陳昭琳，方 焱，程 希，馮曉俊，張 蕾,2，唐麗琴

腎移植是終末期腎功能衰竭病人最有效的治療手段[1-2]。術(shù)后免疫抑制劑的安全合理應(yīng)用對(duì)于腎移植病人至關(guān)重要，成為影響病人生存率的重要因素[1-2]。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑他克莫司作為腎移植術(shù)后應(yīng)用最廣泛的免疫抑制劑，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用[3-4]。但由于他克莫司治療窗窄、藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異較大，腎移植術(shù)后病人即使到穩(wěn)定期也須定期隨訪，且他克莫司給藥劑量要根據(jù)治療藥物監(jiān)測(cè)(therapeutic drug monitoring,TDM)的結(jié)果不斷調(diào)整，以期達(dá)到有效治療濃度范圍[3]。導(dǎo)致他克莫司藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異的影響因素很多，其中遺傳因素為重要原因之一[5]。白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)是重要的強(qiáng)免疫抑制因子，能夠抑制和終止體內(nèi)的炎癥反應(yīng)[6-7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，IL-10啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)可能影響CYP3A的活性，從而影響肝移植術(shù)后早期他克莫司的體內(nèi)代謝過(guò)程。另外，CYP3A5 6986 A/G是CYP3A5最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，對(duì)酶活性起重要作用，目前已有明確結(jié)論證明他克莫司血藥濃度與其基因多態(tài)性相關(guān)[9-10]。考慮到IL-10和CYP3A5在他克莫司體內(nèi)代謝過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，本研究擬檢測(cè)腎移植術(shù)后穩(wěn)定期病人IL-10和CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)他克莫司血藥濃度/劑量比(dose-adjusted trough blood concentrations,C0/D)的影響，從而為他克莫司個(gè)體化給藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2019年1月至2020年8月中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)進(jìn)行隨訪且病情穩(wěn)定并長(zhǎng)期服用他克莫司的腎移植病人149例。復(fù)診病人均采用他克莫司+嗎替麥考酚酯+糖皮質(zhì)激素三聯(lián)免疫療法。他克莫司的劑量為0.10～0.15 mg·kg-1·d-1，一天2次。該研究已經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人均知情同意。登記病人相關(guān)信息，包括性別、年齡、體質(zhì)量、身高、服藥劑量、肝腎功能、血常規(guī)等指標(biāo)。

1.2 試劑與儀器 核酸提取及純化試劑盒(滬松械備20190039號(hào)，上海百傲科技股份有限公司)，KASP V4.0 2×Mastermix 1536和KASP V4.0 2×Mastermix 96/384(LGC基因組學(xué)有限公司)，全血免疫抑制劑質(zhì)控物(伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)有限公司)，他克莫司全血預(yù)處理試劑盒和測(cè)定試劑盒(美國(guó)雅培公司)，高通量微樣品處理系統(tǒng)(Nexar，美國(guó)Douglas Scientific)，高通量 PCR 儀(Soellex，美國(guó)Douglas Scientific)，高通量掃描儀(Araya，美國(guó)Douglas Scientific)，Array Tape 專用離心機(jī)(Allegra-6，美國(guó)Douglas Scientific)，Array Tape計(jì)數(shù)器(Winder/Counter，美國(guó)Douglas Scientific)，熒光信號(hào)閱讀儀(Omega，英國(guó)LGC)，酶標(biāo)儀(synergy H1M，Biotek，美國(guó)伯騰儀器有限公司)，雅培免疫熒光儀(i1000SR，美國(guó)雅培公司)，高速臺(tái)式離心機(jī)(H1650-W，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.3 他克莫司血藥谷濃度測(cè)定及C0/D 采集腎移植術(shù)后穩(wěn)定期病人清晨空腹靜脈血3 mL置于EDTA抗凝管中，按照他克莫司全血預(yù)處理試劑盒處理，取200 μL 血樣置于1.5 mL離心管中，加入200 μL他克莫司全血沉淀劑，渦旋混勻后置于高速離心機(jī)上離心(15 000 r/min，5 min)。將離心后的上清液直接上機(jī)(i1000SR)檢測(cè)他克莫司全血谷濃度C0。計(jì)算C0/D，即血藥谷濃度除以每日每千克體質(zhì)量的他克莫司劑量。

