陸艷青，周 興，李 姣，彭建平，王傳東#，張曉玲#

1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西再生醫(yī)學(xué)重點實驗室，南寧 530021；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院骨科，上海200092

原發(fā)性骨腫瘤包括良性腫瘤和惡性腫瘤。良性腫瘤常見骨瘤、骨性骨瘤等，而惡性腫瘤中骨肉瘤尤為常見，多發(fā)生于青少年［1］。臨床上對于惡性骨腫瘤及巨大良性腫瘤的治療方法主要是外科手術(shù)聯(lián)合新輔助化療［2］。而骨腫瘤外科手術(shù)通常力求徹底，以免復(fù)發(fā)或引起惡變。對于術(shù)后巨大骨缺損，臨床工作中雖然可以應(yīng)用不同的技術(shù)來進行骨重建，但常常會導(dǎo)致骨折不連、感染等諸多問題［3-5］。術(shù)后造成較大的骨缺損或骨重建不良仍然是目前骨科臨床面臨的一大挑戰(zhàn)［6-7］。尋找能夠抑制腫瘤細胞并促進干細胞向成骨分化的藥物是解決這一難題的有效策略。

依托泊苷（etoposide，VP-16）是植物成分鬼臼脂素的半合成衍生物，由于其具有廣譜抗癌活性和相當高的治療指數(shù)而應(yīng)用于抗腫瘤治療，于1983年由美國食品藥品監(jiān)督管理局批準上市［4-5］。已有研究［8-10］表明骨腫瘤對依托泊苷高度敏感，臨床上主要通過與大劑量甲氨蝶呤、阿霉素、順鉑和異環(huán)磷酰胺的組合來治療骨肉瘤。

本研究主要探究依托泊苷對間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）和成骨性骨肉瘤細胞UMR-106成骨分化的影響，并進一步通過RNA測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析，篩選出依托泊苷對UMR-106細胞向成骨轉(zhuǎn)分化的作用靶點。本研究旨在為骨腫瘤切除術(shù)后骨缺損或骨重建不良提供可行的新策略及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞 SPF級雌性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2013-0018；小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院動物房，實驗動物使用許可證號為SYXK（滬）2013-0062。大鼠成骨性骨肉瘤細胞UMR-106購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑及儀器 α-MEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清、青霉素-鏈霉素（雙抗）溶液（Gibco，美國），CCK-8試劑盒（同仁化學(xué)，日本），凋亡檢測試劑盒（Invitrogen，美國），BCIP/NBT堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）顯色試劑盒（碧云天，中國），茜素紅染色試劑、抗壞血酸、地塞米松及β-磷酸甘油（Sigma Aldrich，美國），實時熒光定量PCR相關(guān)試劑（TaKaRa，日本），抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（貨號sc-166574）、鼠抗兔二抗抗體（貨號sc-2357）（Santa Cruz，美國），抗矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）抗體（貨號ab76956）、抗成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）抗體（貨號ab209484）、抗DNA結(jié)合抑制因子1（inhibitor of DNA binding 1，ID1）抗體（貨號ab134163）、山羊抗鼠二抗抗體（貨號ab6788）（Abcam，美國）。

實時熒光定量PCR儀（LightCycler?480II，Roche，美國），正置熒光顯微鏡（Zeiss，德國），流式細胞儀（Guava?easyCyteTM，Luminex，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的分離和培養(yǎng)

（1）小鼠MSC的分離和培養(yǎng) 本研究動物實驗操作經(jīng)過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會同意且符合相關(guān)動物實驗倫理要求。將6～8周齡的小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒10 min后，取股骨和脛骨骨髓，沖洗出骨髓腔中細胞，并經(jīng)70μm濾網(wǎng)過濾后置于50 mL離心管，1 000×g離心5 min。取沉淀，加入α-MEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）重懸，接種于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。3 d后首次換液，此后每2 d換液一次，約10 d后細胞鋪滿培養(yǎng)皿；細胞傳至第5代開始用于后續(xù)實驗。

（2）人MSC的分離和培養(yǎng) 人的骨髓液標本收集經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會同意并征得患者的知情同意。采集新華醫(yī)院骨科手術(shù)室股骨頸骨折術(shù)后患者的骨髓液，1 000×g離心5 min后，取沉淀，加入低糖DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）重懸，接種至10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。3 d后首次換液，此后每2 d換液一次，約10 d后細胞鋪滿培養(yǎng)皿；細胞傳至第2代開始用于后續(xù)實驗。

（3）UMR-106細胞的培養(yǎng) UMR-106細胞使用高糖DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）培養(yǎng)，按照1∶5傳代。

