吳燕瑜，齊俊南

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

銀屑病是一種以斑塊、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性皮膚病，其主要發(fā)病機(jī)制為表皮的過(guò)度增厚及免疫反應(yīng)［1］。本病主要分為尋常型、關(guān)節(jié)型、膿皰型、紅皮型四型，而尋常型銀屑病發(fā)病率占90%以上［2］。近年來(lái)，隨著中成藥的應(yīng)用，不僅拓寬了治療銀屑病的思路，也使銀屑病的治療效果得到了提高。丹紅注射液是丹參和紅花的提取物［3］，據(jù)中醫(yī)理論，丹參和紅花在活血化瘀通絡(luò)方面是相須為用的，二者聯(lián)合應(yīng)用加強(qiáng)了活血化瘀的作用，因此，丹紅注射液廣泛應(yīng)用于心腦血管等疾?。?-6］。針對(duì)其涼血活血的功效，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究丹紅注射液治療銀屑病的作用機(jī)制。

1 方法

1.1 藥物成分檢索及收集

通過(guò)使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/index.php）分別檢索“丹參”“紅花”，設(shè)定閾值為OB（口服生物利用度）≥30%，DL（化合物類藥性）≥0.18，篩選并收集兩個(gè)藥物的有效成分。

1.2 活性化合物標(biāo)靶蛋白的篩選

使用PubChem 有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找活性化合物的2D結(jié)構(gòu)圖，將化合物的2D 結(jié)構(gòu)圖導(dǎo)入Swisstargetprediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶標(biāo)蛋白檢索，物種選擇為智人（Homo sapiens）。

1.3 疾病靶點(diǎn)的篩選

使用Gencards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）等數(shù)據(jù)庫(kù)，以“psoriasis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，檢索銀屑病的相關(guān)基因。

1.4 基因名稱的標(biāo)準(zhǔn)化以及化合物-基因靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)查詢靶標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)化名稱，將藥物化合物、靶標(biāo)基因?qū)隿ytoscape 3.8.0 軟件中構(gòu)建藥物-化合物-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并分析化合物與靶點(diǎn)之間的度值。

1.5 交集基因的篩選及其蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將丹參和紅花的基因靶點(diǎn)和銀屑病的基因靶點(diǎn)輸入在線作圖工具（venny 2.1，https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）查找藥物化合物與銀屑病的交集基因。將得到的核心蛋白基因?qū)氲絪tring 在線作圖軟件，獲取蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 核心靶點(diǎn)的通路分析

把選定的丹參、紅花對(duì)治療銀屑病的核心靶基因?qū)?DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），對(duì)所有靶基因進(jìn)行官方名稱（official gene symbol）校正；設(shè)定清單類型為基因列表（Gene List），物種設(shè)置為智人（Homo sapiens）。對(duì)BP（Biological process）生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行富集分析，在 Pathways 模塊中進(jìn)行基于京都基因與基因百科全書（KEGG）代謝通路富集分析，設(shè)定閾值為P＜0.05。并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入繪圖網(wǎng)站 Omishare Tools（http：//www.omicshare.com/tools/Home/Index/index.html）將數(shù)據(jù)結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性化合物的篩選

從TCMSP 平臺(tái)中檢索丹參、紅花共得到化合物113 個(gè)（丹參202 個(gè)、紅花189 個(gè)）化合物，經(jīng)過(guò)篩選后得到有效活性化合物87 個(gè)，通過(guò)檢索這87 個(gè)活性成分的蛋白靶點(diǎn)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入cytoscape 3.8.0 軟件中使用network analysis 工具進(jìn)行度值計(jì)算，選取degree 值≥9 的共46 個(gè)活性成分進(jìn)行分析。詳見表1。

表1 丹紅注射液活性成分表

2.2 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選出的46 個(gè)活性化合物（其中有兩個(gè)未獲取到基因靶點(diǎn)），整理得到基因靶點(diǎn)共228 個(gè)，利用Cytoscape 軟件構(gòu)建丹紅注射液藥物-成分-靶點(diǎn)圖，共有節(jié)點(diǎn)275 個(gè)，共1 223 個(gè)相互作用關(guān)系，見圖1。篩選出前5 的化合物為quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山柰酚）、tanshinone iia（丹參酮iia）、salviolone（丹參酮），前五的靶點(diǎn)為PTSG2、ADRB2、SCN5A、PTSG1、CHRM3。詳見表2，3。

