陳綿雄,林 慧,張菊云,劉婷婷

(中南大學(xué)湘雅附屬海口醫(yī)院/?？谑腥嗣襻t(yī)院,內(nèi)分泌科 ?？?570208)

糖尿病腎病的主要特征表現(xiàn)為微血管系統(tǒng)的損傷和功能障礙,調(diào)控微血管系統(tǒng)的關(guān)鍵因素是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-A),它通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和存活影響血管通透性[1]。在糖尿病腎病的動(dòng)物模型中應(yīng)用VEGF-A抗體能明顯預(yù)防蛋白尿和腎小球肥大,證實(shí)抑制VEGF-A可能是糖尿病腎并發(fā)癥的潛在治療靶點(diǎn)[2]。除了維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài),VEGF-A還可以促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移[3]。研究發(fā)現(xiàn):VEGF-A通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的VEGF受體(VEGFR,也稱(chēng)FLT-1),促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移,在糖尿病腎病中發(fā)揮作用[4]。然而,在這些研究中均是在糖尿病腎病發(fā)生之前(即在蛋白尿、腎小球肥大和系膜擴(kuò)張產(chǎn)生之前)抑制VEGF-A,因此,目前尚不清楚該策略是否適用于已經(jīng)發(fā)生糖尿病腎損害的臨床患者。

本研究中,我們觀察VEGF-A抑制劑可溶性FLT-1(sFLT-1;也稱(chēng)可溶性VEGFR-1)對(duì)1型糖尿病合并腎損傷小鼠的腎功能,包括蛋白尿和系膜基質(zhì)擴(kuò)張的治療作用以及對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的調(diào)控,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選用8周齡雌性,SPF級(jí)C57BL/6J小鼠,體重(17.8±1.1)g,共30只,購(gòu)自湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(湘)20180032],飼養(yǎng)于湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(湘)20180025],所有實(shí)驗(yàn)均按照中國(guó)國(guó)家“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”進(jìn)行,全部實(shí)驗(yàn)內(nèi)容遵循3R原則,經(jīng)湖南省湘雅醫(yī)學(xué)院倫理審批通過(guò)(2018HK0347)。小鼠置于單獨(dú)通風(fēng)的籠內(nèi),自由飲水和飲食。

1.1.2 細(xì)胞

HEK293細(xì)胞系和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)ATCC生物公司。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma生物公司;DNA提取試劑盒(Qiagen公司);TRIzol(Invitrogen公司);Tris-EDTA緩沖液、4%甲醛固定液和無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);30%H2O2溶液(北京中杉金橋有限公司);SYBR Green酶(Qiagen公司);pcDNA3.1空載質(zhì)粒(美國(guó)invitrogen公司);PECAM-1(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology);兔抗人Wilms瘤(WT)(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology);兔抗鼠Ⅳ型膠原(英國(guó)Abcam),抗兔-HRP偶聯(lián)二抗(丹麥DAKO生物公司);兔抗鼠纖維連接蛋白fibronectin(1∶2400;美國(guó)Sigma-Aldrich);鼠抗鼠CD68(1∶15;英國(guó)Abcam);鼠抗鼠VCAM-1(1∶1400;美國(guó)BD Pharmingen);鼠抗鼠ICAM-1(1∶200;美國(guó)ATCC);兔抗鼠TNF-α(1∶100;英國(guó)Abcam);兔VSV(1∶250;英國(guó)Abcam)。

倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);5%CO2孵育箱(美國(guó)Thermo Fisher公司);微量孔板分光光度計(jì)(美國(guó)BioTek公司);低溫離心機(jī)(德國(guó)R&D公司);URIT-150Vet小動(dòng)物尿液生化檢測(cè)儀(中國(guó)常州銳品精密儀器有限公司);倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);Leica CM1860組織冷凍切片機(jī)(德國(guó)Leica生物公司);蛋白免疫電泳儀(德國(guó)Bio-Rad生物公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7500)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糖尿病小鼠模型

