鞏性濤 ，王 培 ，肖理文 ，宋永泉 ，徐 秀 ，趙 皖 ，王春霞

（1.山東省糧油檢測中心，濟(jì)南 250101；2.南京微測生物科技有限公司，南京 210000；3.山東省中儲糧糧油質(zhì)監(jiān)中心有限公司，濟(jì)南 250199）

嘔吐毒素主體成分為DON（deoxynivalenol,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇），屬于單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生。另外，頭孢菌屬、漆班菌屬、木霉屬等菌株都可產(chǎn)生該毒素。單端孢霉烯族毒素共有150多種，是一類強(qiáng)有力免疫抑制劑，其引起的典型癥狀是動物采食量降低，所以這類毒素又叫飼料拒食毒素。嘔吐毒素（DON）是其中最重要的一種毒素，主要來自鐮刀菌屬（Fusarium），尤其是禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）和黃色鐮刀菌（Fusariumculmorum）。由于它可引起豬的嘔吐，故又名嘔吐毒素（Vomitoxin，VT）[1-2]。

嘔吐毒素是食品中常見的真菌毒素，在自然界中廣泛存在，在歐洲及北美常見的3種毒素是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。在中國2018年白奧明原料與飼料霉菌毒素檢測報告顯示：玉米中嘔吐毒素是15-乙酰嘔吐毒素（被定義為霉菌毒素）出現(xiàn)最多，小麥中3-乙?；鶉I吐毒素、15-乙?；鶉I吐毒素、雪腐鐮刀菌烯醇出現(xiàn)頻率都很高。不管哪種類型嘔吐毒素都具有很高的細(xì)胞毒素及免疫抑制性質(zhì)，會對人類及動物的健康構(gòu)成威脅，特別是會對免疫功能造成明顯的影響。

根據(jù)DON的劑量和暴露時間的不同可引起免疫抑制或免疫刺激，當(dāng)人攝入了被DON污染的食物后，會導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)及反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時損害造血系統(tǒng)而造成死亡。嘔吐毒素DON對于糧谷類的污染狀況與產(chǎn)毒菌株、溫度、濕度、通風(fēng)、日照等因素有關(guān)，小麥赤霉病主要分布在潮濕的溫帶地區(qū)，中國小麥大部分產(chǎn)區(qū)恰恰處于這一地帶，這是中國嘔吐毒素污染較嚴(yán)重的原因之一，多雨年份尤其在收糧前多雨會導(dǎo)致DON污染狀況更嚴(yán)重，如2018年河南、江蘇、安徽、山東部分地區(qū)發(fā)生大面積嘔吐毒素污染。1998年在國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評價報告中，嘔吐毒素被列為3類致癌物；各國也制定了嚴(yán)格限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟要求糧食谷物及其制品中嘔吐毒素最高限量要小于1.0 mg/kg；GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中要求糧食谷物及其制品中嘔吐毒素的含量低于1.0 mg/kg，GB 13078.3-2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了配合飼料中嘔吐毒素的限量低于 1.0～5.0 mg/kg 不等[3-5]。

目前，國標(biāo)法測定嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物）采用HPLC法，此方法需要大型的儀器設(shè)備，設(shè)備價格昂貴，操作過程復(fù)雜、時間較長，且無法在現(xiàn)場和基層小型實(shí)驗(yàn)室使用。也有采用嘔吐毒素酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙卡等方法，此方法用于大量樣品的篩查，具有操作簡便，檢測快速，成本較低等優(yōu)點(diǎn)，但準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，容易造成假陽性或者假陰性。因此，針對快速檢測試紙卡存在的不足，山東省糧油檢測中心與南京微測生物科技有限公司對基于熒光定量免疫層析平臺的嘔吐毒素?zé)晒舛靠焖贆z測試紙卡進(jìn)行了產(chǎn)品的優(yōu)化升級，使之操作簡單快速、準(zhǔn)確性和重復(fù)性較高，且使用成本較進(jìn)口同類產(chǎn)品成本降低30%左右，能更好滿足不同客戶的日常檢測需求，確保糧食和食品安全[6-7]。