圖1 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 藥物的degree值前5的活性成分

表3 藥物的degree值前5的作用靶點(diǎn)

2.3 疾病靶點(diǎn)的篩選

在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)以“psoriasis”為關(guān)鍵詞，篩選銀屑病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因信息，去重后共收集到銀屑病靶點(diǎn)基因3 753 個(gè)。

2.4 獲取藥物與疾病的交集基因

將丹紅注射液的228 個(gè)靶點(diǎn)和銀屑病的3 753個(gè)靶點(diǎn)輸入Venny 2.1 在線軟件作圖工具平臺(tái)繪制韋恩圖，兩者交集為疾病-類藥活性成分共同靶點(diǎn)，共132 個(gè)，見圖2。

圖2 銀屑膠囊和銀屑病共同基因靶點(diǎn)

2.5 丹紅注射液與銀屑病的蛋白互作PPI 圖

將核心基因?qū)雜tring 數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇物種為智人，最低交叉互作分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.9，得到蛋白互作PPI圖共有132 個(gè)點(diǎn)，659 條邊，平均度值為9.98，點(diǎn)越大，連接線條越粗，表明互作關(guān)系越多，見圖3。主要的蛋白基因是STAT3、AKT1、JUN、TP53 等，見圖4。

圖3 核心基因蛋白PPI互作圖

圖4 通過(guò)string數(shù)據(jù)庫(kù)分析degree值前20的基因靶點(diǎn)柱狀圖

2.6 核心基因標(biāo)靶的富集分析

將交集基因?qū)隓VID 數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行關(guān)于BP、CC、MF 和KEGG Pathways 生物過(guò)程的富集分析中，按照頻率排序，篩選出前20 個(gè)關(guān)于GO 富集分析，主要是作用于細(xì)胞的組成，見圖5。并根據(jù)通路上基因的數(shù)量對(duì)KEGG Pathways 進(jìn)行排序，發(fā)現(xiàn)銀屑病與癌癥、乙肝、丙肝都有一定的聯(lián)系，丹紅注射液治療銀屑病主要通過(guò)PI3K-Akt、TNF、MAPK、HIF-1 等信號(hào)通路。見圖5。

圖5 GO富集分析生物過(guò)程柱狀圖

2.7 KEGG pathway 分析

將核心基因?qū)隟EGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析，其中在PI3K-Akt 信號(hào)通路上共有32 個(gè)基因，主要集中在該通路的下游基因。對(duì)于銀屑病現(xiàn)在比較熱門的TH17 細(xì)胞分化通路上，一共有22 個(gè)基因，主要表現(xiàn)為上游基因進(jìn)行調(diào)控，通過(guò)IL-1β、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-2、IL-4 等因子進(jìn)行調(diào)控下游蛋白進(jìn)而調(diào)節(jié)TH17 細(xì)胞的分化。詳見圖7，8。

