諸葛石養(yǎng) 蘇愛榮 黃彥 李秀桂
【關(guān)鍵詞】 金黃色葡萄球菌;溶血素;分子特征
中圖分類號(hào):R378.1+ 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: DOI:10.3969/j.issn.10031383.2021.06.014
溶血素作為金黃色葡萄球菌分泌的胞外毒素之一,是造成醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染重要的致病因子[1]。根據(jù)抗原性不同可分為α、β、γ和δ溶血素四種類型,β溶血素能引起人類皮膚黏膜化膿性感染、慢性骨髓炎[2]、感染性肺炎,以及動(dòng)物眼角膜炎[3]和乳腺炎[4]等。β溶血素的相關(guān)研究目前國(guó)內(nèi)報(bào)道相對(duì)較少,為了給同行學(xué)者研究提供理論參考,本文對(duì)金黃色葡萄球菌β溶血素的分子結(jié)構(gòu)、生化特性、致病作用及免疫預(yù)防等方面進(jìn)行綜述。
1 分子結(jié)構(gòu)
1935年GLENNY和 STEVENS首次發(fā)現(xiàn)一種不同于α溶血素的酯酶類毒素,1989年P(guān)ROJAN正式公開了其完整的基因序列,并命名為β溶血素。β溶血素由330個(gè)氨基酸和1個(gè)終止子組成的單鏈多肽分子,其N末端為Glu Ser Lys Lys Asp Asp Thr Asp Leu Lys,起始1~34位氨基酸為一段信號(hào)肽,全長(zhǎng)約993 bp,相對(duì)分子量約為37 kDA。β溶血素為四層三明治結(jié)構(gòu),富含無規(guī)則卷曲,中心含有兩個(gè)β折疊片和四個(gè)α螺旋[5],其中β折疊結(jié)構(gòu)含量最少為18.8%,α螺旋結(jié)構(gòu)含量是21.8%。β溶血素其中一個(gè)β折疊片上的兩條β折疊股形成的獨(dú)特結(jié)構(gòu)與DNaseⅠ超家族成員有高度同源性,因此本質(zhì)上隸屬DNaseⅠ超家族。
2 生化特性β溶血素在低溫條件下較為穩(wěn)定,4℃可以保存3天,凍干后4℃能保存長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月。對(duì)胰蛋白酶較為敏感,對(duì)福爾馬林有一定的耐受作用,pH為5.5時(shí)β溶血素的活性最高。β溶血素在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期合成速度最快,一般24小時(shí)達(dá)到峰值。聚β羥基丁酸酯和齊墩果酸對(duì)β溶血素活性均有明顯抑制作用[6]。在培養(yǎng)過程中加入10%~25%CO2能提高β溶血素活性[7]。β溶血素活性具有細(xì)胞和物種的特異性[8],對(duì)綿羊、牛和山羊紅細(xì)胞最為敏感,豚鼠、馬、大白鼠、小白鼠和禽類紅細(xì)胞對(duì)β溶血素均不敏感,而對(duì)家兔、人、豬和貓紅細(xì)胞則次之。β溶血素對(duì)哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞敏感性高低與細(xì)胞膜神經(jīng)鞘磷脂的含量呈正相關(guān),對(duì)單核細(xì)胞的敏感性均大于淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和纖維母細(xì)胞[9]。
3 致病機(jī)制β溶血素除了傳統(tǒng)的溶血功能之外,還有其他多種生物學(xué)功能,比如白細(xì)胞毒性、促進(jìn)生物膜形成、抑制初始免疫反應(yīng)、引發(fā)細(xì)胞壞死或凋亡和誘發(fā)肺部感染等[10]。
3.1 溶血功能
與α、γ和δ三種成孔溶血素完全不同,β溶血素?fù)p傷細(xì)胞膜并不形成孔道[11]。它是一種依賴Mg2+的中性神經(jīng)鞘磷脂酶,具有磷脂酶C和鞘磷脂酶活性,水解卵磷脂產(chǎn)生帶電荷的磷脂?;鶊F(tuán)和非極性二酰甘油,水解鞘磷脂產(chǎn)生磷酸膽堿和神經(jīng)酰胺,這些產(chǎn)物能損傷紅細(xì)胞膜,引起溶酶體膜通透性增加,大量水解酶釋放至胞漿,通過剪切下游信號(hào)分子引發(fā)紅細(xì)胞裂解[12]。在Mg2+協(xié)同作用下,β溶血素在體外培養(yǎng)能產(chǎn)生獨(dú)特的“熱冷效應(yīng)”,即首先進(jìn)行一段時(shí)間37℃培養(yǎng),紅細(xì)胞膜形態(tài)未發(fā)生任何改變,再繼續(xù)進(jìn)行一段時(shí)間4℃低溫培養(yǎng)后,紅細(xì)胞膜表面就會(huì)形成內(nèi)陷,甚至可能會(huì)出現(xiàn)部分或全部膜瓦解的狀態(tài),表明β溶血素在低溫條件下溶血活性顯著提高,溶血能力也較α、γ和δ溶血素弱[13]。有研究顯示將β溶血素149或287位的組氨酸突變?yōu)樘於0窌r(shí),其溶血活性則完全消失[14]。
