夏 燕，劉 露，林丹換，張夢(mèng)莉，練 冰，覃春容

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518000）

近年來(lái)，隨著人工流產(chǎn)術(shù)、清宮術(shù)等宮腔操作的增加，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎及子宮內(nèi)膜過(guò)薄等情況逐年增多。子宮內(nèi)膜過(guò)薄可導(dǎo)致不孕及胚胎反復(fù)種植失敗（recurrent implantation failure，RIF）。由于子宮內(nèi)膜損傷及損傷后修復(fù)過(guò)程的人體組織標(biāo)本不易獲得，因此對(duì)子宮內(nèi)膜損傷方面的研究多局限于對(duì)超聲檢查獲取的影像學(xué)資料進(jìn)行研究。子宮內(nèi)膜損傷動(dòng)物模型的建立，成為研究子宮內(nèi)膜損傷與修復(fù)的可行工具與方法，可為探索子宮內(nèi)膜損傷的可能病因、子宮內(nèi)膜的修復(fù)機(jī)制及促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)再生、改善妊娠結(jié)局等找到一個(gè)更為合理的研究載體。本研究利用不同濃度的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對(duì)大鼠進(jìn)行宮腔灌注，嘗試構(gòu)建更符合子宮內(nèi)膜損傷條件的大鼠子內(nèi)膜損傷動(dòng)物模型并驗(yàn)證造模是否成功，為下一步子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)機(jī)制的研究提供條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

性成熟、未交配的特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雌性SD大鼠（由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）24只，其周齡為6～8周齡，體重為220～260 g。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)展。對(duì)這些大鼠進(jìn)行常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每周在固定時(shí)間對(duì)其進(jìn)行陰道涂片檢查，觀察其動(dòng)情周期。

1.2 試劑及儀器

LPS（由Sigma公司生產(chǎn)），生理鹽水（由山東華魯制藥有限公司生產(chǎn)），正置顯微鏡（由0lympus 公司生產(chǎn)），組織脫水機(jī)（由湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)），石蠟包埋機(jī)（由湖北泰維科技視野有限公司生產(chǎn)），石蠟切片機(jī)（由徠卡公司生產(chǎn)），IMS圖像分析系統(tǒng)（由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)） ，PBS緩沖液（由無(wú)錫傲銳東源生物科技有限公司生產(chǎn)），10%的中性福爾馬林（由Solarbio公司生產(chǎn)），無(wú)水乙醇（由上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)），二甲苯（由上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)），蘇木素（由BASO公司生產(chǎn)），伊紅（由BASO公司生產(chǎn)），石蠟（由Leica公司生產(chǎn)）。

1.3 分組及動(dòng)物模型構(gòu)建

將24只SD大鼠分為L(zhǎng)PS 10 mg/mL組、LPS 20 mg/mL組（合稱(chēng)為L(zhǎng)PS處理組大鼠）和對(duì)照組，每組各有8只大鼠。讓三組大鼠禁食12～14 h后，用10%的水合氯醛對(duì)其實(shí)施麻醉。麻醉起效后，固定大鼠，使其腹部朝上。將細(xì)軟管針輕輕插入大鼠的陰道內(nèi)，分別向LPS 10 mg/mL組、LPS 20 mg/mL組和對(duì)照組大鼠的宮腔內(nèi)注入100 μL濃度為10 mg/mL的LPS、濃度為20 mg/mL的LPS和生理鹽水，完成建模操作。待三組大鼠清醒后，將其放回籠內(nèi)進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)及持續(xù)觀察。建模完成后48 h，將大鼠處死，取其血清及子宮。將每只大鼠的Y型子宮分成2份備用，將其中一份子宮浸泡于4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定。對(duì)子宮標(biāo)本進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，采用IMS圖像分析系統(tǒng)測(cè)量三組大鼠子宮內(nèi)膜的厚度。在光鏡下觀察三組大鼠子宮內(nèi)膜的厚度、腺體和血管的分布情況、各層細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變等。對(duì)三組大鼠的子宮標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，觀察CK19和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在子宮內(nèi)膜及基層等部位的表達(dá)情況。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察造模后三組大鼠的一般情況（包括體重、子宮的外觀、形態(tài)等）。觀察造模后三組大鼠子宮的組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及子宮組織中CK19和TNF-α的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 8軟件對(duì)本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，各組動(dòng)物的體重等實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后三組大鼠的一般情況

造模后，三組大鼠的體重?zé)o明顯差異（詳見(jiàn)圖1）。造模前對(duì)三組大鼠進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，其子宮外觀呈粉紅色，粗細(xì)均勻，有彈性和光澤。造模后，LPS處理組大鼠的子宮發(fā)白，質(zhì)地變硬，對(duì)照組大鼠子宮的顏色及形態(tài)無(wú)明顯變化。

