邱韻潔，項雷文,，吳承燕，陳文韜，陳盛,

（1.福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.福建技術(shù)師范學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，福建 福清 350300）

丙烯酰胺是一種不飽和羧基化合物，有極強的水溶性，是公認的“人類可能致癌物”[1]。丙烯酰胺存在于許多常見食品中[2,3]，如何降低其含量一直是國內(nèi)外研究的熱點問題[4-6]。

β-乳球蛋白是牛奶等乳制品中主要的乳清蛋白之一，占其含量的50%～55%。β-乳球蛋白單體上具有多個可結(jié)合疏水性配體的結(jié)合位點[7]，可以與小分子結(jié)合，包括脂肪酸、視黃醇、多酚和其他小分子[8,9]。

使用計算機進行分子對接有助于了解蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合時的構(gòu)象變化以及蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的穩(wěn)定性。本文將采用分子對接手段，探究β-乳球蛋白與丙烯酰胺可能的具體作用方式，并結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用儀驗證β-乳球蛋白對丙烯酰胺的抑制情況，為將來探究二者同時被攝入時降低丙烯酰胺對人體的影響的可能性提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與模型

1.1 材料與試劑

丙烯酰胺，標(biāo)準(zhǔn)品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；β-乳球蛋白，90%（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、甲酸，色譜純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；L-亮氨酸（L-Leu）、L-纈氨酸（L-Val）、L-異亮氨酸（L-Ile）、L-苯丙氨酸（L-Phe），純度均為99%（上海麥克林生化科技有限公司）；水系針筒式微孔濾膜過濾器，0.22 μm（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

液質(zhì)聯(lián)用儀，Aglient1290/6460（安捷倫科技有限公司）；電子分析天平（廈門精藝興業(yè)有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（廈門一恒科學(xué)儀器有限公司）；微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司）。

1.3 溶液的配制

丙烯酰胺溶液：將丙烯酰胺配制成1000 ng/mL的樣品溶液，渦旋混勻后，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

β-乳球蛋白溶液：將β-乳球蛋白配制成4 mg/mL的樣品溶液，渦旋混勻后，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

氨基酸樣品溶液：將L-Leu、L-Val、L-Ile、L-Phe配制成2 mg/mL的樣品溶液，渦旋混勻后，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.4 色譜和質(zhì)譜參數(shù)[10]

1.4.1 HPLC條件

色譜柱：Agilent SB-C18 RRHD，2.1×100 mm，粒徑2.7 μm；流動相：甲醇：0.1 %甲酸（1∶9，體積比）；流速：0.2 mL/min；柱溫：26 ℃；進樣量：25 μL。

1.4.2 MS/MS條件

檢測方式：多反應(yīng)離子檢測（MRM）；電離方式：陽離子電噴霧電離源（ESI）；毛細管電壓：3500 V；錐孔電壓：40 V；射頻透鏡1電壓：30.8 V；離子源溫度：80 ℃；脫溶劑氣溫：300 ℃；離子碰撞能量：6 eV；丙烯酰胺離子條件：母離子m/z 72、子離子m/z 55、子離子m/z 44；丙烯酰胺定量離子：m/z 55。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，運用多重比較字母標(biāo)記法。p＜0.05表示存在顯著性差異，用小寫字母表示；p＜0.01表示存在極顯著性差異，用大寫字母表示。

1.6 分子模型

1.6.1 丙烯酰胺分子模型

丙烯酰胺的分子模型獲取自ZINC[11]數(shù)據(jù)庫，ZINC ID為ZINC000000901075。

1.6.2 β-乳球蛋白分子模型

β-乳球蛋白的分子模型來源于RCSB PDB數(shù)據(jù)庫，其PDB ID為2Q2M[12]。本文所使用的2Q2M采用X-ray衍射方法獲得，實驗環(huán)境的pH值為7.4，溫度為293 K，分辨率為0.21 nm。

1.7 分子對接工具

分子對接軟件使用AutoDock Vina[13]，可以有效利用多核心處理器的核心計算單元，使得對接速度達到比較理想的狀態(tài)。

由于本文所使用的蛋白質(zhì)模型2Q2M出現(xiàn)了缺失氨基酸殘基的情況，因此將使用UCSF Chimera[14]的Modeller模塊補全其氨基酸殘基。除此之外，UCSF Chimera、PyMol[14]和LigPlot[15]將用于分子模型的預(yù)處理及對接模型結(jié)構(gòu)的分析，以及蛋白質(zhì)與配體的相互作用情況，此外也作為采集部分圖片的工具。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 不同濃度β-乳球蛋白對丙烯酰胺的抑制