3.2 白細(xì)胞毒性
神經(jīng)鞘磷脂是細(xì)胞生物膜的重要組成部分,人白細(xì)胞膜的神經(jīng)鞘磷脂含量占磷脂總量的10%~15%,研究顯示β溶血素具有較強(qiáng)的白細(xì)胞毒性。SALGADOPABON等[15]研究表明,濃度為1 ng/mL的β溶血素在體外“冷熱”培養(yǎng)可以導(dǎo)致大約325個(gè)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞完全溶解,顯微電鏡掃描顯示白細(xì)胞膜喪失了表面皺褶,并呈現(xiàn)細(xì)胞膜塌陷或整體瓦解。KRUSE等[16]發(fā)現(xiàn)β溶血素的一個(gè)疏水性β折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)為溶解淋巴細(xì)胞作用的活性部位,將其第152或289位的組氨酸突變?yōu)樘於0泛?,淋巴?xì)胞毒性作用則完全消失。CHEN等[17]報(bào)道β溶血素作用于單核細(xì)胞后能夠迅速誘導(dǎo)IL1β的表達(dá)增加,導(dǎo)致IL6受體和脂多糖受體脫落,最終裂解單核細(xì)胞。BHAGWAT等[18]在進(jìn)行金黃色葡萄球菌(β溶血素陽(yáng)性株)與T細(xì)胞共同孵育時(shí)發(fā)現(xiàn),T細(xì)胞的平均存活率顯著降低,β溶血素陽(yáng)性株和β溶血素陰性株的T細(xì)胞平均存活率分別為33.00%和82.55%,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明β溶血素對(duì)T細(xì)胞具有明顯的毒性作用。
3.3 抑制初始免疫反應(yīng)
β溶血素通過抑制局部單核巨噬細(xì)胞或其他輔佐細(xì)胞的吞噬和處理,使抗原不能以有效的方式(與MHCⅡ類分子結(jié)合)遞呈給TH細(xì)胞來達(dá)到抑制初始免疫反應(yīng)的目的。JUNG等[19]報(bào)道β溶血素水解人內(nèi)皮細(xì)胞膜上的鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺。神經(jīng)酰胺作為第二信使分子則啟動(dòng)胞內(nèi)相關(guān)的信號(hào)通路,阻斷表皮生長(zhǎng)因子受體來抑制ERK1/2的磷酸化,進(jìn)而破壞下游信號(hào)通路,降低IL8轉(zhuǎn)錄水平,導(dǎo)致IL8分泌減少。IL8作為中性粒細(xì)胞的趨化劑,IL8的分泌減少將導(dǎo)致中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移受到抑制。HERRETA等[20]還報(bào)道β溶血素的水解產(chǎn)物神經(jīng)酰胺能激活NOD樣受體蛋白3(NLRP3),誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的半胱氨酸天門冬氨酸酶1(Caspase1)。Caspase1能阻斷IL1β前體和IL18前體形成具有活性效應(yīng)的IL1β和IL18,從而抑制粒細(xì)胞濃集釋放炎癥因子,進(jìn)而降低初始免疫反應(yīng)。
3.4 促進(jìn)生物定植
生物膜是由細(xì)胞外基質(zhì)包裹的微生物群落,大約80%的細(xì)菌感染都與生物膜的形成有關(guān)。金黃色葡萄球菌極易黏附在皮膚黏膜、醫(yī)療導(dǎo)管和植入式醫(yī)療耗材表面形成牢固的生物膜,抵御宿主防御機(jī)制的攻擊[21]。β溶血素具有生物膜連接酶活性[22],誘導(dǎo)形成共價(jià)核蛋白復(fù)合物,通過損傷皮膚黏膜上皮細(xì)胞和促進(jìn)生物膜形成方式在其定植過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
