王成志，鄧華云，龐 智，黃 雷

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)與遺傳發(fā)育學(xué)系，上海 200025

我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率和死亡率分別位居女性惡性腫瘤的第一位和第五位［1］。在臨床上根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕 激 素 受 體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2或ERBB2）的表達(dá)情況，乳腺癌分為4種不同亞型：Luminal A型（ER或/和PR陽性，HER2陰性）、Luminal B型（ER或/和PR陽性，HER2陽性）、HER2過表達(dá)型（ER和PR陰性，HER2陽性）以及三陰性（ER、PR和HER2均為陰性）［2］。其中HER2過表達(dá)型占乳腺癌的20%～30%，是由HER2基因擴(kuò)增等機(jī)制而導(dǎo)致HER2受體過表達(dá)。由于HER2可與其家族成員其他激酶受體HER1（EGFR）、HER3或HER4形成異源二聚體，激活下游信號(hào)通路，使細(xì)胞獲得快速增殖和侵襲能力，因此HER2過表達(dá)型乳腺癌患者具有不良的預(yù)后［3］。

靶向HER2的單抗藥物和小分子抑制劑已廣泛應(yīng)用于HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床治療，可顯著改善HER2陽性乳腺癌患者的預(yù)后［4-5］。人源化單克隆抗體曲妥珠單抗和帕妥珠單抗可結(jié)合于HER2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域Ⅱ，阻止其形成同源和異源二聚體，其中包括HER2/HER3異源二聚體［6-7］，從而阻斷HER2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。拉帕替尼是一種口服酪氨酸激酶抑制劑（tyrosinekinaseinhibitor，TKI），通過可逆性地抑制表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和HER2激酶活性，而用于治療晚期HER2陽性乳腺癌［8］。盡管如此，仍有約70%的HER2陽性乳腺癌患者對(duì)上述治療出現(xiàn)耐藥性［9］。因此，篩選新的生物靶標(biāo)將為HER2陽性乳腺癌的臨床治療提供指導(dǎo)意義。

黏蛋白1（mucin 1，MUC1）屬黏蛋白家族成員，是一種Ⅰ型單次跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于大多數(shù)分泌型上皮細(xì)胞的管腔面，呈極性分布。MUC1與上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的其他黏蛋白一起形成生理屏障，保護(hù)細(xì)胞免受外界損傷、有毒化合物和微生物的侵襲等［10］。MUC1在腫瘤中高表達(dá)且失去極性，MUC1的胞外段（又稱CA153）在臨床上已經(jīng)作為乳腺癌和胰腺癌的診斷指標(biāo)，也可作為腫瘤免疫治療的靶標(biāo)［11-12］。MUC1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（cytoplasmic domain，CD）高度保守，且含有7個(gè)酪氨酸位點(diǎn)，參與生長(zhǎng)因子受體和細(xì)胞內(nèi)激酶等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［13］。同時(shí)，MUC1可與STAT3、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、p53和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控［14-15］。由于基因拷貝數(shù)的增加和異常的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，MUC1在超過90%的乳腺癌中高表達(dá)。MUC1-C端可參與STAT1/3和NF-κB等信號(hào)并正反饋促進(jìn)MUC1在乳腺癌中的表達(dá)［16］。

多項(xiàng)研究［17-18］證明，MUC1與HER2存在相互作用并與單抗藥物治療耐藥密切相關(guān)。但MUC1在HER2陽性乳腺癌發(fā)病中的作用未見報(bào)道。本研究旨在通過對(duì)MUC1在HER2陽性乳腺癌發(fā)病中的作用進(jìn)行研究，揭示MUC1是否促進(jìn)HER2陽性乳腺癌細(xì)胞惡性特征，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 PCR儀、核酸凝膠成像儀（Bio-Rad，美國(guó)），LAS-4000 mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（通用，日本），超凈工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）。

1.1.2 試劑 膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒（MN，德國(guó)），Lipo 2000轉(zhuǎn)染試劑（Thermo，美國(guó)），DMEM、DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)），F(xiàn)-12液體培養(yǎng)基（上海源培生物科技股份有限公司），胎牛血清（foetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco，美國(guó)），胰蛋白酶（蘇州新賽美生物科技有限公司），胰島素、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因 子 （basic fibroblast growth factor， bFGF）（Peprotech，美國(guó)）、BSA（Sigma，美國(guó)），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）（同仁，日本），βactin抗體（CST，美國(guó)）。