1.2.2 MSC體外成骨誘導(dǎo) 將小鼠MSC或人MSC接種至6孔板，待細胞融合至40%后加入成骨誘導(dǎo)液（50μmol/L抗壞血酸、10 mmol/Lβ-磷酸甘油、100 nmol/L地塞米松），此后每3 d更換一次誘導(dǎo)液。

1.2.3 細胞增殖實驗 小鼠MSC接種于96孔板，待細胞貼壁后更換含不同濃度的依托泊苷培養(yǎng)液（采用等倍稀釋法），在37℃、5%CO2條件下孵育12、24、36、48和60 h后吸除培養(yǎng)基，按照CCK-8試劑盒說明書操作，并測量450 nm處的吸光度值［D（450 nm）］。

1.2.4 細胞凋亡檢測 收集不同濃度依托泊苷處理后的UMR-106細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌后按照凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。取5×106/L細胞100μL，加入5μL FITC-Annexin V和1μL 100μg/mL碘化丙啶共孵育15 min后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 細胞ALP活性實驗 將小鼠MSC、人MSC或UMR-106細胞接種于6孔板中，待細胞融合至40%～50%后更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基或普通培養(yǎng)基，按藥物濃度的不同分為0、0.001、0.01、0.1、1μmol/L組，每組設(shè)3個復(fù)孔。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，按照ALP顯色試劑盒說明書進行染色。

1.2.6 細胞基質(zhì)礦化測定 將小鼠MSC、人MSC進行成骨誘導(dǎo)及加藥處理14 d后，去除培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，加5%多聚甲醛固定15 min后，PBS清洗3遍，向每孔細胞加入1 mL茜素紅染色液進行染色。

1.2.7 實時定量PCR檢測 小鼠MSC進行成骨誘導(dǎo)及加藥處理5 d后收集細胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法進行操作，得到的cDNA經(jīng)稀釋后加入相關(guān)引物和酶進行qPCR檢測。以Gapdh作為內(nèi)參，用2-ΔΔCT計算分析mRNA相對表達量。Gapdh上、下游引物分別為5′-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3′和5′-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3′，Alp上、下游引物分別為5′-TAACACCAACGCTCAGGTCC-3′和5′-TGGATGTGACCTCATTGCCC-3′，骨鈣素（osteocalcin，Ocn）上、下游引物 分 別 為5′-AAGCAGGAGGGCAATAAGGT-3′和5′-TTTGTAGGCGGTCTTCAAGC-3′，Ⅰ型 膠 原α1鏈（collagen typeⅠα1 chain，Col1a1）上、下游引物分別為5′-ACGCCATCAAGGTCTACTGC-3′和5′-TACTCGAACGGGAATCCATC-3′，結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，Ctgf）上、下游引物分別為5′-GCGCCTGTTCTAAGACCTGT-3′和5′-TGGCTTGGCAATTTTAGGCGT-3′。

1.2.8 Western blotting分析 小鼠MSC進行成骨誘導(dǎo)及加藥處理7 d后收集細胞蛋白。將各組等量蛋白上樣至SDS-PAGE凝膠，進行電泳分離，再將凝膠中蛋白電轉(zhuǎn)移至NC膜。將膜置于封閉液中在搖床上孵育1 h后，分別與RUNX2抗體、OSX抗體及ID1抗體在4℃搖床孵育過夜。次日加入二抗，室溫孵育1 h，將配置好的顯影液滴加到膜表面，放入顯影儀器中顯影拍照。

1.2.9 RNA測序 依托泊苷處理UMR-106細胞3 d后，收集總RNA，之后由生工生物工程（上海）有限公司的Illumina Xten平臺測序，使用Trimmomatic對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行處理，得到清理過的數(shù)據(jù)，隨機從這些數(shù)據(jù)中抽取10 000條序列與NCBINT數(shù)據(jù)庫進行BLASTN比對，取e value≤1×10－10并且相似度>90%、coverage>80%的比對結(jié)果，計算其物種分布，進行污染檢測。之后將對照組的基因組作為參考序列，使用HISAT2將質(zhì)控后的測序序列與參考基因組進行比對，并通過RSeQC統(tǒng)計比對結(jié)果。在RNA測序分析中，使用StringTie軟件，通過定位到基因組區(qū)域或基因外顯子區(qū)的測序序列的計數(shù)（read）估計基因的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以x±s表示，各組樣本間的均數(shù)比較使用One-way ANOVA法，事后多重檢驗采用Bonferroni法進行兩兩比較。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1依托泊苷對小鼠MSC增殖及UMR-106細胞凋亡的影響