KATAYAMA等在小鼠耳部皮膚定植模型中發(fā)現(xiàn),表達(dá)β溶血素的MW2菌株(φSa3缺失)比野生型MW2菌株的定植效率高出50倍以上,進(jìn)一步研究顯示β溶血素在潛伏期內(nèi)就對(duì)人類角質(zhì)形成細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性,有利于金黃色葡萄球菌在皮膚黏膜表面定植[23]。MELNIK[24]報(bào)道攜帶完整β溶血素基因的金黃色葡萄球菌(φSa3丟失)在人鼻腔黏膜定植持續(xù)高達(dá)14天,而攜帶φSa3菌株持續(xù)定植僅有3天。PHUONG等[25]在兔子感染性心內(nèi)膜炎模型中證實(shí),表達(dá)β溶血素的MW2菌株(φSa3丟失)在H2O2氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下可以誘導(dǎo)Cid基因轉(zhuǎn)錄,增加胞外DNA含量,最終促進(jìn)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞生物膜形成。HUSEBY等[26]將β溶血素與DNA共同孵育時(shí),β溶血素并未表達(dá)明顯的核酸酶活性,而是與單鏈或雙鏈DNA形成自身共價(jià)交聯(lián),產(chǎn)生不溶性的核蛋白基質(zhì),形成較為牢靠的生物膜骨架。金黃色葡萄球菌COL(hlb+)在流動(dòng)池中形成的生物膜比金黃色葡萄球菌COL(hlb)更快和更厚,而在兔主動(dòng)脈中形成明顯的生物膜,平均重量(220±34)mg,細(xì)菌數(shù)為log108.28±0.26,4天后生物膜幾乎完全阻塞了整條主動(dòng)脈,而金黃色葡萄球菌COL(hlb)形成生物膜平均重量?jī)H為(2.5±4.3)mg,細(xì)菌數(shù)量只有l(wèi)og106.14±0.22。HERRERA等[8]研究發(fā)現(xiàn)β溶血素通過整合素依賴活化誘導(dǎo)血小板聚集,抑制CD40和血管細(xì)胞黏附分子1在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá),以延遲宿主免疫系統(tǒng)的激活,血管內(nèi)皮細(xì)胞表面細(xì)菌負(fù)荷會(huì)增加,從而促進(jìn)生物膜形成。生物膜形成的多寡與β溶血素濃度的呈正相關(guān)。
3.5 細(xì)胞壞死或凋亡
壞死是細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的降解,主要依賴溶酶體破裂后釋放的酶類[27]。β溶血素能直接損傷細(xì)胞溶酶體,引起半胱氨酸蛋白酶和組織蛋白酶B釋放,激活NLRP3炎性小體[28],并誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。凋亡是細(xì)胞程序性死亡,為DNA內(nèi)源性內(nèi)切酶作用下被裂解。β溶血素水解靶鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺能激活Caspase3。作為一種蛋白酶,Caspase3屬于細(xì)胞凋亡中心環(huán)節(jié)的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族中的下游效應(yīng)者。Caspase3被活化后產(chǎn)生凋亡蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng),細(xì)胞內(nèi)的炎性蛋白酶被激活,NFκB、IL1β、1L18等炎癥因子的表達(dá)增多,進(jìn)而降解細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì),最終引起細(xì)胞不可逆凋亡[29]。
4 免疫預(yù)防金黃色葡萄球菌β溶血素是造成奶牛乳腺炎流行的重要因子,導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量的降低,給奶牛產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失?;谝呙绺咝?、安全和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),奶牛乳腺炎疫苗受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。目前國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)的β溶血素疫苗研究報(bào)道,但至今尚未能普及應(yīng)用。魏春梅[30]利用牛源性重組β溶血素亞單位疫苗治療由金黃色葡萄球菌菌株Newbould305誘導(dǎo)的乳腺炎,結(jié)果顯示其能誘導(dǎo)小鼠機(jī)體IL6分泌增加,減少乳腺內(nèi)細(xì)菌感染的數(shù)量,并能在一定程度上將感染病灶局限化。李光超[31]將純化β溶血素和pcDNA3.1HisBhlb質(zhì)粒分別與福氏佐劑乳化混合制成亞單位疫苗和DNA疫苗,強(qiáng)化免疫小鼠10天后,實(shí)驗(yàn)組IgG水平和IL2濃度均顯著高于對(duì)照組,亞單位疫苗對(duì)小鼠乳腺細(xì)胞的保護(hù)作用要明顯強(qiáng)于pcDNA3.1HisBhlbDNA疫苗。