1 試劑、材料、儀器和方法

1.1 試劑和材料

除注明外，試劑均為分析純，試驗(yàn)用水均為國標(biāo)一級蒸餾水。

嘔吐毒素?zé)晒舛靠焖贆z測試紙卡由乳膠墊、NC膜、樣品墊及吸收墊組成，乳膠墊上包裹有熒光微球標(biāo)記嘔吐毒素DON抗體；NC膜上噴涂有嘔吐霉毒素DON抗原檢測線和噴涂有羊抗兔二抗控制線。樣品提取液、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡及標(biāo)準(zhǔn)曲線條形碼均由上海飛測生物科技有限公司提供。

嘔吐毒素的標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma公司；大米、玉米、小麥及面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)取樣；麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠、面粉加工廠和小麥?zhǔn)諆ζ髽I(yè)取樣。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-600型熒光免疫定量分析儀和FD-2000型試紙卡恒溫孵育器，由上海飛測生物科技有限公司提供生產(chǎn)；低速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；漩渦混勻器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平：Sartorius賽多利斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的前處理

取具有代表性的待測樣品500 g，用粉碎機(jī)粉碎1 min后過20目篩，收集過篩后的均勻細(xì)小樣品。稱取過篩后的樣品5.0±0.02 g于50 mL離心管中，加入25 mL提取液，用漩渦混勻器振蕩3 min(或者搖床振蕩3 min）后，4 000 r/min離心2 min，取上清液。

1.3.2 檢測過程

100 μL離心上清液加入1 000 μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3～5 s，然后取 100 μL待測液加入到嘔吐毒素?zé)晒舛吭嚰埧ǖ募訕涌字?，置?7℃恒溫孵育器中孵育8 min，8 min后將試紙卡插入熒光定量免疫分析儀中讀數(shù)，讀數(shù)值即為樣品的實(shí)際檢測濃度。當(dāng)檢測值大于5 000 μg/kg時，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再按照后續(xù)步驟進(jìn)行檢測，所得讀數(shù)值乘以5即為樣本最終的檢測濃度。

1.3.3 試紙卡原理

將待測樣品滴加在試紙卡加樣區(qū)時，樣品中的嘔吐毒素與結(jié)合墊中熒光微球標(biāo)記的嘔吐毒素抗體結(jié)合并通過毛細(xì)作用向前層析，到達(dá)檢測區(qū)后，檢測線T線上固定的嘔吐毒素抗原與剩余未結(jié)合的熒光微球標(biāo)記嘔吐毒素抗體結(jié)合。檢測線T線上結(jié)合的熒光微球標(biāo)記抗體的量與樣品中待測物的量成反比，質(zhì)控線C線結(jié)合的熒光標(biāo)記物與樣品中待測物的量無關(guān)，剩余或其它熒光標(biāo)記物繼續(xù)層析達(dá)到吸收區(qū)。反應(yīng)結(jié)束后，使用熒光定量免疫分析儀讀取T線和C線的熒光強(qiáng)度并計算T/C值，通過儀器內(nèi)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出樣品中嘔吐毒素的含量。

1.3.4 試紙卡優(yōu)化

在單T線的基礎(chǔ)上，增加一條矯正T線，形成質(zhì)控線C線一條、檢測線T線兩條的方式。

2 檢測結(jié)果分析

2.1 嘔吐毒素試紙卡檢測線數(shù)量由兩線優(yōu)化成三線的實(shí)驗(yàn)

選用國標(biāo)法測定嘔吐毒素濃度值為空白的樣本中分別添加嘔吐毒素的濃度為 100、250、500、1000、2 500、5 000 μg/kg，然后按照嘔吐毒素試紙卡檢測方法同時進(jìn)行兩線及三線試紙卡檢測，每個加標(biāo)樣本各檢測2個平行樣，對比試紙卡的靈敏度，檢測結(jié)果見表1；選取高中低3個加標(biāo)濃度點(diǎn)，每個加標(biāo)樣本檢測6個平行樣，對比試紙卡的重復(fù)性 ，檢測結(jié)果見表2。

從表1可知，嘔吐毒素三線試紙卡的100 μg/kg檢測靈敏度為34.79%；兩線試紙卡的100 μg/kg檢測靈敏度為23.32%；從單一100 μg/kg濃度點(diǎn)檢測靈敏度對比，三線試紙卡靈敏度更高；且綜合對比不同濃度點(diǎn)的檢測靈敏度，也得出嘔吐毒素三線試紙卡靈敏度較兩線試紙卡更高。