1.4 DNA提取 將上述采集剩余的腎移植術(shù)后穩(wěn)定期病人清晨空腹靜脈血2 mL，于-80 ℃保存，用于DNA提取。按照核酸提取及純化試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取外周血基因組DNA。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 KASP為競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR，一個(gè)KASP標(biāo)記含有3條引物，即FAM、VIC和COM引物，F(xiàn)AM和VIC引物為上游引物，COM引物為下游引物。IL-10-819 C/T的FAM引物序列為5′-ACC TAC CTT CTC CAT GCT ACC G-3′，VIC引物序列為5′-CAC CTA CCT TCT CCA TGC TAC CA-3′，COM引物序列為5′-TCC TCA GAG GGA TCA CTT GTG ACA T-3′；IL-10-592 C/A的FAM引物序列為5′-CAG AGA CTG GCT TCC TAC AGG-3′，VIC引物序列為5′- CCA GAG ACT GGC TTC CTA CAG T-3′，COM引物序列為5′-GAG GTG GAA ACA TGT GCC TGA GAA T-3′；IL-10-1082 C/T的FAM引物序列為5′-CAC TAC TAA GGC TTC TTT GGG AG-3′，VIC引物序列為5′- AAC ACT ACT AAG GCT TCT TTG GGA A-3′，COM引物序列為5′-GAG GTC CCT TAC TTT CCT CTT ACC TA-3′；CYP3A5 6986 A/G的FAM引物序列為5′-GTG GTC CAA ACA GGG AAG AGA TAT-3′，VIC引物序列為5′-GGT CCA AAC AGG GAA GAG ATA C-3′，COM引物序列為5′-ACC ACC CAG CTT AAC GAA TGC TCT A-3′。引物由Thermofisher公司設(shè)計(jì)合成。

1.6 基因多態(tài)性檢測(cè) 采用KASP法對(duì)病人進(jìn)行IL-10-819 C/T、-592 C/A、-1082 G/A和CYP3A5 6986 A/G基因分型。DNA質(zhì)檢后稀釋，按照如下PCR實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行。PCR反應(yīng)成分有DNA、Master mix、引物Mix和H2O。Master mix是由FAMTM和HEXTM特殊熒光共振能量轉(zhuǎn)移基團(tuán)，經(jīng)過(guò)修飾的Taq酶，有效擴(kuò)增等位特異堿基。引物Mix由兩條等位特異引物和一條通用引物。PCR反應(yīng)體系為3 μL，其中DNA 1.5 μL，2×Master mix 0.75 μL，引物Mix 0.0417 μL，H2O 0.75 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?1)變性94 ℃ 15 min；(2)變性94 ℃ 20 s，退火/延伸61～55 ℃ 60 s梯度退火(每個(gè)循環(huán)降低0.6 ℃)，10個(gè)循環(huán)；(3)變性94 ℃ 20 s，退火/延伸55 ℃ 60 s，26個(gè)循環(huán)；(4)變性94 ℃ 20 s，退火/延伸57 ℃ 60 s，3個(gè)循環(huán)。采用熒光信號(hào)閱讀儀將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榭煞治龅臄?shù)據(jù)；對(duì)IL-10-819 C/T、-592 C/A、-1082 G/A和CYP3A5 6986 A/G進(jìn)行基因分型。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析、q檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床基本資料 本研究149例腎移植隨訪病人中，男59例(39.60%)，女90例(60.40%)，年齡12～62歲，身高(165.03±8.44)cm，體質(zhì)量(55.76±11.53)kg，術(shù)后隨訪時(shí)間約為1～4年，白細(xì)胞計(jì)數(shù)(9.24±3.28)×109/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(4.58±0.70)×1012/L，總蛋白(71.57±4.58)g/L，血紅蛋白量(132.62±22.94)g/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(19.28±11.89)IU/L，天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(18.93±8.21)IU/L，堿性磷酸酶(78.47±34.85)IU/L，總膽紅素(12.92±4.89)mmol/L，尿素(7.72±3.64)mmol/L，肌酐(92.58±29.90)μmol/L。

2.2 IL-10和CYP3A5基因型和基因頻率分布 IL-10和CYP3A5基因型與等位基因分布頻率見(jiàn)表1。149例腎移植穩(wěn)定期病人中，IL-10-819 TT、TC和CC基因型病人分別為68例(45.64%)、65例(43.62%)和16例(10.74%)，等位基因突變率為67.45%。IL-10-592 AA、CA和CC基因型病人分別為15例(10.07%)、63例(42.29%)和71例(47.65%)，等位基因突變率為31.21%。IL-10-1082 AA和GA基因型病人分別為125例(83.89%)和24例(16.11%)，等位基因突變率為61.30%。CYP3A5 6986 GG、GA和AA基因型病人分別為72例(48.32%)、70例(46.98%)和7例(4.70%)，等位基因突變率為71.81%。IL-10-819 C/T、-592 C/A、-1082 G/A和CYP3A5 6986 A/G的基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05 )，表明該研究資料具有群體代表性。

表1 IL-10和CYP3A5的基因型頻率和等位基因頻率

2.3 IL-10和CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)他克莫司C0/D的影響 對(duì)于IL-10-819 C/T基因型，突變純合TT型病人他克莫司C0/D均高于突變雜合TC與野生CC型病人(P<0.01)；CYP3A5 6986 A/G突變純合GG型病人他克莫司C0/D更高，且明顯高于其突變雜合GA與野生AA型病人(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2 IL-10和CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)他克莫司C0/D值的影響