管玉等人[32]通過構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32ahlb,并在大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)抗β溶血素單鏈抗體,結(jié)果顯示抗β溶血素單鏈抗體可以顯著抑制重組hlb蛋白和金色葡萄球菌的溶血作用。AQIB等[33]利用駱駝亞臨床乳腺炎中回收具有β溶血素特性金黃色葡萄球菌,制備成滅活鋁沉淀疫苗和油佐劑疫苗,兩者產(chǎn)生的最高幾何平均滴度分別為37.92和69.92,并且增強(qiáng)劑量疫苗的平均幾何滴度明顯高于單劑劑量。
5 小結(jié) β溶血素作為一種多功能蛋白在金黃色葡萄球菌致病性和免疫方面發(fā)揮著重要作用。盡管前期進(jìn)行的大量研究工作取得了很大的進(jìn)展,但依然有相當(dāng)多的問題還有待解決,包括β溶血素的表達(dá)調(diào)控、溶血作用的調(diào)控途徑、乳腺炎疫苗的研制以及引起肺部感染的作用機(jī)制等等。進(jìn)一步深入研究β溶血素一定能為金黃色葡萄球菌相關(guān)疾病的治療提供更為廣闊的思路。
參 考 文 獻(xiàn)
[1WANG S,KANG O H,KWON D Y.Transcinnamaldehyde exhibits synergy with conventional antibiotic against methicillinresistant Staphylococcus aureus[J].Int J Mol Sci,2021,22(5):2752.
[2GONZALEZ C D,LEDO C,CELA E,et al.The good side of inflammation:Staphylococcus aureus proteins SpA and Sbi contribute to proper abscess formation and wound healing during skin and soft tissue infections[J].Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis,2019,1865(10):26572670.
[3JAUNEIKAITE E,F(xiàn)ERGUSON T,MOSAVIE M,et al.Staphylococcus aureus colonization and acquisition of skin and soft tissue infection among Royal Marines recruits:a prospective cohort study[J].Clin Microbiol Infect,2020,26(3):381.e1381.e6.
[4SOIMALA T,LBKEBECKER A,SCHWARZ S,et al.Occurrence and molecular composition of methicillinresistant Staphylococcus aureus isolated from ocular surfaces of horses presented with ophthalmologic disease[J].Vet Microbiol,2018,222:16.
[5MONTOYA M,GOUAUX E.Betabarrel membrane protein folding and structure viewed through the lens of alphahemolysin[J].Biochim Biophys Acta,2003,1609(1):1927.
[6ZHOU Y L,GUO Y,SUN X D,et al.Application of oleanolic acid and its analogues in combating pathogenic bacteria in vitro/Vivo by a twopronged strategy of βlactamases and hemolysins[J].ACS Omega,2020,5(20):1142411438.
[7IWATA K,KASUYA K,TAKAYAMA K,et al.Systemic Staphylococcus pseudintermedius infection in an arctic fox (Vulpes lagopus) with severe multifocal suppurative meningoencephalitis and nephritis[J].J Vet Med Sci,2018,80(8):12191222.
