賀艷琪，遲 銳，陳夢萍，陳 思，劉春良，劉云霞，孫海鵬

1.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，細胞分化與凋亡教育部重點實驗室，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院虹橋國際醫(yī)學(xué)研究院，上海 200050

在世界范圍內(nèi)，肺癌是癌癥患者死亡的主要病因之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心發(fā)布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新發(fā)癌癥病例1 929萬例，其中肺癌病例220萬（我國有82萬）［1］。肺癌從形態(tài)學(xué)上分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）兩大類，其中NSCLC占比80%～85%且患者的5年生存率不足20%［2］。

支鏈氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）是一類R基團含有支鏈的必需氨基酸，包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸3種。在哺乳動物中，BCAA只能通過食物獲取。支鏈酮酸脫氫酶（branched-chain keto acid dehydrogenase，BCKDH）是BCAA分解代謝的限速酶，為一種由多個亞基組成的復(fù)合物，其活性受到亞基支鏈酮酸脫氫酶E1α（branched-chain keto acid dehydrogenase e1，αpolypeptide，BCKDE1α）磷酸化的調(diào)節(jié)。而支鏈酮酸脫氫酶激酶（branched-chain keto acid dehydrogenase kinase，BCKDK）可磷酸化BCKDE1α，降低BCKDH活性，從而抑制BCAA的分解代謝。BCKDK抑制劑——3，6-二氯-2-苯并噻吩羧酸（3，6-dichlorobenzo［b］thiophene-2-carboxylic acid，簡稱BT2）是Tso等［3］發(fā)現(xiàn)的一種靶向BCKDK的新型小分子化合物，其能夠有效下調(diào)BCKDE1α的磷酸化，以促進BCAA的分解代謝［4-5］。

P21又叫P21Waf1/Cip1或CDKN1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A）［6］，是周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent-kinase inhibitor，CKI）家族的成員之一，也是細胞周期的負調(diào)控因子，可通過抑制細胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子——周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）使細胞周期發(fā)生阻滯［7］。

近些年人們發(fā)現(xiàn)，BCAA與一些腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。Mayers等［8］發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者血漿中BCAA水平升高，與未來胰腺癌診斷風(fēng)險增加有關(guān)。Ericksen等［9］發(fā)現(xiàn)BCAA的分解代謝在肝癌中被抑制，且這種抑制狀態(tài)可促進肝腫瘤的形成。Li等［10］發(fā)現(xiàn)在小鼠模型和人類PDAC中BCAA轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高，使得腫瘤細胞對BCAA的攝取增加，從而維持線粒體呼吸。上述研究均提示，在部分腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中BCAA的分解代謝發(fā)揮了一定的作用。然而目前，關(guān)于肺癌和BCAA代謝之間的研究并不多。本研究采用NSCLC細胞株進行體外實驗，探索BCAA分解代謝在肺癌細胞中的功能，以期為肺癌的臨床治療或藥物開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

A549、H1299、HCC827細胞株均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。主要試劑：β-actin抗體（上海泊灣生物科技有限 公 司），磷 酸 化BCKDE1α（P-BCKDE1α）抗 體（Bethyl，美國），BCKDK抗體、BCKDE1α抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國），P21抗體（Cell Signaling Technology，美國），CCK-8試劑盒［東仁化學(xué)科技（上海）有限公司］，臺盼藍染色液（0.4%）（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma，美國），小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、BCKDK的小干擾RNA（small interferingBCKDK，siBCKDK，序列為5′-CUGACUUUGUCGGCAUCAUTT-3′）（由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成），Lipo 2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國），RPMI-1640培養(yǎng)基（上海源培生物科技股份有限公司），BCKDK的小分子抑制劑BT2（Caymanchem，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)

于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基對A549和HCC827細胞進行培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基對H1299細胞進行培養(yǎng)。定期觀察細胞狀態(tài)，每2～3 d進行1次傳代。