將濃度為0～12.50μmol/L的依托泊苷作用于小鼠MSC 12～60 h后，檢測MSC的增殖能力。結(jié)果顯示：依托泊苷對MSC增殖的影響呈現(xiàn)一定的濃度依賴性；當濃度≥0.20μmol/L時，依托泊苷開始抑制MSC的增殖（圖1A）。作用48 h后其半數(shù)抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）為2.192μmol/L；60 h后，IC50為1.399μmol/L。選擇濃度為0.001～1μmol/L的依托泊苷對UMR-106細胞進行凋亡檢測（圖1B），發(fā)現(xiàn)各組細胞凋亡率（16.137%～28.300%）隨藥物濃度升高逐漸上升，均顯著高于對照組（均P<0.05）。

圖1 依托泊苷對MSC增殖和UMR-106凋亡的影響Fig 1 Effects of etoposide on MSC proliferation and UMR-106 apoptosis

2.2 依托泊苷作用于MSC和UMR-106細胞后的ALP活性檢測

根據(jù)依托泊苷對MSC增殖活力的影響，選取0.001、0.01、0.1、1μmol/L 4個濃度，對人MSC、小鼠MSC進行處理并誘導(dǎo)成骨7 d，檢測ALP活性（圖2A、B）。UMR-106細胞中也分別加入0.001、0.01、0.1、1μmol/L的依托泊苷處理，3 d后檢測ALP活性（圖2C）。結(jié)果顯示，在人MSC中，0.01、0.1μmol/L依托泊苷組的ALP染色較未加藥組顯著加深；在小鼠MSC中，0.001、0.01、0.1μmol/L依托泊苷組的ALP染色較未加藥組顯著加深。UMR-106細胞依托泊苷組ALP染色均顯著深于未加藥組，說明依托泊苷能促進人MSC、小鼠MSC、成骨性骨肉瘤細胞系UMR-106的成骨分化。

圖2 ALP染色檢測依托泊苷對細胞ALP活性的影響Fig 2 Effect of etoposideon the ALPactivity of thecells detected by ALPstaining

2.3 依托泊苷作用于MSC后的鈣結(jié)節(jié)染色

對人MSC、小鼠MSC進行依托泊苷（0.001、0.01、0.1、1μmol/L）處理并誘導(dǎo)成骨14 d后，利用茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)（圖3）。結(jié)果顯示與未加藥組相比，在人和小鼠MSC中0.001、0.01、0.1μmol/L依托泊苷組鈣結(jié)節(jié)染色顯著加深，而1μmol/L依托泊苷組染色呈陰性，可能和依托泊苷導(dǎo)致的細胞凋亡有關(guān)。

圖3 茜素紅染色檢測依托泊苷對MSC鈣結(jié)節(jié)含量的影響Fig 3 Effect of etoposideon thecontent of calcium nodules in MSCdetected by alizarin red staining

2.4 依托泊苷作用于小鼠MSC后Alp、Ocn、Col1a1的mRNA表達變化

對小鼠MSC進行依托泊苷（0.001、0.01、0.1、1μmol/L）處理并誘導(dǎo)成骨5 d后，與未加藥誘導(dǎo)組相比，0.01、0.1、1μmol/L依托泊苷組成骨相關(guān)標志物Alp表達顯著升高，0.001、0.01、0.1μmol/L依托泊苷組Ocn表達顯著升高，4個濃度的依托泊苷組Col1a1mRNA表達均顯著升高（均P<0.05，圖4）。

圖4 實時熒光定量PCR檢測依托泊苷對小鼠MSC成骨相關(guān)基因表達的影響Fig 4 Effect of etoposideon the expression of osteogenic-related genes in mouse MSCby real-timeqPCR

2.5 依托泊苷作用于UMR-106細胞后RNA測序分析

選擇濃度0.001μmol/L的依托泊苷和UMR-106細胞孵育3 d后進行mRNA測序檢測基因的表達變化。韋恩圖結(jié)果顯示與對照組相比，依托泊苷可以促進965個基因表達，同時抑制1 215個基因表達（圖5A）。將表達變化大于2倍并且P值小于0.05的基因篩選出來并利用散點圖和熱圖展示，結(jié)果顯示，依托泊苷組有31個基因表達上調(diào)，49個基因表達下調(diào)（圖5B、C）。表1羅列出了依托泊苷組表達上調(diào)倍數(shù)最高的前13個基因名稱、上調(diào)倍數(shù)和P值。其中Ctgf因?qū)Τ晒钦{(diào)控基因Id1具有調(diào)節(jié)功能而對其進行了驗證，證實依托泊苷可促進Ctgf表達（圖5D）。

圖5 RNA測序和PCR檢測依托泊苷對UMR-106細胞mRNA表達的影響Fig 5 Effect of etoposideon theexpression of mRNAs in the UMR-106 cells by RNA sequencing and PCR

