曹 娟,王士杰,畢見(jiàn)龍

(北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院急診科,北京 102206)

一氧化碳(carbon monoxide,CO)中毒是臨床上常見(jiàn)的吸入性中毒事件之一[1]。CO中毒的致病機(jī)理是CO與血紅蛋白結(jié)合,形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin,HbCO),使血紅蛋白無(wú)法結(jié)合氧分子,造成組織缺氧[2]。機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)吸入過(guò)量CO可致急性重癥CO中毒(acute carbon monoxide poisoning,ACOP),引起組織細(xì)胞損傷,其中對(duì)腦組織細(xì)胞的損害最嚴(yán)重[3]。它能引起多種嚴(yán)重并發(fā)癥,尤其是急性腦損傷和遲發(fā)性腦病[4]。

絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化、死亡等各個(gè)階段的生理活動(dòng),對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體生理病理反應(yīng)過(guò)程中起著重要作用[5]。其中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular siganl-regulated kinase,ERK)信號(hào)通路涉及生長(zhǎng)和分化中不同受體的激活,參與細(xì)胞的增殖、分化、形態(tài)維持、骨架構(gòu)建、細(xì)胞凋亡和癌變等多種生化反應(yīng)[6-7]。然而,在已經(jīng)不需要增殖和分化的成熟神經(jīng)元細(xì)胞中仍有大量的ERK上游調(diào)控子和下游靶蛋白的存在,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),ERK與哺乳動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程有著緊密關(guān)系[8]。

白皮杉醇(piceatannol,PIC)也稱(chēng)比杉特醇,是一種多酚類(lèi)化合物,化學(xué)名為3,3’,4,5’-四羥基反式二丙乙烯,分子式為C14H12O4。PIC主要存在于葡萄、甘蔗、大黃、藍(lán)莓及百香果等植物中[9]。PIC具有抗炎、抗氧化活性,清除自由基的作用[10]。根據(jù)已有研究報(bào)道[11],PIC可抑制腦細(xì)胞凋亡發(fā)揮對(duì)缺血缺氧性腦組織損傷大鼠大腦具有保護(hù)作用。本研究旨在通過(guò)MAPK信號(hào)通路揭示PIC對(duì)一氧化碳中毒大鼠腦損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠100只,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011],45周齡,體重為(220±20)g,飼養(yǎng)于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(京)2016-0044],飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng),飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25±2)℃,濕度(50±10)%,12 h晝夜周期。正常飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境,第2周開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn),使用大鼠時(shí)嚴(yán)格按照3R原則給予人道關(guān)懷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照本院動(dòng)物管理委員會(huì)(IACUC2018001)的規(guī)定執(zhí)行,并已通過(guò)北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理與管理委員會(huì)審批(20190508001)。

1.2 主要試劑與儀器

PIC購(gòu)自梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(批號(hào):10083-24-6);ERK1/2通路抑制劑(500μmol/L)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;HE染色試劑盒和TUNEL染色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司;ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;Western blot試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

處理箱(訂制90 L容積的亞克力材質(zhì)密封箱體,箱側(cè)壁存在可密封的進(jìn)氣口和出氣口,箱內(nèi)裝有CO檢測(cè)儀);99.99%CO氣體購(gòu)自西南化工研究所;血?dú)夥治鰞x購(gòu)自德國(guó)拜耳公司;Morris水迷宮及分析跟蹤系統(tǒng)由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供;線粒體提取試劑盒及膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solatbio Sciences&Technology有限公司;光學(xué)顯微鏡;透射電子顯微鏡(日產(chǎn)JEM-1230)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及急性CO中毒動(dòng)物模型制備

飼養(yǎng)的第8天,將100只大鼠隨機(jī)分為四組:空白對(duì)照組(NC組)、ACOP模型組(CO組)、ACOP模型采用PIC處理組(PIC組)和ACOP模型采用PIC和ERK抑制劑同時(shí)處理組(PIC+ERK組),每組各25只。除NC組外,其余各組大鼠根據(jù)文獻(xiàn)[3]描述制備ACOP大鼠模型。將大鼠置于90 L的處理箱中,持續(xù)吸入濃度為1000 ppm的CO氣體20 min,CO濃度升高至2000 ppm,持續(xù)吸入20 min,隨后CO氣體濃度升高至3000 ppm,大鼠在箱中持續(xù)吸入氣體20 min后,轉(zhuǎn)移至箱外呼吸空氣。NC組大鼠在處理箱中持續(xù)吸入空氣60 min。制模過(guò)程中觀察大鼠的行為狀態(tài),出箱后立即從大鼠左側(cè)股動(dòng)脈抽取0.3 mL的全血,使用血?dú)夥治鰞x采用微量定量法檢測(cè)血液中碳氧血紅蛋白濃度(COHb%)。

