諸葛石養(yǎng) 蘇愛(ài)榮 黃彥 李秀桂

【關(guān)鍵詞】 金黃色葡萄球菌;溶血素;分子特征

中圖分類(lèi)號(hào)：R378.1+ 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： DOI：10.3969/j.issn.10031383.2021.06.014

溶血素作為金黃色葡萄球菌分泌的胞外毒素之一，是造成醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染重要的致病因子[1]。根據(jù)抗原性不同可分為α、β、γ和δ溶血素四種類(lèi)型，β溶血素能引起人類(lèi)皮膚黏膜化膿性感染、慢性骨髓炎[2]、感染性肺炎，以及動(dòng)物眼角膜炎[3]和乳腺炎[4]等。β溶血素的相關(guān)研究目前國(guó)內(nèi)報(bào)道相對(duì)較少，為了給同行學(xué)者研究提供理論參考，本文對(duì)金黃色葡萄球菌β溶血素的分子結(jié)構(gòu)、生化特性、致病作用及免疫預(yù)防等方面進(jìn)行綜述。

1 分子結(jié)構(gòu)

1935年GLENNY和 STEVENS首次發(fā)現(xiàn)一種不同于α溶血素的酯酶類(lèi)毒素，1989年P(guān)ROJAN正式公開(kāi)了其完整的基因序列，并命名為β溶血素。β溶血素由330個(gè)氨基酸和1個(gè)終止子組成的單鏈多肽分子，其N(xiāo)末端為Glu Ser Lys Lys Asp Asp Thr Asp Leu Lys，起始1～34位氨基酸為一段信號(hào)肽，全長(zhǎng)約993 bp，相對(duì)分子量約為37 kDA。β溶血素為四層三明治結(jié)構(gòu)，富含無(wú)規(guī)則卷曲，中心含有兩個(gè)β折疊片和四個(gè)α螺旋[5]，其中β折疊結(jié)構(gòu)含量最少為18.8%，α螺旋結(jié)構(gòu)含量是21.8%。β溶血素其中一個(gè)β折疊片上的兩條β折疊股形成的獨(dú)特結(jié)構(gòu)與DNaseⅠ超家族成員有高度同源性，因此本質(zhì)上隸屬DNaseⅠ超家族。

2 生化特性β溶血素在低溫條件下較為穩(wěn)定，4℃可以保存3天，凍干后4℃能保存長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月。對(duì)胰蛋白酶較為敏感，對(duì)福爾馬林有一定的耐受作用，pH為5.5時(shí)β溶血素的活性最高。β溶血素在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期合成速度最快，一般24小時(shí)達(dá)到峰值。聚β羥基丁酸酯和齊墩果酸對(duì)β溶血素活性均有明顯抑制作用[6]。在培養(yǎng)過(guò)程中加入10%～25%CO2能提高β溶血素活性[7]。β溶血素活性具有細(xì)胞和物種的特異性[8]，對(duì)綿羊、牛和山羊紅細(xì)胞最為敏感，豚鼠、馬、大白鼠、小白鼠和禽類(lèi)紅細(xì)胞對(duì)β溶血素均不敏感，而對(duì)家兔、人、豬和貓紅細(xì)胞則次之。β溶血素對(duì)哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞敏感性高低與細(xì)胞膜神經(jīng)鞘磷脂的含量呈正相關(guān)，對(duì)單核細(xì)胞的敏感性均大于淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和纖維母細(xì)胞[9]。

3 致病機(jī)制β溶血素除了傳統(tǒng)的溶血功能之外，還有其他多種生物學(xué)功能，比如白細(xì)胞毒性、促進(jìn)生物膜形成、抑制初始免疫反應(yīng)、引發(fā)細(xì)胞壞死或凋亡和誘發(fā)肺部感染等[10]。

3.1 溶血功能

與α、γ和δ三種成孔溶血素完全不同，β溶血素?fù)p傷細(xì)胞膜并不形成孔道[11]。它是一種依賴Mg2+的中性神經(jīng)鞘磷脂酶，具有磷脂酶C和鞘磷脂酶活性，水解卵磷脂產(chǎn)生帶電荷的磷脂?；鶊F(tuán)和非極性二酰甘油，水解鞘磷脂產(chǎn)生磷酸膽堿和神經(jīng)酰胺，這些產(chǎn)物能損傷紅細(xì)胞膜，引起溶酶體膜通透性增加，大量水解酶釋放至胞漿，通過(guò)剪切下游信號(hào)分子引發(fā)紅細(xì)胞裂解[12]。在Mg2+協(xié)同作用下，β溶血素在體外培養(yǎng)能產(chǎn)生獨(dú)特的“熱冷效應(yīng)”，即首先進(jìn)行一段時(shí)間37℃培養(yǎng)，紅細(xì)胞膜形態(tài)未發(fā)生任何改變，再繼續(xù)進(jìn)行一段時(shí)間4℃低溫培養(yǎng)后，紅細(xì)胞膜表面就會(huì)形成內(nèi)陷，甚至可能會(huì)出現(xiàn)部分或全部膜瓦解的狀態(tài)，表明β溶血素在低溫條件下溶血活性顯著提高，溶血能力也較α、γ和δ溶血素弱[13]。有研究顯示將β溶血素149或287位的組氨酸突變?yōu)樘於０窌r(shí)，其溶血活性則完全消失[14]。