將β-乳球蛋白樣品溶液按不同體積比例稀釋后與丙烯酰胺樣品溶液1∶1混合，配制成丙烯酰胺濃度為500 ng/mL、β-乳球蛋白濃度分別為0（對照組）、0.5、1、2 mg/mL的混合溶液，常溫下渦旋混勻后送入液質(zhì)聯(lián)用儀中檢測。不同濃度β-乳球蛋白對丙烯酰胺的抑制情況如圖1所示。

圖1 不同濃度β-乳球蛋白對丙烯酰胺的抑制

從圖1可以看出，添加β-乳球蛋白后的丙烯酰胺濃度有所降低，且隨β-乳球蛋白濃度增加，抑制率也增加。當(dāng)β-乳球蛋白濃度為2 mg/mL時，抑制率達到96%。說明β-乳球蛋白與丙烯酰胺之間發(fā)生了某種結(jié)合作用，從而使得丙烯酰胺檢測值降低，且此種結(jié)合效果會隨β-乳球蛋白濃度增加而變大。

2.2 β-乳球蛋白與丙烯酰胺分子對接

為了進一步研究β-乳球蛋白與丙烯酰胺之間的具體作用方式，首先使用UCSF Chimera的Modeller模塊為2Q2M補全缺失的氨基酸殘基，然后去除水分、添加極性氫原子，并用Dock Prep模塊為β-乳球蛋白進行對接前準(zhǔn)備。將丙烯酰胺進行能量最小化處理。接下來為AutoDock Vina配置參數(shù)文件，需要的參數(shù)有：蛋白質(zhì)和配體的PDBQT文件路徑、盒子中心坐標(biāo)及其大小，盒子中心坐標(biāo)為（41.539，54.407，26.375），盒子大小為2.0 nm×2.0 nm×2.0 nm。最后使用AutoDock Vina進行半柔性對接模擬，采用Lamarckian遺傳算法，得到對接結(jié)果和與之相對應(yīng)的打分成績。β-乳球蛋白與丙烯酰胺分子對接的結(jié)果如表1所示，列舉了10個能量最低的對接模型及打分情況，并分別計算出結(jié)合常數(shù)。

表1 β-乳球蛋白與丙烯酰胺對接模型的打分情況

從表1可以看出，所有對接模型的吉布斯自由能均小于零，表明β-乳球蛋白與丙烯酰胺可以自發(fā)地進行相互作用。但是能量最低也只有-3.6 kcal/mol，其結(jié)合常數(shù)也不高，表明β-乳球蛋白與丙烯酰胺有結(jié)合的可能性，但是相互作用不強。圖2顯示了上述10個對接模型在三維空間上的排布，其中大部分對接模型顯示丙烯酰胺位于β-乳球蛋白空腔內(nèi)部。圖3表示上述10個對接結(jié)果中表現(xiàn)最佳的對接模型的相互作用。

圖2 β-乳球蛋白與丙烯酰胺分子對接結(jié)果示意圖

圖3 能量最低的對接模型中β-乳球蛋白與丙烯酰胺的相互作用

如圖3所示，β-乳球蛋白空腔內(nèi)部結(jié)合位點中的氨基酸殘基Leu46、Leu54、Ile56、Val92、Val94、Leu103、Phe105和Leu122共同形成了柱狀疏水空腔，且這8個氨基酸殘基對丙烯酰胺具有疏水作用，為β-乳球蛋白能與丙烯酰胺相互作用提供了證據(jù)。

2.3 不同氨基酸對丙烯酰胺的抑制

將圖3(c)中的四種氨基酸（Leu、Val、Ile、 Phe）樣品溶液按不同體積比例稀釋后與丙烯酰胺樣品溶液1∶1混合，配制成丙烯酰胺濃度為500 ng/mL、四種氨基酸濃度分別為0（對照組）、1 mg/mL的混合溶液，常溫下渦旋混勻后送入液質(zhì)聯(lián)用儀中檢測。

由圖4結(jié)果可知，四種氨基酸均對丙烯酰胺有抑制作用，其中Leu、Phe的抑制率最高，均在95%以上；其次是Ile，抑制率為90%；Val對丙烯酰胺抑制率最低，20 ℃下僅為29%。

圖4 不同種氨基酸對丙烯酰胺的抑制

3 結(jié)論

本文使用液質(zhì)聯(lián)用儀檢驗了不同濃度β-乳球蛋白對丙烯酰胺的抑制情況，并運用分子對接方法探究β-乳球蛋白與丙烯酰胺相互作用可能的結(jié)合位點與結(jié)合方式，為探究β-乳球蛋白與丙烯酰胺同時攝入時降低丙烯酰胺對人體負面影響的可能性提供了理論基礎(chǔ)。