1.3.2 給藥方法

制備模型后,NC組與CO組大鼠正常飼養(yǎng);PIC組大鼠給予200 mg/kg PIC灌胃,灌胃劑量2 mL,每天1次,共33 d;PIC+ERK組大鼠給予200 mg/kg PIC和0.2 mg/kg ERK抑制劑灌胃,灌胃劑量2 mL,每天1次,共33 d;NC組與CO組灌胃等量生理鹽水。

1.3.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

四組大鼠處理后于第2天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),6 d為一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期,水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行和空間探索兩個(gè)階段[12-14]。定位航行實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5次,每次5 d,每天訓(xùn)練4次;每次更換入水點(diǎn),大鼠找到平臺(tái)后或120 s內(nèi)找不到平臺(tái),拿上平臺(tái),休息15 s后進(jìn)行下一次訓(xùn)練,記錄四組大鼠逃避潛伏期,計(jì)算每組大鼠每次實(shí)驗(yàn)得到逃避潛伏期的平均值?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 d進(jìn)行,撤去原平臺(tái),所有大鼠從同一入水點(diǎn)放入水中,記錄大鼠在120 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)。逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)取一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)得到的平均值。

1.3.4 腦組織標(biāo)本制備

制備模型后33 d,四組大鼠進(jìn)行完空間探索實(shí)驗(yàn)后,每組大鼠隨機(jī)取10只,其中每組5只用4%苯巴比妥鈉深度麻醉后,從左心室灌注200 mL的生理鹽水和4%多聚甲醛,取腦,放入4%多聚甲醛4℃固定48 h,脫水,石蠟包埋,冠狀位連續(xù)切片,厚度6μm,用于HE染色和TUNEL染色。剩余大鼠取腦,冰面上分離海馬區(qū),-80℃保存,用于線粒體的提取、神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察、ROS含量檢測(cè)、Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 HE染色檢測(cè)大鼠腦組織形態(tài)

將四組大鼠腦組織石蠟切片依次脫蠟,水化,經(jīng)蘇木素-伊紅染色,脫水,二甲苯透明,干燥,中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)并拍攝照片。

1.3.6 TUNEL染色檢測(cè)大腦細(xì)胞凋亡

將四組大鼠腦組織石蠟切片脫臘至水,加入蛋白酶K工作液,37℃孵育20 min,加入Tunel反應(yīng)液濕盒37℃避光孵育1 h,PBS洗滌,DAB顯色10 min,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,中性樹(shù)脂封片。每張切片隨機(jī)選取互不重疊的3個(gè)視野,于400倍鏡下通過(guò)Lasersharp 2000軟件進(jìn)行圖像采集,顆粒狀綠色深染的細(xì)胞為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞,觀察并記錄圖片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3.7 離體神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察

取四組大鼠海馬區(qū)齒狀回平面切組織塊樣本,放入4%的戊二醛溶液中固定,環(huán)氧乙烷處理,環(huán)氧樹(shù)脂包埋,包埋的組織樣本進(jìn)行超薄切片,枸櫞酸鉛染液染色,水洗,通過(guò)透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察切片并拍攝照片。

1.3.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位

用線粒體提取液分離并純化線粒體,然后添加5倍稀釋的JC-1染料工作液,陰性對(duì)照切片以PBS代替熒光染料。線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的變化采用流式細(xì)胞儀的cflowfplus軟件分析系統(tǒng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次,取每組所有樣本MMP相對(duì)值的平均值,用平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)表示。

1.3.9 活性氧試劑盒檢測(cè)四組大鼠ROS水平

取500 g腦組織的細(xì)胞勻漿液,12000 r/min離心30 min,棄上清液,加入10μmol/L的DCFH-DA,移液槍吹打混勻,使細(xì)胞懸浮于DCFH-DA中,在37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min,每3 min顛倒混勻,使試劑與細(xì)胞完全接觸,無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次后懸浮于PBS溶液中,使用流式細(xì)胞儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng),525 nm處檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度。