1.3 細胞處理及分組

將處于對數(shù)生長期的上述3種細胞按照（1～2）×106的密度種板，設(shè)置3個復(fù)孔。①siRNA轉(zhuǎn)染：待細胞貼壁生長后，按照Lipo 2000說明書操作步驟進行轉(zhuǎn)染和換液。對照組細胞轉(zhuǎn)染無義序列的siNC，處理組細胞轉(zhuǎn)染siBCKDK。待細胞生長48～72 h后，收集細胞和蛋白做后續(xù)實驗。②BT2處理：待細胞貼壁生長后，更換為含0μmol/L BT2、100μmol/L BT2、200μmol/L BT2的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h后收集細胞及蛋白用于后續(xù)檢測。

1.4 BCKDK表達、BCKDE1α及其磷酸化水平檢測

分別收集經(jīng)siNC、siBCKDK轉(zhuǎn)染的H1299、A549、HCC827細胞，于磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中清洗，而后加入細胞裂解液進行充分裂解。收集裂解后的細胞懸液于100℃加熱10 min，再于4℃下12 000×g離心10 min，取上清液即為蛋白樣品。采用BCA試劑盒測定蛋白樣品濃度，具體步驟參見該試劑盒說明書。而后，將其制成含溴酚藍的統(tǒng)一濃度的蛋白樣品，行蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測，具體步驟參照常規(guī)操作，使用抗體包括β-actin抗體、BCKDK抗體、P-BCKDE1α抗體、BCKDE1α抗體。分別收集經(jīng)0μmol/L BT2、100μmol/L BT2、200μmol/L BT2處理的上述3種細胞的蛋白，行Western blotting檢測BCKDE1α及其磷酸化水平，具體檢測步驟同前。

1.5 細胞增殖能力檢測

①將轉(zhuǎn)染siNC、siBCKDK后的H1299、A549、HCC827細胞分別按照2 000個/孔進行種板，設(shè)置5個復(fù)孔進行培養(yǎng)。②將上述3種細胞分別按照2 000個/孔進行種板（設(shè)置5個復(fù)孔），待細胞貼壁生長后，更換為含0μmol/L BT2、200μmol/L BT2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、24、48、72 h向①、②實驗的每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育2 h后檢測吸光度值［D（450 nm）］，并以時間為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。具體步驟參照CCK-8試劑盒說明書進行。

1.6 細胞活率檢測

將H1299、A549細胞按照1×105進行種板，設(shè)置3個復(fù)孔。待細胞貼壁生長后，分別做如下處理：①轉(zhuǎn)染siNC、siBCKDK。②更換為含0μmol/L BT2、200μmol/L BT2的培養(yǎng)基。于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。分別收集上述處理后的細胞，將其制備成1 mL細胞懸液，與0.2%臺盼藍溶液（先用PBS將0.4%臺盼藍溶液按照1∶1稀釋）進行混勻（比例為1∶1）。取20μL細胞混合液輕輕加入計數(shù)板中，用Countstar自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，統(tǒng)計細胞活率并分析作圖。具體步驟參考臺盼藍染料說明書。

1.7 細胞周期不同階段的占比及P21蛋白的檢測

將H1299、A549細胞分別按照4×105個/皿進行種板。待細胞貼壁生長后，分別行如下處理：①轉(zhuǎn)染siNC、siBCKDK。②更換為含0μmol/L BT2、200μmol/L BT2的培養(yǎng)基。于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。分別收集上述細胞并用終濃度為70%的乙醇固定過夜，室溫下采用PI進行避光染色15 min。而后，用流式細胞儀檢測處于細胞周期不同階段的細胞占比，采用FLowJo_v（10.6.2）軟件對細胞周期占比進行擬合作圖，并在GraphPad Prism 8中計算不同階段的細胞占比、繪制柱狀圖。

分別收集經(jīng)siNC、siBCKDK轉(zhuǎn)染的H1299、A549細胞的蛋白，以及經(jīng)0μmol/L BT2、200μmol/L BT2處理的該2種細胞的蛋白，而后行Western blotting檢測P21的表達，具體檢測步驟同前。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有定量資料以x±s表示，組間采用獨立樣本t檢驗進行比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blotting檢測si BCKDK對NSCLC細胞中BCKDK表達及BCKDE1α磷酸化的影響