1.1.3 細(xì)胞 小鼠HER2陽性永生型乳腺癌上皮細(xì)胞MT2由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系吳學(xué)峰老師饋贈(zèng)。MT2細(xì)胞中轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒pInducer-MUC1，記 為MT2 pInducer-MUC1（MT2/MUC1）；MT2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入Vector和MUC1-CD，記為MT2/Vec和MT2/CD。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) ①M(fèi)T2細(xì)胞培養(yǎng)基制備：取胰島素（10 mg/mL）25μL，氫化可的松（1 mg/mL）50μL，EGF（100μg/mL）5μL，慶 大 霉 素（100 mg/mL）25μL，F(xiàn)BS 7.5 mL，F(xiàn)-12培養(yǎng)基補(bǔ)至50 mL。②成球培養(yǎng)基制備：取8%BSA 2.5 mL，bFGF 10μL，EGF（100 μg/mL）10μL，胰 島 素（25 mg/mL）100μL，B27 1 mL，DMEM/F12培養(yǎng)基補(bǔ)至50 mL，0.22μm濾頭過濾后4℃保存。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建 ①質(zhì)粒構(gòu)建。將MUC1-HA基因酶切并連接至pENTRTM1A質(zhì)粒中，構(gòu)建pENTRTM1AMUC1-HA質(zhì)粒；pENTRTM1A-MUC1-HA與pInducer-20進(jìn)行重組反應(yīng)，構(gòu)建pInducer-MUC1-HA質(zhì)粒。經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并加入多西環(huán)素（doxycycline，DOX）誘導(dǎo)表達(dá)，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)。②病毒包裝。將293T細(xì)胞鋪至10 cm培養(yǎng)皿中，密度以第2日達(dá)30%～40%為宜。在1.5 mL EP管中，按密度ρ=0.4 g/L（質(zhì)?！棉D(zhuǎn)染試劑）取Lipo 2000 20μL加至250μL opti-MEM中。同時(shí)，在另一個(gè)1.5 mL EP管中，將pMD2.G質(zhì)粒1μg、psPAX2質(zhì)粒3μg、目的質(zhì)粒4μg加至250μL opti-MEM中，室溫靜置5 min。兩管混合均勻，室溫靜置20 min后逐滴滴加至培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6 h后換液。培養(yǎng)48 h后，用20 mL注射器吸取病毒上清液經(jīng)0.45μm濾頭過濾，分裝病毒并保存于-80℃。③病毒感染。MT2細(xì)胞接種至6 cm培養(yǎng)皿中，密度以第2日達(dá)30%～40%為宜。配制病毒感染體系：取4 mL無雙抗的完全培養(yǎng)基、1 mL病毒液和4μL polybrene（終濃度8μg/mL），棄原培養(yǎng)基，加入配制好的病毒液至培養(yǎng)皿中，感染4～6 h后換液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后按一定比例傳代，并加入抗性篩選藥物G418（終濃度0.8μg/mL），篩選1周后收集混合克隆細(xì)胞檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.3 Western blotting 將收集的細(xì)胞樣品加入NETN150裂解液，用考馬斯藍(lán)染色法將蛋白定量；取20μg總蛋白量上樣至SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移SDS-PAGE膠至NC膜或PVDF膜上；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入一抗（2%BSA配制），4℃孵育7～9 h或過夜；加入5%牛奶配制的二抗，室溫孵育；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞接種至96孔板中，設(shè)置3復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)；待細(xì)胞完全貼壁后，在第0日的孔中加入CCK-8試劑，37℃反應(yīng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度；繪制不同時(shí)間細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種至6孔板，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)10 d；形成肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，加入甲醇固定；棄甲醇，加入結(jié)晶紫染色，自來水緩慢沖洗去除殘留結(jié)晶紫，室溫晾干；掃描儀掃描成像，計(jì)數(shù)克隆數(shù)，并根據(jù)以下公式計(jì)算克隆形成率：克隆形成率=克隆數(shù)/細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，按2.5×105/孔的密度接種至12孔板中，以第2日細(xì)胞密度達(dá)到100%為宜；待細(xì)胞密度達(dá)到100%后，用干凈的中槍頭沿著直尺在12孔板的孔中央劃一道痕；棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次去除漂浮的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，10倍顯微鏡下拍照（T0）；37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，10倍顯微鏡下拍照（T1）。采用Image J軟件計(jì)算劃痕平均距離。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞遷移率：細(xì)胞遷移率=(寬度T0-寬度T1)/寬度T0×100%。

