔加入125 μl上述混合液，輕輕搖勻，轉染6 h，更換為完全培養(yǎng)基，72 h后可行下一步實驗。

1.2.5 qPCR法檢測GRP78 mRNA的表達水平細胞轉染siRNA-GRP78 72 h后，Trizol法提取RNA，逆轉錄cDNA，采用10 μl上樣體系依次上樣，運用以下上機程序：95℃、30 s，共1個循環(huán)；90℃、5 s，60℃、30 s，65℃、5 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內參，引物序列分別為：β-actin上游：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游：5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'；GRP78上游：5'-CACGCCGTCCTATGTCGC-3'，下 游：5'-AAATGTCTTTGTTTGCCCACC-3'。采用2-ΔΔCt法進行標準化，并計算GRP78基因mRNA的相對表達量。

1.2.6 CCK-8法檢測細胞增殖活性 取對數生長期的細胞，按5 000個/孔接種于96孔板。分為Control組、siRNA-GRP78組、siRNA-GRP78+MPPα-PDT組及MPPα-PDT組，分別于處理后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h檢測HOS細胞增殖活性。根據CCK-8檢測試劑盒操作說明按每孔加入10 μl CCK-8溶液和90 μl DMEM培養(yǎng)液混合液，孵育箱中反應1 h。用酶標儀于波長為450 nm處測定各孔的OD值。每組設置5個復孔，重復3次，取平均值計算各組細胞的存活率。細胞存活率（%）=（實驗組平均OD值-調零孔OD值）/（空白組平均OD值-調零孔OD值）×100%。

1.2.7 Western blot檢測GRP78蛋白、凋亡相關蛋白及Wnt通路相關蛋白表達 取對數生長期的骨肉瘤HOS細胞，按1.2.6中方法對細胞進行分組，行相關處理后提取細胞蛋白。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，Western blot檢測相關蛋白（β-catenin、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β）表達。Image Lab 5.2.1軟件分析目的條帶，以目標蛋白與β-actin灰度值比值作為目標蛋白相對表達量。

1.2.8 流式細胞術檢測HOS骨肉瘤細胞凋亡率取對數生長期的HOS細胞，按1.2.6中方法對細胞進行分組，行相應處理后，PBS緩沖液洗3次，胰酶消化，離心，棄上清液，收集細胞沉淀，每組收集3個批次細胞樣本，Annexin V-PI試劑雙染，流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.9 免疫熒光檢測GRP78蛋白熒光強度 取對數生長期的HOS細胞，接種于6孔板中25 mm細胞爬片，按1.2.6中方法對細胞進行分組，按1.2.1中方法相應處理，繼續(xù)避光孵育12 h。4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗3次，0.1%TritonX-100破膜15 min，山羊抗兔血清封閉40 min，兔多克隆GRP78抗體稀釋后（1∶100）4℃過夜孵育。避光條件下加入Cy3標記的羊抗兔IgG熒光二抗室溫下孵育40 min，PBS洗3次，DAPI染核5 min，PBS洗凈殘余DAPI，封片，正置熒光顯微鏡觀察。采用Image J 1.52e軟件進行熒光強度分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS23.0軟件統計分析實驗數據。每組實驗均獨立重復3次，數據用±s表示。組內兩兩比較采用t檢驗，多組間均數的比較采用方差分析；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MPP α-PDT可誘導HOS細胞發(fā)生凋亡Hoechst凋亡染色（圖1A）提示，與Control組、LED組、MPPα組相比，MPPα-PDT-24 h組中HOS細胞核可見高亮藍色以及核碎裂、固縮等細胞凋亡形態(tài)學變化。流式細胞術（圖1B、C）提示MPPα-PDT 3 h、6 h、12 h、24 h組中凋亡率隨時間增加而升高（P＜0.01）。

圖1 HOS細胞凋亡形態(tài)變化（A）及凋亡率檢測（B、C）Fig.1 Detection of morphological changes of HOS cell apoptosis（A）and apoptosis rate（B，C）

2.2 MPPα-PDT可 誘 導HOS細胞GRP78表達增高Western blot（圖2）顯示，與Control組比較，MPPα-PDT處 理HOS細 胞3 h、6 h、12 h、24 h組GRP78表達水平增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；并且12 h表達量最高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。Western blot結果提示，在骨肉瘤HOS細胞中，經過MPPα-PDT處理后，GRP78在12 h表達水平最高。故選用12 h時間點進行下一步實驗。