模型組采用75 mg/kg劑量進(jìn)行腹腔注射鏈脲佐菌素,對(duì)照組注射相同劑量生理鹽水,每隔2 d注射1次,重復(fù)3次構(gòu)建糖尿病小鼠模型。(1)在造模后1周、5周測(cè)定血糖水平,血糖水平穩(wěn)定在15 mmol/L或更高的小鼠被認(rèn)為是糖尿病造模成功。將所有造模成功的小鼠隨機(jī)分為六組:5周:健康對(duì)照組(n=5)、糖尿病組(n=5);15周:健康對(duì)照組(n=5)、糖尿病組(n=5),對(duì)照+sFLT-1治療組(n=5),糖尿病+sFLT-1治療組(n=5)。(2)造模后第5周處死一部分動(dòng)物,獲取腎組織及血清標(biāo)本。(3)確認(rèn)小鼠在5周內(nèi)出現(xiàn)腎損傷后在造模后第6周,將sFLT-1質(zhì)粒通過(guò)尾靜脈注射方式轉(zhuǎn)染剩下的小鼠。(4)同時(shí)間隔2周后通過(guò)小鼠腹腔注射熒光素檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。(5)糖尿病建模后15周處死剩下所有小鼠,獲取相應(yīng)腎和血清標(biāo)本進(jìn)行分析。(6)分別于第5周和第15周采集點(diǎn)狀尿液分析尿蛋白排泄率。

1.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

以pcDNA3.1為載體構(gòu)建包含小鼠sFLT-1-VSV以及熒光素酶基因的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增,經(jīng)純化后溶解在Tris-EDTA緩沖液中。在造模后第6周,將sFLT-1-vsv和熒光素酶的表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染到小鼠的兩條小腿肌肉中(各20μg)。為了監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率,注射sFLT-1-vsv和熒光素酶的表達(dá)質(zhì)粒操作的2周后通過(guò)腹腔注射熒光素,生物熒光相機(jī)觀察熒光素酶活性,質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 pcDNA3.1(-)空載質(zhì)粒圖譜(Invitrogen,Carlsbad,CA)Figure 1 pcDNA3.1(-)empty plasmid mapping

1.3.3 血管形成實(shí)驗(yàn)

進(jìn)一步通過(guò)血管形成實(shí)驗(yàn),明確sFLT-1對(duì)血管結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)接種在Matrigel涂層的96孔板上。通過(guò)脂質(zhì)體Lipo3000在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sFLT-1質(zhì)粒和熒光素酶的表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染2 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6 h。同時(shí)向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入或不加入VEGF-A(10 ng/mL)。計(jì)數(shù)5個(gè)400倍視野內(nèi)的管狀分支數(shù)目。使用Moticam相機(jī)進(jìn)行圖像拍攝。

1.3.4 尿白蛋白排泄率測(cè)定

分別于采集建模后的第5周健康對(duì)照組(n=5)、糖尿病組(n=5)和第15周的健康對(duì)照組(n=5)、糖尿病組(n=5)以及sFLT-1治療組(n=5)小鼠的點(diǎn)狀尿液,用兔抗小鼠白蛋白免疫電泳法測(cè)定尿白蛋白含量,以純化的小鼠血清白蛋白作為對(duì)照。同時(shí)測(cè)定尿肌酐水平,計(jì)算尿液中的白蛋白/肌酐比值。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色

分別獲取糖尿病組(n=5)及sFLT-1治療組(n=5)小鼠的腎組織,進(jìn)行石蠟包埋處理后切成4μm的薄片。采用兔抗鼠血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(PECAM-11∶400)、兔抗人Wilms瘤(WT)(1∶500)和兔抗鼠Ⅳ型膠原(1∶200)抗體進(jìn)行免疫組化染色,隨后使用抗兔-HRP偶聯(lián)二抗(未稀釋;DAKO)進(jìn)行二抗染色。此外,分別獲取糖尿病組(n=5)及sFLT-1治療組(n=5)小鼠的冰凍腎組織切成4μm薄片。兔抗鼠纖維連接蛋白fibronectin、鼠抗鼠CD68、鼠抗鼠VCAM-1、鼠抗鼠ICAM-1、兔抗鼠TNF-α和兔VSV進(jìn)行染色。

1.3.6 血管內(nèi)皮細(xì)胞活性檢測(cè)

HUVECs細(xì)胞中加入VEGF-A(20 ng/mL)孵育2、4、6、8 h后,加入sFLT-1(0、10、100、1000 ng/mL)孵育4 h,觀察sFLT-1對(duì)VEGF-A誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響。采用TRIzol從HUVECs中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。涉及到的目的基因引物序列根據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)Primerbank設(shè)計(jì)(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)如下:HPRT1:正向:5’-AGATGGTCAAGGTCGCAAGC-3’; 反 向:5’-TCAAGGGCATATCCTACAAAAC-3’;ICAM-1:正向:5’-CAGAGGTTGAACCCCACAGT-3’;反 向:5’-CCTC TGGCTTCGTCAGAATC-3’;SELEE:正向:5’-AGCCCAGAGCCTTCAGTGTA-3’;反 向: 5’-AACTGGGATTTGCTGTGTCC-3’。引物合成委托由生工生物有限公司進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用單因素方差分析(ANOVA)分析進(jìn)行組間比較,P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外轉(zhuǎn)染sFLT-1可減少血管的形成