采用Western blotting檢測經(jīng)siNC、siBCKDK轉(zhuǎn)染后3種NSCLC細胞中BCKDK的表達和BCKDE1α磷酸化水平的變化。結(jié)果（圖1）顯示，與siNC組相比，siBCKDK組BCKDK的水平受到明顯抑制；同時，由BCKDK調(diào)控的BCKDE1α磷酸化水平亦有明顯下調(diào)。

圖1 si BCKDK對NSCLC細胞中BCKDK蛋白表達及BCKDE1α磷酸化水平的影響Fig 1 Effect of si BCKDK on BCKDK protein expression and BCKDE1αphosphorylation in NSCLCcells

2.2 CCK-8法檢測si BCKDK對NSCLC細胞增殖能力的影響

采用CCK-8法檢測經(jīng)siNC、siBCKDK轉(zhuǎn)染后對3種NSCLC細胞的增殖能力的影響。結(jié)果（圖2）顯示，在培養(yǎng)72 h時，與siNC組相比，siBCKDK組的細胞增殖明顯下降（均P=0.000）。

圖2 si BCKDK對NSCLC細胞增殖能力的影響Fig 2 Effect of si BCKDK on proliferation of NSCLCcells

2.3 Western blotting檢測BT2對NSCLC細胞BCKDE1α磷酸化的影響

采用Western blotting法檢測BCKDK小分子抑制劑BT2對3種NSCLC細胞中BCKDE1α磷酸化的影響。結(jié)果（圖3）顯示，在H1299細胞中，相較于0μmol/L BT2組，100μmol/L BT2組、200μmol/L BT2組中BCKDE1α表達水平?jīng)]有變化，但BCKDE1α磷酸化水平有所下調(diào)；在A549細胞、HCC827細胞中，相較于0μmol/L BT2組，100μmol/L BT2組、200μmol/L BT2組中BCKDE1α磷酸化水平亦下調(diào)顯著。

圖3 BT2對NSCLC細胞中BCKDE1α磷酸化水平的影響Fig 3 Effect of BT2 on phosphorylation of BCKDE1αin NSCLCcells

2.4 CCK-8法檢測BT2對NSCLC細胞增殖能力的影響

采用CCK-8法檢測BCKDK小分子抑制劑BT2對3種NSCLC細胞增殖能力的影響。結(jié)果（圖4）顯示，將H1299細胞培養(yǎng)72 h時，200μmol/L BT2組相較于0μmol/L BT2組的細胞增殖能力顯著下降（P=0.000）；在A549細胞、HCC827細胞中，200μmol/L BT2組相較于0μmol/LBT2組的細胞增殖能力亦明顯下降（均P=0.000）。

圖4 BT2對NSCLC細胞增殖能力的影響Fig 4 Effect of BT2 on proliferation of NSCLCcells

2.5 臺盼藍染色檢測siBCKDK或BT2對NSCLC細胞活率的影響

分別采用臺盼藍染色檢測siBCKDK或BT2對NSCLC細胞活率的影響。結(jié)果（圖5）顯示，在H1299細胞中，siBCKDK組相較于siNC組細胞的活率無差異，且200μmol/L BT2組與0μmol/L BT2組的活率間差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義；在A549細胞中，siBCKDK和200μmol/L BT2亦未影響細胞的活率。

圖5 si BCKDK或BT2對NSCLC細胞活率的影響Fig 5 Effects of si BCKDK or BT2 on the survival rate of NSCLC cells

2.6流式細胞術(shù)檢測siBCKDK或BT2對NSCLC細胞周期的影響

采用流式細胞術(shù)檢測經(jīng)0、200μmol/L BT2和siNC、siBCKDK處理后H1299、A549細胞的細胞周期，并計算處于細胞周期不同階段的細胞占比。結(jié)果顯示，在H1299細胞（圖6A、B）和A549細胞（圖6C、D）中，200μmol/L BT2組較0μmol/L BT2組在G0/G1期細胞比例有所上調(diào)，處于S期的細胞比例下降，siBCKDK組較siNC組也出表現(xiàn)相同趨勢。

圖6 si BCKDK或BT2對NSCLC細胞周期的影響Fig 6 Effect of si BCKDK or BT2 on cell cycle of NSCLCcells