表1 嘔吐毒素兩線與三線試紙卡的靈敏度 濃度單位：μg/kg

從表2可知，篩選高中低三個濃度點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)性檢測，嘔吐毒素三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍為4.36%～9.60%；兩線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍為5.55%～12.69%；對比三線試紙卡與兩線試紙卡的檢測變異系數(shù)CV范圍，三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV更小，重復(fù)性更高。

表2 嘔吐毒素兩線與三線試紙卡的重復(fù)性 濃度單位：μg/kg

綜合嘔吐毒素三線試紙卡與兩線試紙卡的靈敏度與重復(fù)性對比，嘔吐毒素三線試紙卡比兩線試紙卡靈敏度、重復(fù)性更高。

2.2 檢測線數(shù)量為三線的嘔吐毒素試紙卡性能檢測

2.2.1 嘔吐毒素試紙卡的檢出限及定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用國標(biāo)法測定嘔吐毒素濃度值為空白的樣本20份，然后按照嘔吐毒素試紙卡檢測方法進(jìn)行檢測，每個樣本檢測1個試紙卡。檢測結(jié)果見表3。

由表3中檢測數(shù)據(jù)分析可知：嘔吐毒素試紙卡的檢出限為 27.543 μg/kg；定量限為 65.676 μg/kg。

表3 嘔吐毒素試紙卡的檢出限及定量限 濃度單位：μg/kg

2.2.2 嘔吐毒素試紙卡的檢測范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用國標(biāo)法測定嘔吐毒素濃度值為空白的樣本中分別添加嘔吐毒素的濃度為 100、250、500、1000、2500、5 000 μg/kg，然后按照嘔吐毒素試紙卡檢測方法進(jìn)行檢測，每個加標(biāo)樣本各檢測2個平行樣。檢測結(jié)果見表4。

通過表4的檢測數(shù)據(jù)可知，在空白樣本中添加嘔吐毒素的濃度為100 μg/kg時，檢測靈敏度為33.84%，與空白樣本檢測存在梯度差；陰性樣本加標(biāo)濃度從100～5 000 μg/kg時，檢測靈敏度范圍為33.84%～94.61，且不同濃度點(diǎn)檢測抑制率分散率較好，因此嘔吐毒素可定量檢測的范圍為100～5 000 μg/kg。

表4 嘔吐毒素試紙卡的檢測范圍 濃度單位：μg/kg

2.2.3 嘔吐毒素試紙卡的準(zhǔn)確度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用國標(biāo)法測定嘔吐毒素濃度值為空白的樣本中分別添加嘔吐毒素濃度為 100、250、500、1 000、2500、5 000 μg/kg，然后按照嘔吐毒素?zé)晒舛吭嚰埧ǖ臋z測方法進(jìn)行檢測，每個加標(biāo)樣本各檢測3個平行樣。檢測結(jié)果見表5。

通過表5可知，大米樣本的加標(biāo)回收率為88.83%～117.70%；玉米樣本的加標(biāo)回收率為86.50%～120.68%；小麥樣本的加標(biāo)回收率為87.08%～111.28%；綜合三種不同基質(zhì)樣本加標(biāo)檢測回收率范圍為86.50%～120.68%，說明樣本加標(biāo)檢測回收率高，嘔吐毒素試紙卡檢測準(zhǔn)確度較高；

表5 嘔吐毒素試紙卡的準(zhǔn)確度和重復(fù)性 濃度單位：μg/kg

大米樣本的變異系數(shù)CV范圍為4.00%～10.10%；玉米樣本的重變異系數(shù)CV范圍為1.59%～12.64%，小麥樣本的變異系數(shù)CV范圍為5.51%～11.99%；綜合三種不同基質(zhì)樣本加標(biāo)檢測變異系數(shù)CV范圍為1.59%～12.648%，說明嘔吐毒素試紙卡整體變異系數(shù)CV較小，試紙卡重復(fù)性較好。

2.2.4 嘔吐毒素試紙卡的穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將嘔吐毒素檢測樣本放在2～10℃環(huán)境下保存，并在每個月固定日期進(jìn)行樣本檢測，篩選固定不同基質(zhì)已知不同濃度值樣本（德國拜發(fā)質(zhì)控物）用于試紙卡穩(wěn)定性檢測，每個樣本檢測1個試紙卡，檢測結(jié)果見表6。