1.3.10 Western blot分析Nrf-2及Bcl-2蛋白表達(dá)

將海馬區(qū)稱(chēng)重后加入7 mL/g腦組織的裂解液制備腦組織勻漿液,在4℃下1200 r/min離心30 min,置于冰上裂解30 min,取上清液,采用二喹啉甲酸(bicinchonininc acid,BCA)法進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),加入樣品得到1X蛋白上樣緩沖液,混勻,95℃下變性10 min。按Western blot法[9]檢測(cè)Nrf-2、Bcl-2蛋白表達(dá)水平,加入待測(cè)樣品進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉1 h,按照抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行一抗孵育過(guò)夜,加入二抗顯色,成像。采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析,每一條蛋白條帶以自身β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行灰度校正。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Graphpad 5.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),定量數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差性檢驗(yàn),逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析,海馬區(qū)Nrf-2、Bcl-2的表達(dá)采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,兩兩比較采用LSD法,P＜0.05表示差異顯著,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠急性CO中毒模型制備后行為表現(xiàn)及血液COHb%檢測(cè)結(jié)果

處理箱內(nèi)CO濃度為2000 ppm條件下,CO組、PIC組和PIC+ERK組大鼠在5~15 min內(nèi)表現(xiàn)為興奮躁動(dòng),15 min后表現(xiàn)為呼吸急促。CO濃度升高至3000 ppm后,大鼠出現(xiàn)四肢抽搐,大小便失禁,口、鼻、耳、四肢及尾部皮膚呈現(xiàn)櫻桃紅色,隨后四肢無(wú)力甚至昏迷。昏迷大鼠出箱后吸入空氣,逐漸恢復(fù)活動(dòng),制模過(guò)程無(wú)大鼠退出實(shí)驗(yàn)。處理后,CO組、PIC組和PIC+ERK組大鼠血液中COHb%均大于40%,NC組大鼠無(wú)上述表現(xiàn),血液中COHb%小于5%,表明ACOP大鼠模型制備成功,四組大鼠COHb%的比較見(jiàn)圖1。

圖1 四組大鼠血液中COHb%比較(n=25)Figure 1 Comparison of COHb% in blood among four groups of rats

2.2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察比較

處理后1~6 d Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性差異;處理后14~33 d,隨著病程延長(zhǎng),CO組和PIC+ERK組平均逃避潛伏期逐漸延長(zhǎng),穿越平臺(tái)次數(shù)逐漸減少,與NC組比較有顯著差異(P＜0.001)。處理后14~33 d,PIC組與同期CO組和PIC+ERK組比較,平均逃避潛伏期縮短,跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增多(P＜0.001),與NC組比較,21~28 d定位航行實(shí)驗(yàn)差異顯著(P＜0.05),空間探索實(shí)驗(yàn)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 四組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(n=25)Table 1 Statistics results of the place navigation experiments among four groups of rats

表2 四組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(n=25)Table 2 Statistics results of the spatial probe experiments among four groups of rats

2.3 PIC對(duì)大鼠腦組織形態(tài)的影響

四組大鼠海馬區(qū)腦組織HE染色觀察結(jié)果如下:NC組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;CO組細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松;PIC組結(jié)構(gòu)較緊密;PIC+ERK組細(xì)胞形態(tài)與CO組相近。PIC處理后,PIC組大鼠的腦組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的病理性變化(見(jiàn)圖2)。

圖2 四組大鼠腦組織HE染色形態(tài)觀察結(jié)果(n=25)Note.A,NC group.B,CO group.C,PIC group.D,PIC+ERK group.The same as below.Figure 2 Results of HE staining in brain tissues among four groups of rats

2.4 大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察比較

四組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果(見(jiàn)圖3):NC組,大鼠腦組織的海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞輪廓清晰,染色質(zhì)均勻分布,胞質(zhì)清晰,雙層細(xì)胞核膜清晰完整,胞漿內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)完整,數(shù)量較多,未出現(xiàn)空泡。CO組和PIC+ERK組細(xì)胞核出現(xiàn)固縮,線粒體腫脹,嵴斷裂或者變少,甚至細(xì)胞水腫出現(xiàn)空泡化。PIC組細(xì)胞輪廓較為清晰,染色質(zhì)均一,線粒體形態(tài)規(guī)則。

圖3 四組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察Figure 3 Observation of ultra-structure of neuron among four groups of rats

2.5 四組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL染色結(jié)果見(jiàn)圖4,NC組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少,而CO組和PIC+ERK組有大量綠染TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞,PIC組有少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。四組陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表,CO組和PIC+ERK組顯著高于NC組和PIC組(P＜0.001)。