圖2 Western blot檢測MPPα-PDT處 理后HOS細胞 中GRP78蛋白表達Fig.2 GRP78 protein expression level in HOS cells after MPPα-PDT treatment was detected by Western blot

2.3 siRNA-GRP78有效沉默人骨肉瘤HOS細胞中GRP78的表達Western blot（圖3A、B）顯示，與Control組比較，siRNA-GRP78組骨肉瘤HOS細胞中GRP78蛋白的表達水平降低（P＜0.05），siRNA-NC組GRP78蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。qPCR法（圖3C）顯示，與Control組相比，siRNAGRP78組骨肉瘤HOS細胞中GRP78 mRNA的表達水平降低，干擾率約為74.60%（P＜0.05），siRNA-NC組與Control組之間相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。骨 肉 瘤HOS細 胞 中siRNA-GRP78組 對GRP78 mRNA的干擾率約為74.60%。以上結果表明，siRNA-GRP78有效地干擾了HOS細胞中GRP78的表達。

圖3 siRNA-GRP78對HOS細胞 中GRP78蛋白和mRNA表達的影響Fig.3 Effect of siRNA-GRP78 on expression of GRP78 protein and mRNA in HOS cells

2.4 沉默GRP78表達降低人骨肉瘤HOS細胞的增殖活性GRP78蛋白免疫熒光（圖4A、B）顯示，與Control組比 較，siRNA-GRP78組 及siRNA-GRP78+MPPα-PDT組中GRP78平均熒光強度均降低（P＜0.05），MPPα-PDT組中GRP78平均熒光強度增加（P＜0.05）；與MPPα-PDT組比較，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組GRP78平均熒光強度降低（P＜0.05）。

CCK-8法（圖4C）檢測結果表明，與Control組比較，siRNA-GRP78組、MPPα-PDT細胞增殖活性隨時間延長而下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與MPPα-PDT組相比，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組細胞活性顯著降低（P＜0.05）。

Western blot（圖4D、E）檢測顯示，與Control組比較，siRNA-GRP78組、siRNA-GRP78+MPPα-PDT組及MPPα-PDT組中增殖蛋白PCNA、Ki67表達均下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與MPPα-PDT組比較，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組中PCNA、Ki67蛋白表達下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。以上結果提示，siRNA-GRP78可降低HOS細胞的增殖活性，同時可增強MPPα-PDT對細胞增殖活性的抑制作用。

圖4 GRP78表達對HOS細胞增殖活性的影響Fig.4 Effect of expression of GRP78 on proliferation activity of HOS cells

2.5 沉默GRP78表達上調人骨肉瘤HOS骨肉瘤細胞的凋亡水平Western blot（圖5A、B）檢測顯示，與Control組比較，siRNA-GRP78組、MPPα-PDT組及siRNA-GRP78+MPP-PDT組Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3凋亡相關蛋白表達上調（P＜0.05）；與MPPα-PDT組相比，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組凋亡相關蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3表達都明顯上升（P＜0.01）。

圖5 各組HOS細胞凋亡相關蛋白的表達及凋亡率檢測Fig.5 Detection of expression of apoptosis-related proteins and apoptosis rate of HOS cells

流式細胞儀檢測細胞凋亡結果（圖5C、D）顯示，siRNA-GRP78組HOS細 胞 的 凋 亡 率 為（13.93±1.06）%，高于Control組（5.98±0.51）%（P＜0.05）；siRNA-GRP78+MPPα-PDT組 凋 亡 率 為（51.99±2.15）%，高于MPPα-PDT組（32.19±2.79）%和siRNA-GRP78組（P＜0.05）。以上結果提示沉默GRP78表達增加HOS細胞的凋亡率及凋亡相關蛋白的表達，并且增加MPPα-PDT作用下的細胞凋亡水平。

2.6 沉默GRP78表達可抑制MPPα-PDT誘導HOS細胞中Wnt通路的激活Western blot（圖6）檢測結果顯示，與Control組比較，siRNA-GRP78組中p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β及β-catenin等Wnt通路相關蛋白表達下降（P＜0.05）；與MPPα-PDT組比較，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β及β-catenin等Wnt通路相關蛋白表達下降（P＜0.05）。以上結果提示，沉默GRP78表達可有效抑制MPPα-PDT處理后HOS骨肉瘤細胞中Wnt通路的激活。

圖6 Western blot檢測Wnt通路相關蛋白的表達Fig.6 Expression levels of Wnt pathway related proteins were detected by Western blot