1.2.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并加至上室中，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h；吸去小室中殘留培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至甲醇中固定；吸去殘留甲醇，轉(zhuǎn)移至結(jié)晶紫中染色過夜；用自來水洗去殘留染色液，并用棉簽擦去上室中未遷移的細(xì)胞，室溫晾干；10倍鏡下選取不同視野拍照，計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)目，并做統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.8 腫瘤細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn) 用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，梯度稀釋后細(xì)胞接種至低吸附的24孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)4～7 d；4倍鏡下拍照。以≥50μm為1個(gè)球，統(tǒng)計(jì)每個(gè)孔中球的個(gè)數(shù)，并做統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.9 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)基因表達(dá)相關(guān)性分析 采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析MUC1和HER2的表達(dá)水平。使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）Expression Analysis功能項(xiàng)中的Expression DIY（Box Blot）或Correlation Analysis功能模塊，以BRCA（乳腺癌）作為癌癥種類，對(duì)MUC1和HER2進(jìn)行相關(guān)性分析。采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析6-磷酸葡萄糖脫氫酶 （glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase，G6PD）的表達(dá)水平。對(duì)于乳腺癌（BRCA），選擇基于1 097例Tumor以及113例Normal樣本的RNA-seq counts數(shù)據(jù)，采用GDC工具下載RNA-seq counts文件。使用DEseq2中的估計(jì)色散方法（estimate the dispersion）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。G6PD基因在癌（1 097例）與癌旁（113例）組織樣本的表達(dá)差異通過箱式圖來表示?？v軸為各個(gè)樣本表達(dá)量的原始數(shù)據(jù)，橫軸為樣本類型分類（normal和tumor），每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6和Adobe Illustrator CS4軟件作圖，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20軟件。定量數(shù)據(jù)均以±s表示，兩樣本間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MUC1過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建

為了探究MUC1對(duì)HER2陽性乳腺癌細(xì)胞特性的影響，首先利用MUC1全長(zhǎng)或MUC1-CD病毒表達(dá)載體感染Her2轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺癌原代細(xì)胞MT2，構(gòu)建MUC1全長(zhǎng)誘導(dǎo)表達(dá)和MUC1-CD過表達(dá)的細(xì)胞株。Western blotting結(jié)果檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，MUC1誘導(dǎo)表達(dá)組（DOX+）中MUC1表達(dá)水平明顯上調(diào)（圖1A）；MUC1-CD過表達(dá)組中也檢測(cè)到MUC1的表達(dá)（圖1B）。

圖1 Western blotting檢測(cè)MUC1的表達(dá)Fig 1 Expression of MUC1 was detected by Western blotting

2.2 MUC1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成

為了檢測(cè)MUC1過表達(dá)對(duì)MT2乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，首先通過CCK-8對(duì)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，MUC1誘導(dǎo)表達(dá)組（DOX+）細(xì)胞的生長(zhǎng)速度與對(duì)照組（DOX-）相比明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）（圖2A）。與MUC1誘導(dǎo)表達(dá)組（DOX+）細(xì)胞相同，MUC1-CD過表達(dá)組細(xì)胞也表現(xiàn)出明顯增殖優(yōu)勢(shì)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）（圖2B）。利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)MUC1的作用，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MUC1全長(zhǎng)（圖2C）和MUC1-CD（圖2D）后，細(xì)胞形成克隆數(shù)目明顯增多，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。這些結(jié)果說明，MUC1過表達(dá)具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成的能力。

圖2 MUC1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力Fig 2 MUC1 promotes breast cancer cell proliferation and colony formation ability

2.3 MUC1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移

為了檢測(cè)MUC1的過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力的影響，分別進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不論是MUC1誘導(dǎo)表達(dá)組（DOX+）還是MUC1-CD過表達(dá)組的細(xì)胞遷移率均顯著增加（圖3A、B）。同時(shí)，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，MUC1誘導(dǎo)表達(dá)組（DOX+）和MUC1-CD過表達(dá)組中細(xì)胞的移行能力增強(qiáng)顯著（圖3C、D）。上述結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。這些結(jié)果說明，MUC1的過表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。

圖3 MUC1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移Fig 3 MUC1 promotes breast cancer cell migration