圖4 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況(n=25)Note.A,Representative images from four groups of rats.B,Comparison of apoptotic cell among four groups of rats.Compared with NC group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with CO group and PIC+ERK group,###P＜0.001.Figure 4 TUNEL staining in brain of rats

2.6 四組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位改變

NC組大鼠腦組織海馬區(qū)中MFI值維持較高水平,表明其神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能完整。CO組和PIC+ERK組大鼠MFI值顯著低于NC組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001),說(shuō)明CO組和PIC+ERK組大鼠對(duì)的神經(jīng)細(xì)胞中線粒體損傷嚴(yán)重。PIC組大鼠MFI值較CO組和PIC+ERK組高,且差異顯著(P＜0.001),低于NC組,表明經(jīng)過(guò)PIC對(duì)CO中毒后大鼠的神經(jīng)細(xì)胞有一定程度的保護(hù)作用。見(jiàn)圖5。

圖5 四組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞MFI值比較(n=25)Note.Compared with NC group,***P＜0.001.Compared with CO group and PIC+ERK group,###P＜0.001.Figure 5 Comparison of MFI value in neuron among four groups of rats

2.7 四組大鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)檢測(cè)

與NC組比較,CO組和PIC+ERK組海馬區(qū)ROS含量明顯升高,差異顯著(P＜0.01)。PIC+ERK組的ROS含量與CO組接近,差異不顯著(P＞0.05)。PIC組與CO組和PIC+ERK組比較,ROS含量下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)圖6。

圖6 四組大鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激損傷(n=25)Note.A,Fluorescence detecting results of ROS.B,Comparison of DCF-positive cells to show ROS level in hippocampus among four groups of rats.Compared with NC group,**P＜0.01.Compared with CO group and PIC+ERK group,##P＜0.01.Figure 6 Oxidative stress level detection in hippocampus among four groups of rats

2.8 Nrf-2及Bcl-2蛋白在大鼠腦組織海馬區(qū)中的表達(dá)變化

Western blot結(jié)果顯示,Nrf-2、Bcl-2蛋白的表達(dá)在四組大鼠間無(wú)顯著差異(P＞0.05),PIC組相對(duì)于NC組、CO組、PIC+ERK組,大鼠腦組織海馬區(qū)中Nrf-2、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平上升。見(jiàn)圖7。

3 討論

ACOP主要是由組織持續(xù)缺氧引發(fā)的[15]。在哺乳動(dòng)物的各器官系統(tǒng)中,以腦神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)缺氧最為敏感,缺血缺氧都易造成腦損傷甚至細(xì)胞死亡,從而引起機(jī)體出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶機(jī)能減退等表現(xiàn)[16]。ACOP造成腦損傷,致死率高,治療難度大[17]。目前常用的的治療手段是高壓氧治療,能有效改善急性期中毒患者組織缺氧的情況,減輕中毒癥狀。但是該療法對(duì)重癥患者和遲發(fā)性腦病患者的治療效果有限[3]。尋找新的治療手段是目前相關(guān)學(xué)者研究的重點(diǎn)。已有研究認(rèn)為急性CO中毒引起腦損傷的機(jī)制有:(1)血液和組織的缺氧性損傷及隨之產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)[4,17-18];(2)神經(jīng)炎癥反應(yīng)[15];(3)線粒體介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]。而腦組織中海馬區(qū)參與機(jī)體的學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程,對(duì)空間定位起到了重要作用,并且對(duì)于組織缺氧造成的損傷十分敏感。已有研究表明,PIC對(duì)于治療神經(jīng)細(xì)胞損傷有一定療效[11]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是國(guó)內(nèi)外常用的檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的實(shí)驗(yàn)[14]。

本研究對(duì)CO組、PIC組和PIC+ERK組大鼠制備ACOP模型,結(jié)果顯示三組大鼠血液中COHb%均＞40%,明顯高于NC組大鼠,說(shuō)明大鼠ACOP模型制備成功。隨后進(jìn)行5次Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CO的毒性對(duì)于大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)PIC治療14~33 d,PIC組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)的平均逃避潛伏期明顯低于CO組大鼠(P＜0.05),與NC組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);空間探索實(shí)驗(yàn)中PIC組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)明顯高于CO組大鼠(P＜0.05),與NC組無(wú)顯著差異(P＞0.05),表明經(jīng)過(guò)PIC處理的大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力較未用藥物處理的模型大鼠有明顯恢復(fù)。王鯤宇等[17]研究結(jié)果顯示進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)CO中毒的模型組大鼠的逃避潛伏期較干預(yù)組和對(duì)照組明顯延長(zhǎng),本研究結(jié)果與之相符。在行為實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束后,對(duì)四組大鼠的腦組織細(xì)胞形態(tài)、凋亡情況等進(jìn)行觀察,比較不同處理的大鼠腦組織細(xì)胞的生理結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果顯示PIC處理的大鼠,腦細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相近,無(wú)明顯的病理結(jié)構(gòu)變化,凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯少于CO組大鼠(P＜0.05),說(shuō)明PIC對(duì)急性CO中毒大鼠的腦損傷情況起到了保護(hù)作用。本研究將進(jìn)一步探討PIC對(duì)于由CO中毒引起的腦損傷的保護(hù)機(jī)制。