3 討論

PDT是一種治療效果顯著的新型治療腫瘤方法，MPPα作為新型的第二代光敏劑，能夠特異性富集在腫瘤部位，然后利用特定波長的光照射腫瘤，使光敏劑發(fā)生光化學反應，導致腫瘤細胞發(fā)生凋亡［13］。腫瘤細胞在受到外界不利刺激后，會迅速誘導內質網應激，激活未折疊蛋白反應，恢復腫瘤細胞內質網微環(huán)境的穩(wěn)定，增強腫瘤細胞對外界刺激的適應性［14-15］。GRP78作為內質網應激的關鍵調節(jié)蛋白，通過維持內質網的鈣穩(wěn)態(tài)及控制傳感器的激活，調節(jié)未折疊蛋白反應，使細胞微環(huán)境恢復穩(wěn)態(tài)［16-17］。本研究結果顯示，MPPα-PDT作用于HOS細胞后，可誘導HOS細胞發(fā)生凋亡，并且能夠激活未折疊蛋白反應，使GRP78表達的增加。

GRP78作為一種多功能蛋白折疊伴侶和共受體，具有強大的抗細胞凋亡特性，在人類發(fā)育和疾病中起著關鍵作用，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關［18-19］。在腫瘤細胞中，GRP78能夠激活“促生存”通路，促進腫瘤細胞增殖、抗凋亡，增強腫瘤細胞對不利刺激的適應性，使腫瘤細胞對放化療產生抗性［20］。在胰腺導管細胞癌的研究中，腫瘤組織中GRP78表達較高，并與腫瘤的化療抗性與復發(fā)相關［21］。在復發(fā)性多形性膠質母細胞瘤的研究中，GRP78表達較高的細胞有更強的增殖與成瘤性［22］。本研究結果顯示，siRNA-GRP78沉默HOS骨肉瘤細胞中GRP78表達后，HOS細胞的增殖蛋白及增殖活性下降，凋亡蛋白上調，表明GRP78在HOS細胞中起抗凋亡、促增殖的作用。

GRP78的重要性在各種癌細胞的研究中得到證實，目前認為GRP78主要通過激活經典Wnt信號通路，促進腫瘤的侵襲與轉移［23-24］。在肝癌中發(fā)現，GRP78通過靶向LRP6激活Wnt信號通路，促進肝癌的侵襲與轉移［25］。在結腸癌中發(fā)現，沉默GRP78可以通過干擾Wnt配體的糖基化在體外抑制Wnt信號，從而增強結腸癌干細胞對化療藥的敏感性［26］。在乳腺癌中發(fā)現，乳腺癌細胞增殖和遷移與Wnt信號通路激活相關，并且以GRP78為靶點的藥物異甘草素通過抑制Wnt信號通路增強化療藥物對腫瘤細胞的敏感性［27-28］。在骨肉瘤研究中發(fā)現，化療藥物可誘發(fā)腫瘤細胞Wnt通路激活，抑制該通路可增加化療對骨肉瘤細胞的敏感性［29］。β-catenin作為Wnt通路的核心蛋白，受上游分子GSK3β、AKT的調節(jié)，磷酸化GSK3β（p-GSK3β）及磷酸化AKT（p-AKT）作為其活化形式，可促進下游分子β-catenin激活，βcatenin入核后積累，作為轉錄因子調節(jié)下游靶基因，從而發(fā)揮其生物學作用［27］。本研究結果顯示，與Control組比較，siRNA-GRP78組中AKT、GSK3β稍下降，p-AKT及p-GSK3β明顯下降，且p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比例及β-catenin均明顯下降，表明有效沉默GRP78后，Wnt通路相關蛋白受抑制；同理，與Control組比較，MPPα-PDT組中Wnt信號通路中p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比例及βcatenin均增加，表明MPPα-PDT可誘導HOS骨肉瘤細胞中Wnt通路激活；同時，與MPPα-PDT組比較，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組中Wnt通路相關蛋白表達均下降，表明有效沉默GRP78后，可抑制MPPα-PDT誘導HOS細胞Wnt通路的激活。

綜上所述，骨肉瘤HOS細胞經過MPPα-PDT處理后，HOS細胞中GRP78表達增高；并且沉默GRP78表達后，骨肉瘤HOS細胞增殖活性下降、凋亡水平上調；同時，沉默GRP78表達可抑制MPPα-PDT誘導下的骨肉瘤Wnt通路激活，提示沉默GRP78增加骨肉瘤HOS細胞對MPPα-PDT的敏感性可能與抑制Wnt通路激活相關，這為沉默GRP78靶點聯合MPPα-PDT治療骨肉瘤提供了一定的實驗依據。