本研究繼續(xù)將IL-10-819 C/T基因型對(duì)他克莫司C0/D的影響按照CYP3A5基因型的不同分別統(tǒng)計(jì)。CYP3A5有活性組(GA/AA型，n=77)中IL-10-819-TC型病人35例(45.45%)，CC病人8例(10.39%)，IL-10-819 TT型病人34例(44.16%)。CYP3A5無(wú)活性組(GG型，n=72)中IL-10-819 TC型病人29例(40.28%)，CC病人8例(11.11%)，IL-10-819 TT型病人35例(48.61%)。IL-10-819基因多態(tài)性對(duì)CYP3A5有活性組和CYP3A5無(wú)活性組病人的他克莫司C0/D的影響見(jiàn)表3。對(duì)于CYP3A5有活性組，IL-10-819 TT型病人的他克莫司C0/D明顯高于TC/CC型病人(P<0.05)。在CYP3A5無(wú)活性組，IL-10-819 TT型病人的他克莫司C0/D與TC/CC型病人差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。比較發(fā)現(xiàn)，CYP3A5無(wú)活性組協(xié)同IL-10-819 TT型病人他克莫司C0/D最高，而CYP3A5有活性組協(xié)同IL-10-819 TC/CC型病人他克莫司C0/D最低(P<0.05)。

表3 IL-10聯(lián)合CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)他克莫司C0/D值的影響

3 討論

他克莫司是腎移植術(shù)后免疫抑制劑聯(lián)合治療方案中的基礎(chǔ)藥物，其合理使用對(duì)于腎移植病人的長(zhǎng)期生存率具有重要的意義[4,11]。他克莫司主要通過(guò)肝臟 CYP3A色素酶代謝，近年來(lái)大量藥物基因組學(xué)研究證實(shí)他克莫司在體內(nèi)的藥物濃度和清除率與編碼酶活性的基因多態(tài)性相關(guān)，而CYP3A5 rs776746是唯一被公認(rèn)的影響他克莫司的遺傳因素[5]。

CYP3A5 6986 A/G是CYP3A5最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，CYP3A5 6986 GG型不能表達(dá)有酶活性CYP3A5蛋白，因此表現(xiàn)為慢他克莫司代謝性[12]。在體外研究中也發(fā)現(xiàn)，CYP3A5 6986 GG型個(gè)體比GA、AA型個(gè)體他克莫司的代謝慢[13]。HUANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)CYP3A5 6986 GG型是影響他克莫司藥動(dòng)學(xué)的重要因素。本研究對(duì)腎移植術(shù)后時(shí)間超過(guò)1年以上的149例穩(wěn)定期病人的CYP3A5基因型進(jìn)行分析，結(jié)果表明，CYP3A5 6986基因存在多態(tài)性分布，6986基因突變率為71.81%。6986 GA/AA基因型病人的他克莫司C0/D明顯低于6986 GG型，提示若想要達(dá)到相同的他克莫司靶濃度，GG基因攜帶者所需的日劑量更低，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[15-16]。

腎移植術(shù)后機(jī)體一系列病理生理學(xué)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，其中包括內(nèi)環(huán)境紊亂、免疫激活等，而這些因素會(huì)激活機(jī)體炎癥反應(yīng)體系進(jìn)而產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子[17]。IL-10是一種Th2型強(qiáng)免疫抑制細(xì)胞因子，在腎移植術(shù)后早期反應(yīng)性升高[17]。有研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，IL-10的基因多態(tài)性影響IL-10分泌水平。IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)位點(diǎn)SNP，與 IL-10 基因的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)，其中IL-10基因-819 C/T、-592 C/A和-1082 G/A位點(diǎn)是目前的研究熱點(diǎn)[20]。有關(guān)IL-10基因多態(tài)性與他克莫司代謝差異影響的研究不多，且結(jié)果各不一致，目前還未有定論。LI等[21]的研究納入104例肝移植病人，測(cè)定CYP3A5、MDR1和 IL-10基因多態(tài)性對(duì)他克莫司血藥濃度的影響，研究結(jié)果顯示在移植后21 d內(nèi)受體IL-10 G-1082A與他克莫司C0/D密切相關(guān)(IL-10-1082 GG

綜上所述，腎移植術(shù)后穩(wěn)定期IL-10-819 C/T和CYP3A5 6986 A/G基因多態(tài)性對(duì)他克莫司C0/D有影響，且IL-10-819 TT型對(duì)CYP3A5 6986 GG型病人的他克莫司C0/D影響最大。此項(xiàng)研究結(jié)果為優(yōu)化臨床個(gè)體化用藥方案，提高臨床療效，降低不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生提供了一定的參考證據(jù)和理論支持。然而，本研究納入的樣本量較小，他克莫司C0/D可能還受到其他基因型如ABCB1基因型的影響，故本研究有待于進(jìn)一步的研究。因此后續(xù)我們需要擴(kuò)大樣本量，通過(guò)多基因多因素的研究深入探討。