陳柏錫，黃艷艷，曾燕萍，李 斌，鄒蘭鈺，彭遠(yuǎn)霞，張 偉

（四川新希望乳業(yè)有限公司洪雅陽(yáng)平分公司，四川眉山 620000）

超高溫滅菌乳（Ultra High Temperature，UHT乳）經(jīng)過短時(shí)高溫的滅菌后，產(chǎn)品達(dá)到商業(yè)無菌的狀態(tài)，因此UHT乳具有保質(zhì)期長(zhǎng)、可常溫儲(chǔ)運(yùn)等特點(diǎn)[1]。但超高溫滅菌乳在儲(chǔ)存過程中會(huì)出現(xiàn)風(fēng)味異常、脂肪上浮等問題，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的品質(zhì)和貨架期，該現(xiàn)象的主要原因是由UHT乳中脂肪酶導(dǎo)致的。牛乳中的脂肪酶主要有兩種來源，一種是天然存在于生乳中，稱為天然脂肪酶；另一種是牛乳中的微生物代謝所產(chǎn)生，稱為微生物脂肪酶[2]。牛乳中的微生物脂肪酶主要來源于嗜冷菌，雖然嗜冷菌本身的繁殖不會(huì)嚴(yán)重影響牛乳的穩(wěn)定性，且在較為溫和的熱處理中（如巴氏殺菌）也容易將其殺死，但某些嗜冷菌的代謝產(chǎn)物是耐熱脂肪酶，耐熱脂肪酶在經(jīng)過巴氏殺菌甚至超高溫滅菌后，仍不能被完全滅活。殘留的脂肪酶會(huì)分解牛乳中的脂肪，造成脂肪上浮和風(fēng)味異常，嚴(yán)重破壞滅菌乳的口感和風(fēng)味，導(dǎo)致滅菌乳的貨架期大幅縮短[3]。所以需要一種能夠快速、準(zhǔn)確且價(jià)廉的檢測(cè)方法檢測(cè)原料乳中脂肪酶的活力以及探究牛乳中脂肪酶活力的變化規(guī)律。

4-硝基苯基辛酸酯（PNP-C）在脂肪酶的作用下會(huì)產(chǎn)生在316 nm處有吸光度的物質(zhì)，根據(jù)比爾-朗博定律，在一定濃度下，吸光度大小與吸光度物質(zhì)濃度呈正比，實(shí)驗(yàn)在底物濃度相同的情況下，產(chǎn)生吸光物質(zhì)濃度與脂肪酶活力成正比。本實(shí)驗(yàn)使用脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)品配制不同濃度的脂肪酶溶液，分解底物產(chǎn)生吸光度后標(biāo)定曲線，以此測(cè)定樣品中脂肪酶活力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

樣品來源于HN、ZX、ZN和XN共4家牧場(chǎng)生乳；5 U/mL脂肪酶溶液、5 mmol/L4-硝基苯基辛酸酯底物溶液、50 mmol/L pH7.2磷酸緩沖液、終止液：將乙腈與甲酸按照12∶1的比例混勻即可作為終止液。

1.1.2 儀器

紫外分光光度計(jì)、水浴加熱器、冷凍離心機(jī)、移液槍、移液管、水相濾頭（0.22 μm）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

將5 U/mL脂肪酶溶液配制成100 mU/mL的脂肪酶稀釋液備用，分裝好的底物在室溫下用流水解凍。取20 mL原料奶于50 mL離心管中，于10 000 r/min離心脫脂15 min。離心后將上層脂肪撇去，吸取100 μL清液于900 μL磷酸緩沖液中，混勻，制成1 mL樣品處理液。分別吸取300 μL樣品處理液于兩個(gè)2 mL離心管中，其中一個(gè)為加標(biāo)樣，并向兩個(gè)離心管中分別加入180 μL和120 μL磷酸緩沖液，并向加標(biāo)樣的離心管中加入60 μL 100 mU/mL脂肪酶稀釋液，最后向離心管中各加入120 μL底物溶液，制成待測(cè)樣品和加標(biāo)樣品。