表1 依托泊苷促進UMR-106細胞表達上調(diào)倍數(shù)最高的前13個基因Tab 1 Top up-regulated 13 genespromoted by etoposide in the UMR-106 cellsdetected by RNA sequencing

2.6 依托泊苷作用于小鼠MSC后RUNX2、OSX、ID1的蛋白表達變化

Western blotting結(jié)果顯示，與未加藥誘導(dǎo)組相比，0.001、0.01μmol/L依托泊苷組小鼠MSC成骨相關(guān)蛋白RUNX2、OSX及ID1表達水平均顯著增高（均P<0.05，圖6）。

圖6 Western blotting檢測依托泊苷對小鼠MSC成骨相關(guān)蛋白表達的影響Fig 6 Effect of etoposideon the expression of osteogenic related proteins in mouse MSCby Western blotting

3 討論

骨腫瘤術(shù)后造成的骨缺損或骨重建不良是目前骨科臨床面臨的一大挑戰(zhàn)。干細胞由于其優(yōu)越的再生潛能成為器官和組織再生領(lǐng)域的研究熱點［11-14］。有別于一般骨缺損的骨再生，骨腫瘤術(shù)后骨再生的理想狀態(tài)為在抑制腫瘤細胞的同時促進干細胞骨修復(fù)。本研究在目前臨床抗腫瘤藥物中篩選到了具有此雙重作用的依托泊苷，發(fā)現(xiàn)依托泊苷具有促進干細胞向成骨細胞分化的功能。ALP是干細胞向成骨細胞分化的早期標志性酶，成骨細胞形成的鈣結(jié)節(jié)是干細胞晚期成骨分化的標志物。本研究中，MSC經(jīng)不同濃度的依托泊苷處理后發(fā)現(xiàn)，其早期及晚期的成骨分化標志物均顯著增加，同時又在mRNA和蛋白質(zhì)水平進一步證明依托泊苷能促進MSC成骨分化相關(guān)標志物的表達。

轉(zhuǎn)錄組測序可在RNA水平研究基因表達差異［15］，目前已應(yīng)用于多種疾病診療的分子機制研究。為研究依托泊苷促進干細胞成骨分化的機制，本研究利用Illumina Xten高通量RNA測序技術(shù)對依托泊苷處理后的成骨性骨肉瘤細胞UMR-106樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)依托泊苷可顯著上調(diào)Ctgf的表達。CTGF屬于基質(zhì)細胞蛋白（CYR61-CTGF-NOV，CCN）家族，已被證明可調(diào)節(jié)多種細胞功能，并參與更復(fù)雜的生物學(xué)過程，如軟骨生成和成骨［16-17］。研究［18］還表明，在骨骼組織的修復(fù)或再生過程中，CTGF的表達顯著增加，而重組形式的CTGF處理可以刺激成骨細胞或細胞系的增殖和分化。

已有研究［19］表明ID1是CTGF的下游信號通路分子，且沉默ID1的表達能下調(diào)成骨標志物骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達。ID1在機體生命過程中發(fā)揮重要作用，包括細胞發(fā)育、衰老、分化、血管生成和遷移［20-21］。有研究［22-23］表明，ID1是成骨信號的重要激活分子，也是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路信號的靶基因。

為了進一步驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，我們在蛋白質(zhì)水平檢測了依托泊苷作用下MSC成骨分化過程中ID1及其下游成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和OSX的表達，發(fā)現(xiàn)依托泊苷能夠顯著增加MSC成骨分化過程中ID1、RUNX2和OSX的表達，從而促進干細胞成骨分化。

依托泊苷在抗腫瘤方面也起著重要的作用。研究［24］表明，依托泊苷對骨肉瘤細胞有殺傷作用，與其促細胞凋亡有關(guān)。我們的數(shù)據(jù)顯示依托泊苷在促進成骨的有效濃度范圍內(nèi)能促進骨肉瘤細胞凋亡。近年來的觀點認為骨肉瘤可能是一種分化缺陷疾病，骨肉瘤細胞成骨分化被認為是治療骨肉瘤的一種全新方法［25］。本研究發(fā)現(xiàn)依托泊苷的另一個重要功能，即促進成骨性骨肉瘤細胞UMR-106向成骨分化；其機制可能是依托泊苷通過促進Ctgf基因的表達激活其靶基因Id1，進而激活其下游成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和OSX。我們的研究對未來研究依托泊苷的藥物靶點及功能等提供了新的思路，為臨床骨腫瘤切除術(shù)后的骨缺損、保肢重建治療的臨床難題提供了新的策略及理論依據(jù)。

參·考·文·獻

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