董慧明

（遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧沈陽 110036）

大腸菌群是一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、無芽孢需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌。大腸菌群與大腸桿菌相似，可以其檢出情況來判斷食品是否受到了人及溫血動物糞便的污染，作為食品、飲用水等衛(wèi)生指標菌[1]。大腸菌群定量檢測為食品微生物實驗室常規(guī)檢測項目，其檢測結(jié)果的準確性能判定實驗室基本能力水平是否達到要求。食品中大腸菌群的檢測有著重要意義，可以掌握食品的衛(wèi)生狀況，有利于控制腸道病的爆發(fā)傳播，及時做出有效的預防措施[2]。

能力驗證活動是利用實驗室間的比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力[3]。為提高實驗室食品微生物檢測能力，確保出具的檢驗報告的準確性和科學性，同時完成實驗室質(zhì)量控制和完善實驗室管理制度，本實驗室報名參加了中國食品藥品檢定研究院乳粉中大腸菌群的計數(shù)（定量）能力驗證。本實驗依據(jù)國家標準《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）[4]的要求進行實驗，同時應用3M Petrifilm CC測試片作為對照手段。

1 材料與方法

1.1 樣品

本實驗室收到2件待測樣品，每件樣品由1個菌球及相應奶粉組成，編碼分別為CODE TF02240028、CODE TF02240125。檢測時每個相同編碼的大腸菌群樣品和奶粉基質(zhì)作為1件樣品進行檢測。以無菌操作打開樣品的西林瓶，將西林瓶內(nèi)小球加入到225 mL 0.85%生理鹽水中，充分溶解；然后再將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到上述生理鹽水中，充分均質(zhì)混勻。依此方法，分別對2件樣品進行處理，制成1∶10的樣品勻液。

1.2 儀器與試劑

電熱恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；A2型生物安全柜（美國NUAIRE公司）；生物顯微鏡（日本Olympus公司）；電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；高壓滅菌鍋（日本Tomy公司）；均質(zhì)器（法國梅里埃公司）。

煌綠乳糖膽鹽（brilliant green lactose bile，BGLB）肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（Violet Red Agar，VRBA）、0.85%無菌生理鹽水，均購自北京陸橋技術(shù)有限公司；Petrifilm CC大腸菌群測試紙片（美國3M公司）。

1.3 實驗方法

依據(jù)國家標準《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）[4]的要求進行實驗。同時，用3M大腸菌群測試紙片法作為對照手段進行實驗, 每個稀釋度做兩平行，每片接種量為1 mL，36 ℃培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)計數(shù)

在VRBA平板上選取菌落在15～150 CFU的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑菌落，典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm，或更大[4]。大腸菌群菌落在3M大腸菌群測試片上生長產(chǎn)酸使培養(yǎng)基顏色變紅變深，目標菌落為紅色菌落并且周圍有氣泡產(chǎn)生，計數(shù)結(jié)果見表1。

表1 VRBA平板與3M紙片典型和可疑菌落計結(jié)果

2.2 確證實驗

從10-2稀釋度的VRBA平板上挑取10個典型和可疑菌落（不同類型），用無菌接種針取挑取菌落的菌體分別接種于BGLB肉湯管中，36 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察產(chǎn)氣情況，凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性（+）[4]，需要注意的是如果接種前BGLB導管內(nèi)有氣泡，應該先排除以免影響結(jié)果。兩個樣品選取的所有典型和可疑菌落均為大腸菌群，見表2。

表2 確證實驗BGLB肉湯產(chǎn)氣結(jié)果

2.3 大腸菌群平板計數(shù)的報告

經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以相應稀釋度VRBA平板計數(shù)菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中大腸菌群結(jié)果報告數(shù)，單位為CFU/g。樣品編號CODE TF02240028結(jié)果報告為3 100 CFU/g，樣品編號CODE TF02240028結(jié)果報告為4 200 CFU/g。

2.4 實驗結(jié)果反饋

經(jīng)能力驗證組織機構(gòu)反饋，本實驗室CODE TF02240028大腸菌群的檢測結(jié)果為3.491，指定值為3.732，z值為1.16；CODE TF02240125大腸菌群的檢測結(jié)果為3.623，指定值為3.732，z值為0.52；z值均＜2，兩個樣品的結(jié)果評價為滿意。

3 結(jié)論與討論

本次大腸菌群能力驗證結(jié)果報告與指定值相比數(shù)值偏低，分析原因可能是：①人員操作時間過長，樣品處理后應立即進行檢驗，操作時間過長會導致菌體死亡，造成實驗結(jié)果偏低；②操作過程中，樣品稀釋不規(guī)范或均質(zhì)時間過短會也會直接影響實驗結(jié)果；③樣品的存儲和運輸應該嚴格按照要求執(zhí)行，否則可能到導致結(jié)果出現(xiàn)偏差；④樣品冷凍后沒有放置達到室溫即開始實驗，溫度迅速升高導致菌體破裂受損，在規(guī)定的培養(yǎng)時間內(nèi)菌體沒有完全恢復，導致計數(shù)時菌數(shù)低［5］；⑤VRBA作為一種選擇性培養(yǎng)基，性能決定了檢測結(jié)果質(zhì)量的高低，還應加強關(guān)鍵培養(yǎng)基和試劑的性能驗收。

為保障本次大腸菌群能力驗證結(jié)果的準確性，本實驗室采用多個稀釋度和3M大腸菌群紙片對照等技術(shù)手段。3M大腸菌群測試片含有VRB培養(yǎng)劑（Violet Red Bile），一種冷水可溶性的凝膠劑和四唑翁（tetrazollium）指示劑，可增強菌落計數(shù)效果。表面覆蓋的膠膜，可留住發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。能力驗證結(jié)果反饋表明，3M紙片法的檢測結(jié)果更接近指定值，測試片的檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，且其具有快速簡便的特點，可作為實驗室檢驗的輔助手段和大批量食品微生物快速檢測方法。在以后的能力驗證考核中，還可加入基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALEI-TOFMS）等技術(shù)手段，對結(jié)果進行進一步確證，可以排除干擾菌，使檢驗結(jié)果更加準確。