通過表6數(shù)據(jù)可知，嘔吐毒素試紙卡在2～10℃保存8個月，不同基質(zhì)樣本檢測偏差范圍為-7.66%～10.97%，說明嘔吐毒素試紙卡在2～10℃溫度8個月的保存整體偏差在±11%以內(nèi)，說明產(chǎn)品的穩(wěn)定性較好。

表6 嘔吐毒素試紙卡的穩(wěn)定性 濃度單位：μg/kg

2.3 設(shè)備與產(chǎn)品優(yōu)化后進(jìn)行玉米粉中嘔吐毒素不同單位驗(yàn)證檢測

驗(yàn)證單位1：山東省糧油檢測中心；驗(yàn)證單位2：中儲糧山東分公司質(zhì)檢中心實(shí)驗(yàn)室；驗(yàn)證單位3：江蘇省糧油質(zhì)量監(jiān)測中心。

通過表7～表15的計算分析可知，三家驗(yàn)證單位檢測結(jié)果平均值也符合國家標(biāo)準(zhǔn)適用性要求，說明設(shè)備與產(chǎn)品穩(wěn)定性較好。

表7 檢出限與定量限 （單位：μg/kg）：玉米基質(zhì)

表8 濃度水平1準(zhǔn)確性結(jié)果 （單位：μg/kg）：玉米基質(zhì)

表9 濃度水平2準(zhǔn)確性結(jié)果 （單位：μg/kg）：玉米基質(zhì)

表10 濃度水平3準(zhǔn)確性結(jié)果 （單位：μg/kg）：玉米基質(zhì)

表11 濃度水平1臺間差結(jié)果 （單位：μg/kg）：玉米基質(zhì)

表12 濃度水平2臺間差結(jié)果 （單位：μg/kg）：玉米基質(zhì)

表13 濃度水平3臺間差結(jié)果 （單位：μg/kg）：玉米基質(zhì)

表14 濃度水平2重復(fù)性結(jié)果 （單位：μg/kg）：玉米基質(zhì)

表15 儀器性穩(wěn)定結(jié)果 單位：μg/kg

2.4 優(yōu)化試紙卡與其它產(chǎn)品檢測對比

通過表16中優(yōu)化產(chǎn)品同國外知名品牌產(chǎn)品對同一樣本檢測數(shù)據(jù)對比，優(yōu)化產(chǎn)品回收率為99.50%，國外知名品牌產(chǎn)品回收率為82.27%；優(yōu)化產(chǎn)品變異系數(shù)CV為3.21%，國外知名品牌產(chǎn)品回收率為13.07%，從樣本值檢測回收率與變異系數(shù)CV數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化產(chǎn)品檢測效果優(yōu)于進(jìn)口產(chǎn)品，說明可以替代進(jìn)口產(chǎn)品。

表16 優(yōu)化產(chǎn)品與進(jìn)口產(chǎn)品脫氧雪腐鐮刀菌稀醇質(zhì)控品檢測結(jié)果 單位：μg/kg

3 結(jié)論

從嘔吐毒素?zé)晒舛吭嚰埧ㄈ€與兩線的靈敏度、不同濃度點(diǎn)梯度與重復(fù)性等的檢測數(shù)據(jù)對比可知，三線試紙卡靈敏度更高；不同濃度點(diǎn)分布更合理，且三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍更小，重復(fù)性更高。通過對三線試紙卡檢測限、檢測范圍、不同基質(zhì)樣本重復(fù)、穩(wěn)定性等檢測驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，優(yōu)化后三線試紙卡的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等均達(dá)到更優(yōu)的效果，更能滿足快速定量檢測需求。另外熒光定量免疫分析儀根據(jù)儀器穩(wěn)定性要求檢測鑒定結(jié)果可知，儀器穩(wěn)定性好且兩臺設(shè)備的測定結(jié)果之間不存在顯著性差異，完全可以替代同類型進(jìn)口儀器。

從產(chǎn)品性能上綜合評價，普通免疫層析快檢產(chǎn)品通常采用單檢測線（T線）定量方法，雖然產(chǎn)品研發(fā)周期短，生產(chǎn)工藝簡單，成本也低，但檢測結(jié)果的精密度難以控制，導(dǎo)致結(jié)果的重復(fù)性較差。嘔吐毒素?zé)晒舛靠焖贆z測試紙卡在單T線的基礎(chǔ)上，增加一條矯正T線，與質(zhì)控線（C線）一起，形成“雙保險”，大大提升了檢測結(jié)果準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性。