通過(guò)血管形成實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn):在培養(yǎng)基中添加VEGFA后可導(dǎo)致血管形成增加(圖2),血管分支點(diǎn)的數(shù)量顯著增加;而從轉(zhuǎn)染sFLT-1質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞獲得的培養(yǎng)基可顯著抑制VEGF-A誘導(dǎo)的管形成,提示sFLT-1能夠抑制了VEGF-A誘導(dǎo)的血管形成。

圖2 體外孵育sFLT-1可抑制VEGF誘導(dǎo)的微血管形成Note.Number of vascular branching points was counted after incubation of human umbilical vein endothelial cells in medium supplemented with VEGF-A(10 ng/mL)or sFLT-1.Compared with control group,*P＜0.05,n=5.Figure 2 Incubation of sFLT-1 in vitro inhibits VEGF-induced microvessel formation

2.2 轉(zhuǎn)染sFlt質(zhì)粒后能明顯緩解糖尿病小鼠的腎損傷

測(cè)定糖尿病建模5周后小鼠腎損傷情況,發(fā)現(xiàn):糖尿病組小鼠腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張的兩個(gè)標(biāo)志物--IV型膠原和纖維連接蛋白的蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P＜0.001)(圖3A)。糖尿病模型組小鼠會(huì)表現(xiàn)出明顯的蛋白尿,白蛋白/肌酐比值(ACR)為(8.53±2.59)mg/mmol,顯著高于對(duì)照組(3.06±0.98)mg/mmol,P＜0.001。并且糖尿病模型組小鼠出現(xiàn)腎小球肥大(P＜0.001)(圖3B)。糖尿病小鼠和對(duì)照組小鼠的足細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有差異。

確認(rèn)小鼠在5周內(nèi)出現(xiàn)腎損傷后,我們?cè)诘?周進(jìn)行sFLT-1轉(zhuǎn)染,并在轉(zhuǎn)染后9周對(duì)小鼠進(jìn)行分析(即糖尿病建模后15周)。發(fā)現(xiàn):sFLT-1可以顯著降低了糖尿病小鼠腎損害的所有指標(biāo),包括蛋白尿、腎小球肥大和系膜基質(zhì)擴(kuò)張(P＜0.05)(圖3)。與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染sFLT-1后的糖尿病小鼠足細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)。并且與第5周的糖尿病小鼠相比,尿蛋白水平和IV型膠原表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),證實(shí)轉(zhuǎn)染sFLT-1可以逆轉(zhuǎn)腎功能的損害。

2.3 轉(zhuǎn)染sFLT-1可降低糖尿病小鼠的內(nèi)皮激活和炎癥反應(yīng)

與對(duì)照組相比,糖尿病小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞活化明顯增強(qiáng),表現(xiàn)為VCAM-1,ICAM-1和PECAM-1表達(dá)水平升高(P＜0.05)(圖4)。并且TNF-α水平增加(P＜0.05),腎小球巨噬細(xì)胞數(shù)增加(P＜0.05)。在第15周,糖尿病組小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞激活的三個(gè)標(biāo)記物仍然增加明顯(P＜0.05)。15周時(shí),糖尿病組腎小球巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多,腎小球TNF-α水平升高,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染能顯著降低了糖尿病小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞激活和炎癥相關(guān)指標(biāo)(P＜0.05)。與第5周糖尿病小鼠相比,第15周轉(zhuǎn)染sFLT-1的糖尿病小鼠ICAM-1和PECAM-1水平顯著降低(P＜0.05)。

圖4 sFLT-1可降低糖尿病小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞活化、腎小球巨噬細(xì)胞數(shù)和腎小球炎癥Note.Vascular cell adhesion molecule-1,intercellular adhesion molecule-1,vascular endothelial cell adhesion molecule-1,tumor necrosis factor-α,and glomerular macrophage count at weeks 5 and 15 after diabetic modeling.Compared with control group,*P＜0.05,n=5.Figure 4 sFLT-1 reduces glomerular endothelial cell activation,glomerular macrophage count,and glomerular inflammation in diabetic mice

2.4 sFLT-1以劑量依賴(lài)的方式降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞激活

我們進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中研究lllt-1對(duì)VEGFA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與20 ng/mL的VEGF-A共孵育后,E-選擇素(SELE)和VCAM-1編碼基因的表達(dá)顯著增加,SELEE和VCAM-1的RNA水平分別在刺激后6 h和4 h達(dá)到峰值(圖5)。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的sFLT-1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響,發(fā)現(xiàn)sFLT-1以劑量依賴(lài)的方式顯著降低了VEGF-A誘導(dǎo)的VCAM-1的上調(diào)(P＜0.001),但對(duì)VEGF-A誘導(dǎo)的SELE上調(diào)無(wú)明顯影響。

