龔樹斌

（1.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

嬰幼兒米粉容易消化吸收，營養(yǎng)豐富，非常適合嬰幼兒食用，但是近五年食品抽檢中嬰幼兒米粉不合格數(shù)量達(dá)200多批次，不合格項目中營養(yǎng)成分不合格占比高達(dá)80%，其中維生素A、D和E均出現(xiàn)多次不合格，所以維生素含量測定顯得尤其重要。維生素測定方式比較常見的方式有： 分光光度法[1]、層析法[2]、液相色譜法[3-6]等，而主要方法是液相色譜法。但是，現(xiàn)行的國標(biāo)檢測方法提取方法繁瑣，不穩(wěn)定，耗時，由于維生素D含量較低，易受基質(zhì)干擾[7]，且國標(biāo)方法使用兩次提取法測定維生素含量A、D和E時，需要同時使用正相和反相儀器。本研究經(jīng)查閱參考文獻(xiàn)和相關(guān)資料，優(yōu)化方法，僅使用一次前處理和一臺二維反相儀器建立了一種更高效率測定嬰幼兒米粉中維生素A、D和E含量的方法。

二維反相色譜通過切換一維和二維的2個六通閥來達(dá)到維生素A、D和E的分離。閥連接示意圖見圖1。

圖1 二維閥連接示意圖

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

維生素A（視黃醇純度99.3%）、維生素D（維生素D2，純度99.6%）和維生素D3（純度99.9%）、維生素E（α-生育酚純度96.9%），德國Dr.Ehrenstorfer公司。

甲醇和乙腈為色譜純；

抗壞血酸、BHT、無水乙醇、石油醚、正己烷、無水硫酸鈉、氫氧化鉀：分析純，廣西西隴科學(xué)股份有限公司。

Waters ACQUITY Arc 2D（搭配250μL注射器及定量環(huán)），Waters光電二極管陣列檢測器（PAD2998）和自動進(jìn)樣器。C18色譜柱（5μm，4.6×250 mm）、Poroshell 120PFPC18 色譜柱（4.6×100 mm，2.7μm）和XselectHSS SB色譜柱（C18柱）（3.0×150 mm，3.5μm）；IKA MS 3 basic單發(fā)渦旋振蕩器，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品維生素A、D2、D3和E至棕色容量瓶中，0.1% BHT的乙醇定容；量取適量該標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，維生素A、D2、D3和E標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度分別為24.3、1.70、1.78、211 μg/mL，見表1。吸取上述維生素A、D2、D3和E混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見表2。

表1 維生素A、D2、D3和E的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制表

表2 維生素A、D2、D3和E的標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

1.2.2 樣品前處理

精確稱取米粉2 g于250 mL棕色三角瓶中，加入0.5 g淀粉酶，15 mL熱水，恒溫烘箱60 ℃酶解20 min后，依次加入1 g抗壞血酸，0.1 gBHT，20 mL無水乙醇和10 mL 500 g/L的KOH溶液，烘箱80 ℃皂化20 min后，轉(zhuǎn)移至500 mL棕色分液漏斗，皂化液以55 mL石油醚提取2次，合并提取液，加入5 mL0.3%冰乙酸溶液，水洗至pH中性，經(jīng)過無水Na2SO4脫水收集上層石油醚。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收石油醚，近干后以5 mL甲醇定容，上機(jī)分析。

1.2.3 色譜條件

一維色譜條件：采用Poroshell 120 PFP色譜柱（4.6×100 mm，2.7μm），1.0 mL/min，柱溫為 35 ℃。

二維色譜條件：采用Xselect HSS C18SB色譜柱（3.0×150 mm，3.5μm），采用0.5 mL/min，采用柱溫為40 ℃。

捕集柱：采用XBridge BEH C18 Direct Connect HP（2.1×30 mm,10μm）檢測器： 2998PAD Detector檢測波長：VA：λ=325 nm、VD2、VD3：λ=264 nm、VE：λ=294 nm。