2.7 Western blotting檢測siBCKDK或BT2對NSCLC細胞內(nèi)P21水平的影響

采用Western blotting檢測經(jīng)siBCKDK轉(zhuǎn)染或200 μmol/L BT2抑制BCKDK后，BCAA分解代謝加快對NSCLC細胞中P21水平的影響。結(jié)果（圖7）顯示，在H1299細胞中及A549細胞中，siBCKDK組相較于siNC組、200μmol/L BT2組相較于0μmol/L BT2組的P21水平均有所上調(diào)。

圖7 si BCKDK或BT2對NSCLC細胞內(nèi)P21表達水平的影響Fig 7 Effects of si BCKDK or BT2 on expression of P21 in NSCLCcells

3 討論

腫瘤細胞具有無限分裂、增殖的能力，在這一過程中該類細胞需依賴腫瘤微環(huán)境中的必需營養(yǎng)物質(zhì)維持其生物合成和生存發(fā)展［11］。作為必需氨基酸之一，BCAA可參與蛋白質(zhì)的合成和機體能量代謝。近年來，多項研究表明BCAA及其分解代謝過程在結(jié)直腸癌［12］、胰腺導(dǎo)管癌［8］、肝癌［13］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［14］、慢性髓樣白血?。?5］和乳腺癌［16］等的發(fā)生與發(fā)展中扮演著重要的角色。

為探究BCAA的分解代謝在肺癌細胞中的功能，本研究在H1299、A549、HCC827共3種NSCLC細胞中，分析siBCKDK和BT2抑制BCKDK對BCKDH活性的影響以及對細胞增殖活力的影響，并在H1299、A549肺癌細胞中進行siBCKDK和BT2對肺癌細胞增殖影響的機制探索。結(jié)果表明，siBCKDK和BT2均能顯著下調(diào)BCKDE1α磷酸化水平，達到促進BCAA分解代謝的目的；抑制BCKDK不會影響肺癌細胞的活率，但會抑制細胞的增殖；抑制BCKDK可上調(diào)細胞周期負調(diào)控因子P21的表達，導(dǎo)致細胞周期阻滯。上述結(jié)果與在肝癌細胞中BCAA分解代謝受到抑制會促進腫瘤進展的情況相一致［9］。

目前，有關(guān)肺癌和BCAA分解代謝的研究相對較少。Mayers等［8］發(fā)現(xiàn)BCAA在肺癌小鼠血漿中的水平低于正常小鼠；隨后，在肺癌或胰腺癌動物中用同位素追蹤BCAA發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織比正常肺組織吸收了更多的游離BCAA，且NSCLC組織將這些氨基酸結(jié)合到蛋白質(zhì)中，用其來源的氮合成非必需氨基酸和核苷酸。本研究發(fā)現(xiàn)促進BCAA分解代謝可以導(dǎo)致肺癌細胞分裂周期阻滯，進而抑制增殖，但BCAA分解代謝的變化如何影響細胞分裂尚需進行更深入的研究。上述研究提示，BCAA的分解代謝對肺癌的發(fā)生、發(fā)展或可起到重要作用。

大部分研究［17-19］表明，誘導(dǎo)P21的表達能夠抑制腫瘤細胞增殖，而抑制其表達可促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本研究顯示，在促進BCAA分解代謝后，細胞周期阻滯、P21表達增加。Liu等［20］發(fā)現(xiàn)，抑制BCAA分解代謝可下調(diào)P21的表達。該結(jié)果與本研究獲得的結(jié)果相一致，即促進BCAA分解代謝可上調(diào)P21的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)促進肺癌細胞內(nèi)BCAA的分解代謝可明顯抑制肺癌細胞的增殖，使細胞周期發(fā)生阻滯，上調(diào)P21的表達。這些結(jié)果為BCAA在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的功能研究提供了新思路，同時也提示在BCAA的分解代謝通路中BCKDK可能成為一個潛在的治療靶點，即通過抑制BCKDK來促進BCAA的分解代謝，從而干預(yù)肺癌的發(fā)生與發(fā)展。

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