線粒體膜在細(xì)胞凋亡的起始過(guò)程中起到重要作用[3,19]。線粒體膜電位的降低導(dǎo)致膜孔道的開(kāi)放,使內(nèi)膜及外模的離子對(duì)流,造成呼吸鏈異常,進(jìn)而使得線粒體功能受損[16]。線粒體功能障礙使得細(xì)胞中氧自由基增多,ROS含量增加,形成氧自由基連鎖反應(yīng),破壞生物膜及其功能,造成細(xì)胞損傷及凋亡[19]。線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在氧化應(yīng)激的生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究對(duì)四組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察與線粒體膜電位的檢測(cè),可以看出未經(jīng)藥物處理的模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞,CO組大鼠與NC組比較,線粒體膜電位明顯下降,細(xì)胞中ROS含量顯著增加(P＜0.05),該結(jié)果與已有研究一致[3]。而采用PIC灌胃處理的大鼠,線粒體結(jié)構(gòu)較為完整,與CO組比較,MMP下降程度低,對(duì)線粒體功能影響較小,細(xì)胞中ROS含量較低(P＜0.05),說(shuō)明PIC可能對(duì)于CO造成的線粒體結(jié)構(gòu)損傷起到了保護(hù)作用。

Bcl-2蛋白是目前最受關(guān)注的凋亡相關(guān)蛋白,分布于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜孔周?chē)鶾16,20]。已有研究報(bào)道,細(xì)胞受損情況與細(xì)胞中ERK通路的激活情況相關(guān),通過(guò)激活ERK信號(hào)通路,能誘發(fā)下游細(xì)胞信號(hào)分子Bcl-2的表達(dá),從而抑制細(xì)胞凋亡[5]。PIC抑制細(xì)胞凋亡,減輕腦損傷與MAPK/ERK信號(hào)通路有關(guān)[10]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明,激活ERK信號(hào)通路可以上調(diào)Nrf-2蛋白的表達(dá)[20-22]。根據(jù)研究報(bào)道,CO中毒后,人為誘導(dǎo)Nrf-2過(guò)表達(dá)能發(fā)揮其抗氧化機(jī)制[3]。Nrf-2能被多種外源物質(zhì)誘導(dǎo),是常用抗氧化應(yīng)激治療的靶向位點(diǎn)。PIC已被證明通過(guò)上調(diào)Nrf-2蛋白的表達(dá)水平有助于緩解細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),對(duì)組織損傷起到保護(hù)作用[9,23]。在本研究中,與CO組大鼠相比,PIC處理的大鼠Nrf-2和Bcl-2的表達(dá)量增加(P＜0.05),同時(shí)采用PIC和ERK抑制劑處理模型大鼠相較于NC組大鼠,其學(xué)習(xí)記憶能力下降明顯,腦組織細(xì)胞形態(tài)異常,神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目較多,超微結(jié)構(gòu)受到損害,MMP值顯著下降,ROS含量上升,Nrf-2和Bcl-2蛋白的表達(dá)下降(P＜0.05),說(shuō)明PIC可能通過(guò)激活ERK信號(hào)通路,使Nrf-2、Bcl-2蛋白過(guò)表達(dá),來(lái)保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)的完整,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。圖7 Western blot檢測(cè)Nrf-2和Bcl-2蛋白表達(dá)水平(n=25)

圖7 Western blot檢測(cè)Nrf-2和Bcl-2蛋白表達(dá)水平(n=25)Figure 7 Relative expression of Nrf-2 and Bcl-2 protein detected by Western blot in brain tissue among four groups of rats

基于以上結(jié)果推測(cè),PIC可能通過(guò)調(diào)控MAPK/ERK信號(hào)通路,上調(diào)Nrf-2和Bcl-2蛋白的表達(dá),有效保護(hù)了大鼠腦組織,防止急性重癥CO中毒引起的損害。