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取4個(gè)2 mL離心管，每個(gè)離心管加入480 μL、450 μL、420 μL 和 360 μL 磷酸緩沖液，向離心管中加入 120 μL 底物和 0 μL、30 μL、60 μL 和 120 μL 脂肪酶稀釋液，混勻后即制成0 mU/mL、5 mU/mL、10 mU/mL和20 mU/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線置于44 ℃水浴加熱1 h取出，向每個(gè)離心管中加入1.3 mL終止液，搖勻，即可上機(jī)檢測(cè)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，樣品中脂肪酶活力見表1。由HN、ZX、ZN 3批原料奶的吸光度計(jì)算出樣品中的脂肪酶活力，再根據(jù)加標(biāo)回收率折算出樣品中脂肪酶活力準(zhǔn)確值。需注意的是，樣品的回收率應(yīng)在50%以上（如表1），當(dāng)回收率偏低時(shí)，有可能是離心效果不佳，導(dǎo)致脂肪剩余過多導(dǎo)致的，其原因是樣品中的脂肪酶不僅會(huì)與底物反應(yīng)，還會(huì)與牛乳中剩余的脂肪反應(yīng)，在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，剩余脂肪的含量越高，導(dǎo)致產(chǎn)生吸光物質(zhì)的濃度比理論值越低，影響檢測(cè)結(jié)果。原料乳離心脫脂率通常為90%～95%。為補(bǔ)償剩余脂肪產(chǎn)生的影響，每個(gè)樣品必須進(jìn)行平行試驗(yàn)和加標(biāo)回收。

表1 通過加標(biāo)回收率回推樣品中脂肪酶活力

圖1 脂肪酶活力檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 原奶儲(chǔ)運(yùn)時(shí)間對(duì)脂肪酶活力的影響

牛乳中耐熱脂肪酶是部分嗜冷菌的代謝產(chǎn)物，在冷藏條件下，隨著嗜冷菌的繁殖與代謝，牛乳中的脂肪酶活力應(yīng)隨之升高。本次實(shí)驗(yàn)取兩個(gè)不同牧場(chǎng)的原料奶各5份，置于2～6 ℃條件下冷藏避光保存，每隔24 h對(duì)其脂肪酶活力和嗜冷菌數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，繪制出的結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 HN牧場(chǎng)原料奶中脂肪酶活力與嗜冷菌數(shù)量與存放時(shí)間關(guān)系

圖3 ZX牧場(chǎng)原料奶中脂肪酶活力與嗜冷菌數(shù)量與存放時(shí)間關(guān)系

由圖2、圖3知，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，兩個(gè)牧場(chǎng)的原料乳中嗜冷菌總數(shù)均逐漸上升，48 h后嗜冷菌增長(zhǎng)速度均大幅提高，脂肪酶活力在72 h達(dá)到最高點(diǎn)，并在此之后呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，其原因是牛乳酸度的升高抑制了脂肪酶的活性。

在乳品生產(chǎn)加工的供應(yīng)鏈體系中，原料奶的運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)會(huì)隨著牧場(chǎng)與工廠距離的增加而增加，跨省牧場(chǎng)的運(yùn)輸時(shí)間在20 h以上，運(yùn)輸溫度均在4 ℃，原奶運(yùn)輸過程可近似理解為低溫儲(chǔ)存的過程，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)省外牧場(chǎng)與省內(nèi)牧場(chǎng)的原料奶進(jìn)行脂肪酶檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)其數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，省外牧場(chǎng)與省內(nèi)牧場(chǎng)的原料奶中脂肪酶活力均基本呈現(xiàn)正態(tài)分布，省外牧場(chǎng)的脂肪酶活力多數(shù)在8～11 mU/mL（平均值9.47 mU/mL），省內(nèi)牧場(chǎng)的脂肪酶活力普遍在5～8 mU/mL（平均值6.73 mU/mL），省外牧場(chǎng)奶源的脂肪酶活力明顯高于省內(nèi)牧場(chǎng)奶源，與原奶冷藏實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論一致。

圖4 省內(nèi)外牧場(chǎng)脂肪酶活力對(duì)比

2.2 脫冷儲(chǔ)運(yùn)對(duì)脂肪酶活力的影響

奶車運(yùn)輸和原奶在工廠的奶倉(cāng)中儲(chǔ)存均在4 ℃左右，當(dāng)奶車運(yùn)輸或原奶儲(chǔ)存出現(xiàn)脫冷時(shí)（10～15 ℃），也會(huì)對(duì)原料奶的質(zhì)量造成影響[4]，取相同批次的XN牧場(chǎng)原料乳，分別在2～6 ℃與10～15 ℃環(huán)境中保存，模擬奶車正常運(yùn)輸與脫冷的狀態(tài)，其脂肪酶檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。當(dāng)運(yùn)輸或儲(chǔ)存出現(xiàn)脫冷時(shí)，脂肪酶活力上升的速度也明顯增加。在最高點(diǎn)時(shí)（72 h），脫冷條件下的脂肪酶活力也明顯高于冷藏條件。