3.2 白細(xì)胞毒性

神經(jīng)鞘磷脂是細(xì)胞生物膜的重要組成部分，人白細(xì)胞膜的神經(jīng)鞘磷脂含量占磷脂總量的10%～15%，研究顯示β溶血素具有較強(qiáng)的白細(xì)胞毒性。SALGADOPABON等[15]研究表明，濃度為1 ng/mL的β溶血素在體外“冷熱”培養(yǎng)可以導(dǎo)致大約325個(gè)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞完全溶解，顯微電鏡掃描顯示白細(xì)胞膜喪失了表面皺褶，并呈現(xiàn)細(xì)胞膜塌陷或整體瓦解。KRUSE等[16]發(fā)現(xiàn)β溶血素的一個(gè)疏水性β折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)為溶解淋巴細(xì)胞作用的活性部位，將其第152或289位的組氨酸突變?yōu)樘於０泛螅馨图?xì)胞毒性作用則完全消失。CHEN等[17]報(bào)道β溶血素作用于單核細(xì)胞后能夠迅速誘導(dǎo)IL1β的表達(dá)增加，導(dǎo)致IL6受體和脂多糖受體脫落，最終裂解單核細(xì)胞。BHAGWAT等[18]在進(jìn)行金黃色葡萄球菌（β溶血素陽(yáng)性株）與T細(xì)胞共同孵育時(shí)發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞的平均存活率顯著降低，β溶血素陽(yáng)性株和β溶血素陰性株的T細(xì)胞平均存活率分別為33.00%和82.55%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明β溶血素對(duì)T細(xì)胞具有明顯的毒性作用。

3.3 抑制初始免疫反應(yīng)

β溶血素通過(guò)抑制局部單核巨噬細(xì)胞或其他輔佐細(xì)胞的吞噬和處理，使抗原不能以有效的方式（與MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合）遞呈給TH細(xì)胞來(lái)達(dá)到抑制初始免疫反應(yīng)的目的。JUNG等[19]報(bào)道β溶血素水解人內(nèi)皮細(xì)胞膜上的鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺。神經(jīng)酰胺作為第二信使分子則啟動(dòng)胞內(nèi)相關(guān)的信號(hào)通路，阻斷表皮生長(zhǎng)因子受體來(lái)抑制ERK1/2的磷酸化，進(jìn)而破壞下游信號(hào)通路，降低IL8轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致IL8分泌減少。IL8作為中性粒細(xì)胞的趨化劑，IL8的分泌減少將導(dǎo)致中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移受到抑制。HERRETA等[20]還報(bào)道β溶血素的水解產(chǎn)物神經(jīng)酰胺能激活NOD樣受體蛋白3（NLRP3），誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的半胱氨酸天門(mén)冬氨酸酶1（Caspase1）。Caspase1能阻斷IL1β前體和IL18前體形成具有活性效應(yīng)的IL1β和IL18，從而抑制粒細(xì)胞濃集釋放炎癥因子，進(jìn)而降低初始免疫反應(yīng)。

3.4 促進(jìn)生物定植

生物膜是由細(xì)胞外基質(zhì)包裹的微生物群落，大約80%的細(xì)菌感染都與生物膜的形成有關(guān)。金黃色葡萄球菌極易黏附在皮膚黏膜、醫(yī)療導(dǎo)管和植入式醫(yī)療耗材表面形成牢固的生物膜，抵御宿主防御機(jī)制的攻擊[21]。β溶血素具有生物膜連接酶活性[22]，誘導(dǎo)形成共價(jià)核蛋白復(fù)合物，通過(guò)損傷皮膚黏膜上皮細(xì)胞和促進(jìn)生物膜形成方式在其定植過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