流動相：A-純水；B-乙腈；C-甲醇，進(jìn)樣量：均為10 μL，梯度洗脫條件見表3。

表3 梯度洗脫條件

2 結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

對D2和D3進(jìn)行完全分離是需要解決的關(guān)鍵問題之一，本研究二維色譜柱嘗試用酰氨基柱和Xselect HSS C18SB色譜柱進(jìn)行分離，并作條件優(yōu)化，對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用Xselect HSS C18SB色譜柱（3.0×150 mm，3.5μm）能很好地分離D2和D3，分離度更好且峰形較好，雜峰更少。

2.2 柱溫的選擇

方法對柱溫進(jìn)行了優(yōu)化，對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)二維的柱溫在40 ℃時與35℃時分辨率相似，但40 ℃時加快D2和D3的分離過程，縮短檢測時間。在本方法的色譜條件下維生素A、D2、D3和E的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2。

圖2 維生素A、D2、D3和E對應(yīng)波長下的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.3 前處理條件的優(yōu)化

對比水浴鍋和烘箱作為供溫設(shè)備處理嬰幼兒米粉時，維生素A、D2、D3和E含量的測定結(jié)果相差不大。但相同條件下，烘箱處理樣品量遠(yuǎn)大于水浴鍋，所以本文選用烘箱作為供溫設(shè)備提供酶解和皂化。

實驗表明，在氫氧化鉀添加量10 mL，皂化溫度80 ℃，皂化時間20 min 時，提取效果比較理想。如果皂化溫度過高或時間過長，則易導(dǎo)致維生素A、D2、D3和E目標(biāo)物損失；而皂化溫度過低、氫氧化鉀添加量過少或皂化時間過短，則皂化不完全。

對比正己烷、石油醚、石油醚+乙醚（1+1）和乙醚4種提取溶劑，發(fā)現(xiàn)其對維生素A、D2、D3和E結(jié)果的影響不大；使用純乙醚作為提取溶劑時，易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，且乙醚毒性高，長期使用對人體健康產(chǎn)生影響，所以排除石油醚+乙醚（1+1）和純乙醚作為提取溶劑，而正己烷價格較石油醚昂貴許多，因此本文選用石油醚作為提取溶劑。

2.4 方法的評價

2.4.1 方法的線性關(guān)系和檢出限

根據(jù)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程。各標(biāo)準(zhǔn)樣品在不同濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.9998以上。得到線性范圍和線性方程后，將該標(biāo)液稀釋至以信噪比（S/N）約等于3時的濃度作為檢出限，將該標(biāo)液稀釋至以信噪比（S/N）約等于10時的濃度作為定量限，測定結(jié)果見表4。

表4 方法線性關(guān)系結(jié)果表

2.4.2 回收率和精密度

挑選一款含有較低維生素水平的嬰幼兒米粉作為基質(zhì)，添加維生素A、D2、D3和E混標(biāo)，每個濃度平行測定6次，并進(jìn)行3水平加標(biāo)回收試驗，見表5。結(jié)果表明，維生素A、D2、D3和E的加標(biāo)回收率在91.9%～100.4%之間，RSD在1.8%～4.9%之間，說明本方法準(zhǔn)確度和精密度均較為理想，滿足分析的要求。

表5 方法的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

2.5 實際樣品分析

選擇10種不同品牌的嬰幼兒米粉進(jìn)行方法可行性驗證，利用本方法與國標(biāo)GB 5009.82—2016方法進(jìn)行結(jié)果對比，驗證本方法。采用國標(biāo)方法和本方法分別對同一樣品測定6次。其中VD2均未檢出，故本文VD僅代表VD3。

經(jīng)過t檢驗的處理，各個t值如下（見表6），均小于通過查t檢驗表得到的t值2.228，所以p值均大于0.05（雙側(cè)檢驗）。因此本文方法的測定結(jié)果與國標(biāo)方法無顯著性差異，可以滿足對實際樣品的檢測。

表6 實際樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文對二維反相色譜法檢測嬰幼兒米粉中維生素A、D和E含量方法的前處理條件和儀器方法進(jìn)行了優(yōu)化，與國標(biāo)GB 5009.82—2016方法相比，具有快速、簡單、重現(xiàn)性好、靈敏度高的優(yōu)點，解決了嬰幼兒米粉中維生素A、D和E含量的測定步驟繁瑣的問題，降低了實驗成本，節(jié)省了時間，具有一定的實際應(yīng)用價值。