圖5 原料乳脫冷對(duì)脂肪酶活力的影響

2.3 脂肪酶活力對(duì)UHT滅菌乳的影響

UHT產(chǎn)品由于其經(jīng)過了超高溫滅菌工藝，經(jīng)過無菌灌裝后，產(chǎn)品內(nèi)部實(shí)現(xiàn)商業(yè)無菌狀態(tài)，因此UHT產(chǎn)品可在常溫下儲(chǔ)存，且保質(zhì)期較長(zhǎng)，通?？蛇_(dá)到6個(gè)月。但UHT產(chǎn)品在儲(chǔ)存時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)脂肪上浮、風(fēng)味異常、口感變差等情況，這類情況會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)品的貨架期，并影響消費(fèi)者的購(gòu)買體驗(yàn)。原料奶中產(chǎn)生的耐熱脂肪酶在經(jīng)過超高溫滅菌后，仍然不能被完全滅活，這部分脂肪酶會(huì)持續(xù)分解乳脂肪，產(chǎn)生脂肪酸，引起脂肪上浮或氧化味[5]。本次實(shí)驗(yàn)選取不同梯度的脂肪酶活力的原料奶，將其對(duì)應(yīng)的UHT成品進(jìn)行常溫儲(chǔ)存，模擬貨架陳列。感官品評(píng)小組在10 d、20 d、30 d、60 d、90d和120 d后進(jìn)行口感品評(píng)，客觀的記錄其風(fēng)味，其感官結(jié)果見圖6。

圖6 不同脂肪酶活力對(duì)成品風(fēng)味的影響

由圖6可知，當(dāng)脂肪酶活力處于較高水平時(shí)（10 mU/mL以上時(shí)），對(duì)應(yīng)成品儲(chǔ)存30 d時(shí)出現(xiàn)了奶香味不足、滋味寡淡的情況，在60 d時(shí)，脂肪酶活力處于8.0～10.0 mU/mL的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了奶香味不足的現(xiàn)象，而脂肪酶活力最高的實(shí)驗(yàn)組（＞13 mU/mL）則出現(xiàn)了輕微的豆腥味，經(jīng)分析應(yīng)該是脂肪分解后，部分脂肪酸輕微氧化產(chǎn)生的異味。而脂肪酶水平最低的1組在120 d內(nèi)，其滋氣味均處于正常水平。在第90 d，除脂肪酶活力最低的1組外，其余3組均出現(xiàn)了異味。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可明顯看出，脂肪酶會(huì)明顯的影響成品中脂肪的分解速度，脂肪酶活力越高，分解脂肪酶的速度也越快，導(dǎo)致脂肪酸快速氧化，產(chǎn)生異味。

3 結(jié)論

牛乳中嗜冷菌代謝的耐熱脂肪酶不會(huì)被超高溫滅菌工藝完全滅活，殘留的脂肪酶會(huì)持續(xù)分解成品乳中的脂肪，縮短產(chǎn)品貨架期[6]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，原料奶中脂肪酶活力越高，對(duì)應(yīng)成品的風(fēng)味變化越快，越容易產(chǎn)生脂肪氧化的豆腥味或陳腐味。原料奶中的脂肪酶活力隨著儲(chǔ)運(yùn)時(shí)長(zhǎng)的增加而不斷提高，在72 h后降低，即使在輕微脫冷的情況下，脂肪酶活力的上升速度也會(huì)明顯提高，所以在供應(yīng)鏈系統(tǒng)中縮短運(yùn)輸、儲(chǔ)存時(shí)間是控制脂肪酶活力的有效手段，對(duì)奶車的運(yùn)輸和原奶的儲(chǔ)存溫度的監(jiān)控也至關(guān)重要。另外，供應(yīng)鏈上游的奶源基地的衛(wèi)生條件直接影響了牛乳中的微生物指標(biāo)，奶源基地良好的衛(wèi)生條件是保證原料奶中較低嗜冷菌數(shù)量和較低脂肪酶活力的必要條件。