圖1 造模后三組大鼠體重的比較

2.2 造模后三組大鼠子宮的組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

造模后，與對(duì)照組大鼠相比，LPS處理組大鼠的子宮內(nèi)膜層明顯變薄，宮腔腔隙增大，與肌層界限不清楚；其子宮內(nèi)膜上皮和腺上皮細(xì)胞扁平化，內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)充血水腫，腺體數(shù)量明顯減少；LPS 20 mg/mL組大鼠子宮內(nèi)膜層變薄尤為明顯。詳見(jiàn)圖2。

圖2 造模后三組大鼠子宮的組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

2.3 造模后三組大鼠子宮組織中CK19和TNF-α的表達(dá)情況

CK19在正常大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)。造模后，對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的CK19呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在子宮肌層中也有表達(dá)，但主要以?xún)?nèi)膜上皮細(xì)胞表達(dá)為主；LPS處理組大鼠子宮內(nèi)膜上皮的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，其子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中CK19的表達(dá)弱于對(duì)照組大鼠，且CK19在子宮肌層中的表達(dá)也弱于對(duì)照組大鼠；隨著LPS劑量的增大，大鼠子宮內(nèi)膜損傷破壞程度逐漸加劇，其子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中CK19的表達(dá)逐漸越低。造模后，對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)較為完整，其子宮內(nèi)膜和肌層中TNF-α的表達(dá)水平較低；LPS處理組大鼠的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)不同程度的損傷，TNF-α在其子宮內(nèi)膜和肌層中均有表達(dá)；隨著LPS誘導(dǎo)劑量的加大，大鼠子宮內(nèi)膜和肌層中TNF-α的表達(dá)水平逐漸升高；LPS處理組大鼠子宮內(nèi)膜和肌層中TNF-α的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組大鼠。詳見(jiàn)圖3。

圖3 造模后三組大鼠子宮組織中CK19和TNF-α的表達(dá)情況

3 討論

子宮內(nèi)膜炎、宮腔粘連、子宮疤痕、子宮內(nèi)膜過(guò)薄、子宮內(nèi)膜血供減少等子宮病變被臨床上認(rèn)為是引起RIF的主要因素之一。上述子宮病變可直接影響受精卵的著床及輔助生殖過(guò)程中孕卵移植的成功率。研究指出，子宮內(nèi)膜過(guò)薄是導(dǎo)致部分育齡女性不孕的原因之一，而RIF是影響輔助生殖技術(shù)成功率的重要因素。單純子宮內(nèi)膜過(guò)薄患者和RIF患者都會(huì)因子宮內(nèi)膜的容受性下降、子宮內(nèi)膜局部血供減少而影響胚胎的著床，進(jìn)而可導(dǎo)致其不孕。目前，通過(guò)改善子宮內(nèi)膜的修復(fù)機(jī)制增加子宮內(nèi)膜的血供，進(jìn)而改善子宮內(nèi)膜容受性的方法尚未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究已嘗試建立子宮內(nèi)膜損傷研究的動(dòng)物模型（所選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要有大鼠、小鼠、新西蘭兔、恒河猴等，造模方法有機(jī)械性損傷法、化學(xué)損傷法、熱損傷法、感染性損傷法、缺血性損傷法、電磁波損傷法及聯(lián)合損傷法等），但尚未獲得相對(duì)可靠的動(dòng)物模型，且尚無(wú)針對(duì)子宮內(nèi)膜損傷程度及子宮內(nèi)膜損傷動(dòng)物模型預(yù)后的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)階段，建立單純薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型的方法主要為高濃度乙醇宮腔注射損傷法[1]，也有學(xué)者通過(guò)熱損傷法建立薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型[2]。有研究通過(guò)宮腔放置銅絲和機(jī)械搔刮造成的雙重?fù)p傷構(gòu)建新西蘭兔宮腔粘連模型[3]、小鼠子宮內(nèi)膜損傷粘連模型[4-5]等多種動(dòng)物模型。本課題采用LPS宮腔灌注誘導(dǎo)法建立大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型[6]，效果顯著，建模時(shí)間和LPS的用量均可控。該方法較細(xì)菌感染法、電損傷法等建模方法有明顯優(yōu)勢(shì)[7]。大鼠的子宮由外至內(nèi)可分為漿膜層、肌層和內(nèi)膜層，其中內(nèi)膜層最厚。大鼠子宮的組織結(jié)構(gòu)與人類(lèi)相似，均由不同作用的功能層和基底層組成，故本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠進(jìn)行造模。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，LPS可有效地誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜損傷，LPS的最佳誘導(dǎo)劑量為20 mg/mL。LPS可作為一種損傷誘導(dǎo)劑成功構(gòu)建大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型。