圖5 體外實(shí)驗(yàn)中sFLT-1以劑量依賴(lài)的方式降低VEGF-A誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化Note.Expression of SELE and VCAM-1 genes at the mRNA level was determined.HUVECs cells were simultaneously incubated with VEGF-A at a concentration of 20 ng/ml and sFLT-1 at concentrations of 10,100,and 1000 ng/mL for 4 h.SELEE and VCAM-1 expression at the mRNA level was measured.C,Cells untreated with VEGF-A or sFlt-1.V,Cells stimulated with VEGF-A but not sFlt-1-treated cells.Compared with control group,*P＜0.05,n=5.Figure 5 In vitro experiments in which sFLT-1 reduced VEGFA-induced endothelial cell activation in a dose-dependent manner

3 討論

在本研究中,我們證實(shí)在糖尿病小鼠中轉(zhuǎn)染sFLT-1質(zhì)粒能夠顯著改善腎功能及蛋白尿、肌酐水平和系膜基質(zhì)含量來(lái)逆轉(zhuǎn)高血糖造成的腎損害。同時(shí)sFLT-1可以降低腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α蛋白水平,抑制炎癥反應(yīng)和VEGF-A誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活。

糖尿病腎病動(dòng)物模型腎小球VEGF-A水平升高,在糖尿病動(dòng)物模型中抑制VEGF-A可以預(yù)防蛋白尿、腎小球肥大和足細(xì)胞丟失[5-6]。有研究報(bào)道,在足細(xì)胞中過(guò)表達(dá)sFLT-1可以減少糖尿病小鼠的系膜擴(kuò)張和腎小球基底膜增厚,但該項(xiàng)研究沒(méi)有闡明全身性應(yīng)用sFLT-1對(duì)糖尿病腎病的治療效果[5-6]。相反,其他研究發(fā)現(xiàn):抗VEGF-A治療對(duì)早期腎病理沒(méi)有作用[7-8],但糖尿病小鼠足細(xì)胞特異性VEGF-A基因缺失會(huì)導(dǎo)致蛋白尿增加和腎損傷[9]。此外,另一項(xiàng)研究報(bào)道用sFLT-1治療糖尿病小鼠可以減少蛋白尿,但它并沒(méi)有減少腎小球基質(zhì)沉積,并導(dǎo)致腎小管損傷增加[10]。這些相互矛盾的結(jié)果可能是多種因素造成的,包括開(kāi)始治療的時(shí)間,以及使用的抗VEGF-A治療的劑量和類(lèi)型所導(dǎo)致的。并且以上研究集中于糖尿病引起的腎損害的預(yù)防而不是治療,因此,很難估計(jì)這些治療對(duì)已經(jīng)出現(xiàn)腎損害的糖尿病患者的效果。因此,我們研究了VEGF-A抑制劑sFLT-1對(duì)糖尿病小鼠腎損害(包括蛋白尿和系膜基質(zhì)堆積)的治療效果。發(fā)現(xiàn),盡管轉(zhuǎn)染sFLT-1不能使糖尿病小鼠的血糖水平恢復(fù)正常,但可以逆轉(zhuǎn)腎損害,體現(xiàn)為蛋白尿和系膜基質(zhì)沉積減少了。

此外,我們還發(fā)現(xiàn)與VEGF-A共同孵育HUVECs可增加內(nèi)皮細(xì)胞的激活,而用sFLT-1處理HUVECs可逆轉(zhuǎn)這一作用。并且轉(zhuǎn)染sFLT-1可以使糖尿病小鼠腎小球巨噬細(xì)胞數(shù)量和腫瘤壞死因子-α水平正常化。綜上所述,這些發(fā)現(xiàn)提示VEGFA抑制劑sFLT-1減少了內(nèi)皮激活和隨后的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。據(jù)報(bào)道,使用sFLT-1也可以應(yīng)用于其他炎癥相關(guān)疾病的治療,包括關(guān)節(jié)炎、血管疾病、膿毒癥和牛皮癬,表現(xiàn)為sFLT-1可以減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和數(shù)量[11-14]。因此目前的結(jié)果表明,sFLT-1可能是治療糖尿病腎病以及炎癥疾病的一種有價(jià)值的治療方法。

綜上所述,我們研究證實(shí):以sFLT-1作為干預(yù)藥物拮抗糖尿病小鼠體內(nèi)VEGF-A水平的異常升高,可以減少內(nèi)皮激活、腎小球巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小球炎癥,從而逆轉(zhuǎn)腎損害,可能成為未來(lái)糖尿病腎病患者的可行方案。