圖7 PI3K-Akt信號(hào)通路圖

3 討論

圖6 KEGG pathway富集分析氣泡圖

中醫(yī)學(xué)稱銀屑病為“白疕病”，是一個(gè)難治性、易復(fù)發(fā)的疾病，《醫(yī)林改錯(cuò)》云:“血受熱則煎熬成塊?！标U述了銀屑病患者初起血熱為主，熱邪煎熬血液導(dǎo)致血瘀?！端貑?wèn)·痹論篇》云:“病久入深，榮衛(wèi)之行澀，經(jīng)絡(luò)時(shí)疏，故不通?！北砻髁司貌t氣滯血瘀，經(jīng)絡(luò)堵塞，形成血瘀。其中斑塊狀銀屑病患者表現(xiàn)為皮膚甲錯(cuò)，瘙癢不適，皮疹暗紅色，為血瘀的表現(xiàn)。莊國(guó)康提出“肥厚是瘀、色紅是熱”的辨證要點(diǎn)［7］。趙炳南認(rèn)為本病夏輕冬重明顯的季節(jié)性，主要是因?yàn)楹镩]阻肌膚，瘀毒不得化，風(fēng)邪不能散而形成的［8］。禤國(guó)維從燥毒瘀論治本病［9］，徐宜厚將銀屑病的病理過(guò)程歸納為血熱—血燥—血瘀，認(rèn)為血瘀為其病理轉(zhuǎn)化的主軸［10］?？梢娧鲎C在銀屑病的發(fā)病過(guò)程中具有重要的作用。丹紅注射液由丹參、紅花2 味藥物組成，具有涼血活血的作用。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可以發(fā)現(xiàn)丹紅注射液通過(guò)多個(gè)基因靶點(diǎn)、多條通路進(jìn)行作用治療銀屑病。

丹紅注射液中重要的成分是：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、丹參酮iia（tanshinone iia）、丹參酮（salviolone）。槲皮素可以通過(guò)NF-κB 途徑改善銀屑小鼠模型皮炎反應(yīng)［11］，同時(shí)還可以降低炎癥因子IL-6 和TNF-α 的表達(dá)［12-13］，木犀草素可通過(guò)減少INF-γ 的分泌，抑制外周血TH1 和TH17 的增加，減輕銀屑病的皮損和炎癥反應(yīng)［14］。同時(shí)，木犀草素還可以抑制銀屑病角質(zhì)細(xì)胞增殖［15］。在使用ImQ 誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)山柰酚可以降低銀屑病皮損的CD3+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低IL-6、IL-17A、TNF-α的基因表達(dá)，并下調(diào)了NF-κB 信號(hào)［16］。丹參酮IIA 可以誘導(dǎo)銀屑病靶細(xì)胞角質(zhì)形成、細(xì)胞周期阻滯和凋亡的細(xì)胞機(jī)制［17］,還可以降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量,具有抵抗氧自由基和調(diào)節(jié)免疫等作用［18］，能夠治療銀屑病。丹參酮可抑制抗原淋巴結(jié)細(xì)胞和激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y 和IL-12［19］,還可以抑制肥大細(xì)胞脫顆粒，減少炎癥反應(yīng)［20］。

圖8 TH17 細(xì)胞分化信號(hào)通路圖

藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)藥物主要是通過(guò)作用于PTSG2、ADRB2、SCN5A、PTSG1、CHRM3進(jìn)行作用。PTGS2 又稱（COX-2）環(huán)氧化酶-2，COX-2 可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡［21］，同時(shí)COX-2 還是HIF-1 的下游基因，協(xié)同促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖并出現(xiàn)表皮角化不全，棘層肥厚和真皮乳頭毛細(xì)血管增生［22］，表現(xiàn)為銀屑病的組織病理變化。通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)丹紅注射液主要通過(guò)PI3K-Akt、FoXO、TNF、MAPK、HIF-1 等信號(hào)通路對(duì)銀屑病進(jìn)行作用。PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞存活的重要通路［23］，銀屑病皮損中PI3K 基因及其亞單位PI3K-P110 蛋白的表達(dá)特異性增高［24］，Akt 的高表達(dá)可導(dǎo)致下游的FoxO 蛋白磷酸化水平升高，進(jìn)而作用于下游的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin和CDK，使角質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)度增殖的病理變化［25］。同時(shí)PI3K-Akt 還可以下調(diào)靶蛋白mTOR，高度活化的PI3K/Akt/mTORC1 可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核自噬功能，導(dǎo)致表皮出現(xiàn)角化不全的病理變化［26］。通過(guò)MAPK 信號(hào)通路可以抑制NF-κB 和AP-1 的磷酸化，發(fā)揮抗炎作用［27］，也是連接細(xì)胞對(duì)外界刺激反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［28］。

綜上所述，丹參注射液治療銀屑病具有多靶點(diǎn)、多通路作用，為研究丹參注射液治療銀屑病的作用機(jī)理提供了思路。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)僅僅是理論上的探討，還需通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。