2.4 MUC1增加乳腺癌細(xì)胞成球數(shù)目

腫瘤細(xì)胞中的干細(xì)胞或起始細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤增殖和耐藥的重要原因之一。通過成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)MUC1的過表達(dá)對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MUC1全長(zhǎng)誘導(dǎo)表達(dá)組和MUC1-CD過表達(dá)組成球數(shù)目增多（圖4A、B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示MUC1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的成球能力。

圖4 MUC1增加乳腺癌細(xì)胞的成球能力Fig 4 MUC1 increases the sphere formation of breast cancer cells

2.5 G6PD參與MUC1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖作用

快速增殖是腫瘤細(xì)胞共有的特征，磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）在細(xì)胞增殖過程中為其提供DNA合成所需的原料，而G6PD是PPP途徑的第一個(gè)限速酶。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析表明，MUC1與HER2（ERBB2），HER2（ERBB2）與G6PD在乳腺癌中具有相關(guān)性，但未發(fā)現(xiàn)MUC1和G6PD在mRNA水平的相關(guān)性（圖5A、B）。為了探究G6PD是否參與MUC1對(duì)HER2陽性乳腺癌細(xì)胞惡性表型的調(diào)控作用，利用MT2/MUC1和MT2/MUC1-CD 2個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行相關(guān)研究。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MT2/MUC1和MT2/MUC1-CD細(xì)胞中G6PD的蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯上調(diào)（圖5C、D）。上述結(jié)果表明MUC1過表達(dá)可上調(diào)HER2陽性乳腺癌細(xì)胞中G6PD的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

G6PD的抑制劑6-AN，可以抑制細(xì)胞內(nèi)G6PD的酶活性。為進(jìn)一步證明G6PD是否參與MUC1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞惡性特征形成，利用6-AN抑制劑處理細(xì)胞，并檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的增殖情況。CCK-8結(jié)果顯示，在MUC1誘導(dǎo)過表達(dá)組和過表達(dá)組中，與對(duì)照組相比，加入6-AN后均可顯著抑制MUC1全長(zhǎng)或MUC1-CD誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖（圖5E、F）。上述結(jié)果表明，G6PD蛋白參與MUC1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖作用。

圖5 G6PD參與MUC1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖作用Fig 5 G6PD is involved in the proliferation of breast cancer cellsinduced by MUC1

2.6 G6PD在乳腺癌中高表達(dá)且與患者生存期呈負(fù)相關(guān)

為了深入分析G6PD在乳腺癌樣本中的表達(dá)情況，分別在GEPIA和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)HER2、MUC1和G6PD的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，HER2、MUC1和G6PD在乳腺癌中均呈高表達(dá)（圖6A～C）。同時(shí)，通過Kaplan-Meier法對(duì)G6PD高表達(dá)的乳腺癌的5年生存期分析發(fā)現(xiàn)，G6PD高表達(dá)患者總生存期（overall survival，OS）和無復(fù)發(fā)生存期（relapse-free survival，RFS）均下降（圖6D、E），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，G6PD在乳腺癌中高表達(dá)且與不良預(yù)后密切相關(guān)。

圖6 利用數(shù)據(jù)庫(kù)分析G6PD表達(dá)與生存期的關(guān)系Fig 6 Database analysis of the expression of G6PD and survival

3 討論

研究表明，MUC1可通過胞內(nèi)段與其他癌基因編碼的蛋白，如β-catenin、EGFR以及C末端Src激酶（Cterminal Src kinase，Csk，又稱c-Src）等相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［19-20］。研究［17］證明，MUC1與HER2存在相互作用，并且在HER2單抗藥物治療耐藥細(xì)胞株中相互作用加強(qiáng)。MUC1過表達(dá)可以促進(jìn)HER2陽性乳腺癌對(duì)他莫昔芬的治療抵抗；相反，MUC1的敲減可顯著阻斷耐藥株中HER2下游信號(hào)的激活，并可緩解HER2靶向治療的耐藥情況［17］。這些結(jié)果表明MUC1可與HER2相互作用并參與HER2陽性乳腺癌耐藥的過程。但在人乳腺癌細(xì)胞中MUC1與HER2之間的研究較多，在小鼠細(xì)胞中MUC1與HER2的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MUC1可促進(jìn)小鼠腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MUC1也促進(jìn)了小鼠腫瘤細(xì)胞克隆形成和成球能力。對(duì)MUC1作用的功能域進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，MUC1-CD即可發(fā)揮促進(jìn)腫瘤惡性特征的作用。