KATAYAMA等在小鼠耳部皮膚定植模型中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)β溶血素的MW2菌株（φSa3缺失）比野生型MW2菌株的定植效率高出50倍以上，進(jìn)一步研究顯示β溶血素在潛伏期內(nèi)就對(duì)人類(lèi)角質(zhì)形成細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性，有利于金黃色葡萄球菌在皮膚黏膜表面定植[23]。MELNIK[24]報(bào)道攜帶完整β溶血素基因的金黃色葡萄球菌（φSa3丟失）在人鼻腔黏膜定植持續(xù)高達(dá)14天，而攜帶φSa3菌株持續(xù)定植僅有3天。PHUONG等[25]在兔子感染性心內(nèi)膜炎模型中證實(shí)，表達(dá)β溶血素的MW2菌株（φSa3丟失）在H2O2氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下可以誘導(dǎo)Cid基因轉(zhuǎn)錄，增加胞外DNA含量，最終促進(jìn)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞生物膜形成。HUSEBY等[26]將β溶血素與DNA共同孵育時(shí)，β溶血素并未表達(dá)明顯的核酸酶活性，而是與單鏈或雙鏈DNA形成自身共價(jià)交聯(lián)，產(chǎn)生不溶性的核蛋白基質(zhì)，形成較為牢靠的生物膜骨架。金黃色葡萄球菌COL（hlb+）在流動(dòng)池中形成的生物膜比金黃色葡萄球菌COL（hlb）更快和更厚，而在兔主動(dòng)脈中形成明顯的生物膜，平均重量（220±34）mg，細(xì)菌數(shù)為log108.28±0.26，4天后生物膜幾乎完全阻塞了整條主動(dòng)脈，而金黃色葡萄球菌COL（hlb）形成生物膜平均重量?jī)H為（2.5±4.3）mg，細(xì)菌數(shù)量只有l(wèi)og106.14±0.22。HERRERA等[8]研究發(fā)現(xiàn)β溶血素通過(guò)整合素依賴活化誘導(dǎo)血小板聚集，抑制CD40和血管細(xì)胞黏附分子1在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，以延遲宿主免疫系統(tǒng)的激活，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面細(xì)菌負(fù)荷會(huì)增加，從而促進(jìn)生物膜形成。生物膜形成的多寡與β溶血素濃度的呈正相關(guān)。

3.5 細(xì)胞壞死或凋亡

壞死是細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的降解，主要依賴溶酶體破裂后釋放的酶類(lèi)[27]。β溶血素能直接損傷細(xì)胞溶酶體，引起半胱氨酸蛋白酶和組織蛋白酶B釋放，激活NLRP3炎性小體[28]，并誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。凋亡是細(xì)胞程序性死亡，為DNA內(nèi)源性內(nèi)切酶作用下被裂解。β溶血素水解靶鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺能激活Caspase3。作為一種蛋白酶，Caspase3屬于細(xì)胞凋亡中心環(huán)節(jié)的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族中的下游效應(yīng)者。Caspase3被活化后產(chǎn)生凋亡蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)的炎性蛋白酶被激活，NFκB、IL1β、1L18等炎癥因子的表達(dá)增多，進(jìn)而降解細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)，最終引起細(xì)胞不可逆凋亡[29]。

4 免疫預(yù)防金黃色葡萄球菌β溶血素是造成奶牛乳腺炎流行的重要因子，導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量的降低，給奶牛產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失?；谝呙绺咝?、安全和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，奶牛乳腺炎疫苗受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。目前國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)的β溶血素疫苗研究報(bào)道，但至今尚未能普及應(yīng)用。魏春梅[30]利用牛源性重組β溶血素亞單位疫苗治療由金黃色葡萄球菌菌株Newbould305誘導(dǎo)的乳腺炎，結(jié)果顯示其能誘導(dǎo)小鼠機(jī)體IL6分泌增加，減少乳腺內(nèi)細(xì)菌感染的數(shù)量，并能在一定程度上將感染病灶局限化。李光超[31]將純化β溶血素和pcDNA3.1HisBhlb質(zhì)粒分別與福氏佐劑乳化混合制成亞單位疫苗和DNA疫苗，強(qiáng)化免疫小鼠10天后，實(shí)驗(yàn)組IgG水平和IL2濃度均顯著高于對(duì)照組，亞單位疫苗對(duì)小鼠乳腺細(xì)胞的保護(hù)作用要明顯強(qiáng)于pcDNA3.1HisBhlbDNA疫苗。管玉等人[32]通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32ahlb，并在大腸桿菌BL21 （DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)抗β溶血素單鏈抗體，結(jié)果顯示抗β溶血素單鏈抗體可以顯著抑制重組hlb蛋白和金色葡萄球菌的溶血作用。AQIB等[33]利用駱駝亞臨床乳腺炎中回收具有β溶血素特性金黃色葡萄球菌，制備成滅活鋁沉淀疫苗和油佐劑疫苗，兩者產(chǎn)生的最高幾何平均滴度分別為37.92和69.92，并且增強(qiáng)劑量疫苗的平均幾何滴度明顯高于單劑劑量。

5 小結(jié) β溶血素作為一種多功能蛋白在金黃色葡萄球菌致病性和免疫方面發(fā)揮著重要作用。盡管前期進(jìn)行的大量研究工作取得了很大的進(jìn)展，但依然有相當(dāng)多的問(wèn)題還有待解決，包括β溶血素的表達(dá)調(diào)控、溶血作用的調(diào)控途徑、乳腺炎疫苗的研制以及引起肺部感染的作用機(jī)制等等。進(jìn)一步深入研究β溶血素一定能為金黃色葡萄球菌相關(guān)疾病的治療提供更為廣闊的思路。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-03-03 修回日期：2021-03-30）

（編輯：潘明志）