快速增殖能力和異常的能量代謝是腫瘤的兩大特征。在腫瘤生長(zhǎng)過程中，葡萄糖作為主要的能源物質(zhì)，除了經(jīng)糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑生成ATP和CO2之外，還存在其他代謝途徑，如PPP等。G6PD是調(diào)控PPP的關(guān)鍵限速酶。PPP生成的NADPH可為細(xì)胞的各種合成反應(yīng)提供還原劑，如參與脂肪酸和固醇類物質(zhì)的合成。此外，PPP途徑產(chǎn)生的5-磷酸核糖（ribose-5-phosphate，R5P）是細(xì)胞內(nèi)唯一參與核酸生物合成的五碳糖，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的水平具有重要作用。G6PD在許多正常代謝組織中高表達(dá)，包括肝臟、脂肪組織，以及乳腺和腎上腺［21］，腫瘤細(xì)胞中也有高水平的表達(dá)。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，并通過促進(jìn)G6PD和HIF-1α途徑上調(diào)Notch1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的增殖轉(zhuǎn)移［22］。G6PD受細(xì)胞外刺激和信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，這些通路可以調(diào)節(jié)其表達(dá)并通過翻譯后修飾調(diào)節(jié)G6PD活性。酪氨酸激酶Src可直接磷酸化G6PD并誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移［23］。在某些細(xì)胞類型中，cAMP直接或間接下調(diào)G6PD活性。cAMP激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），可以直接磷酸化G6PD的絲/蘇氨酸殘基并抑制其活性。NADP+/NADPH比率是該酶的主要調(diào)節(jié)劑之一。NADPH負(fù)調(diào)節(jié)G6PD的活性，而NADP+是其酶活性和正確構(gòu)象所必需的［24］。抑制G6PD可降低NADPH的產(chǎn)生，降低GSH的水平，進(jìn)而降低清除ROS水平的能力，并通過體外ROS介導(dǎo)的損傷增強(qiáng)奧沙利鉑誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡［25］。也有研究［26］發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞中MUC1的過表達(dá)通過增強(qiáng)糖酵解、PPP和核苷酸生物合成降低輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和DNA損傷作用。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，MUC1與HER2的表達(dá)呈正相關(guān)，而HER2與G6PD的表達(dá)也呈正相關(guān)，這提示MUC1與G6PD之間可能也存在相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在MUC1和MUC1-CD過表達(dá)的MT2細(xì)胞中，G6PD均呈現(xiàn)高表達(dá)，提示G6PD可能參與MUC1對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和成球能力的調(diào)控。為此，進(jìn)一步利用G6PD抑制劑6-AN處理細(xì)胞，并對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性特征進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，MUC1過表達(dá)細(xì)胞用6-AN處理后可顯著降低MUC1過表達(dá)引起的細(xì)胞增殖，提示G6PD的上調(diào)參與了MUC1對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和成瘤能力的促進(jìn)作用。

為了驗(yàn)證G6PD在乳腺癌中的作用，進(jìn)一步利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)乳腺癌樣本進(jìn)行分析，結(jié)果表明，G6PD在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，與本研究發(fā)現(xiàn)相一致。

利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)G6PD高表達(dá)的乳腺癌的5年生存期分析的結(jié)果也表明，G6PD高表達(dá)患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期均下降，這提示G6PD高表達(dá)的患者具有不良的預(yù)后反應(yīng)。也有研究［27］發(fā)現(xiàn)，MUC1過表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后降低、惡性程度增加和癌組織分級(jí)增加有關(guān)。MUC1和G6PD在乳腺癌中均呈現(xiàn)高表達(dá)，說明兩者之間可能存在一定的相關(guān)性。后續(xù)工作還需進(jìn)一步明確MUC1與G6PD的調(diào)控關(guān)系及作用機(jī)制。數(shù)據(jù)庫(kù)分析未發(fā)現(xiàn)兩者在mRNA水平的相關(guān)性，接下來需要通過qPCR作進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，MUC1是否會(huì)在蛋白質(zhì)表達(dá)水平對(duì)G6PD的穩(wěn)定性進(jìn)行調(diào)控仍需要深入研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了MUC1過表達(dá)促進(jìn)小鼠HER2陽性乳腺癌的惡性特征，初步機(jī)制研究表明MUC1可能通過調(diào)控G6PD的表達(dá)而發(fā)揮促腫瘤作用，提示抑制PPP可能成為MUC1相關(guān)的HER2陽性乳腺癌治療的靶點(diǎn)。

參·考·文·獻(xiàn)

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