[8HERRERA A,VU B G,STACH C S,et al.Staphylococcus aureus βtoxin mutants are defective in biofilm ligase and sphingomyelinase activity,and causation of infective endocarditis and Sepsis[J].Biochemistry,2016,55(17):25102517.
[9TAJIMA A,IWASE T,SHINJI H,et al.Inhibition of endothelial interleukin8 production and neutrophil transmigration by Staphylococcus aureus betahemolysin[J].Infect Immun,2009,77(1):327334.
[10SOHAIL M,RAFIQ A,NAEEM M,et al.Effects of different types of microbes on blood cells, current perspectives and future directions[J]. Saudi J Med Pharm Sci, 2021, 7(1):16.
[11PAKDEESIRIWONG N, RANGDIST S, CHUMKIEW S, et al. Hemolytic activity inhibition of staphylococcus aureus hemolysins by secreted molecules from enterococcus faecalis strains R1, R3, and R7[J]. International Virtual Conference on Science and Technology, 2020, 8(2):450455.
[12VANDENESCH F,LINA G,HENRY T.Staphylococcus aureus hemolysins,bicomponent leukocidins,and cytolytic peptides:a redundant arsenal of membranedamaging virulence factors?[J].Front Cell Infect Microbiol,2012,2:12.
[13BAGBAN M,JAIN N K.Comparative analysis of αhemolysin and βhemolysin by hplc and ftir[J].Int J Sci Res,2018,7(6):345.
[14TAKEDA K,TANAKA Y,KANEKO J.The Nterminal aminolatch region of Hlg2 component of staphylococcal bicomponent γhaemolysin is dispensable for prestem release to form βbarrel pores[J].J Biochem,2020,168(4):349354.
[15SALGADOPABN W,HERRERA A,VU B G,et al.Staphylococcus aureus βtoxin production is common in strains with the βtoxin gene inactivated by bacteriophage[J].J Infect Dis,2014,210(5):784792.
[16KRUSE A C,HUSEBY M J,SHI K,et al.Structure of a mutant β toxin from Staphylococcus aureus reveals domain swapping and conformational flexibility[J].Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun,2011,67(Pt 4):438441.
[17CHEN L,WEI Y D,ZHAO S M,et al.Antitumor and immunomodulatory activities of total flavonoids extract from persimmon leaves in H22 liver tumorbearing mice[J].Sci Rep,2018,8(1):10523.
[18BHAGWAT A,COLLINS C H,DORDICK J S.Selective antimicrobial activity of cell lytic enzymes in a bacterial consortium[J].Appl Microbiol Biotechnol,2019,103(17):70417054.
[19JUNG P,ABDELBARY M M,KRAUSHAAR B,et al.Impact of bacteriophage Saint3 carriage on the immune evasion capacity and hemolytic potential of Staphylococcus aureus CC398[J].Vet Microbiol,2017,200:4651.
[20HERRERA A,KULHANKOVA K,SONKAR V K,et al.Staphylococcal βtoxin modulates human aortic endothelial cell and platelet function through sphingomyelinase and biofilm ligase activities[J].mBio,2017,8(2):e00273e00217.
[21BANIMUSLEM T A. Impact of subminimal inhibitory concentrations of ciprofloxacin, amikacin and gentamicin on the production of staphylococcus aureus βtoxin the biofilm ligase[J]. Journal of Global Pharma Technolog, 2019,11(7Suppl.):229236.
[22YONG Y Y,ONG M W K,DYKES G,et al.Betacyanininhibited biofilm formation of coculture of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa on different polymer surfaces[J].FEMS Microbiol Lett,2021,368(1):fnaa214.
[23KATAYAMA Y,BABA T,SEKINE M,et al.Betahemolysin promotes skin colonization by Staphylococcus aureus[J].J Bacteriol,2013,195(6):11941203.
[24MELNIK B C.Olumacostat glasaretil,a promising topical sebumsuppressing agent that affects all major pathogenic factors of acne vulgaris[J].J Invest Dermatol,2017,137(7):14051408.
[25TRAN P M, EEISS M, KINMEY K J, et al. φSa3 mw prophage as a molecular regulatory switch of staphylococcus aureus βtoxin production[J]. Journal of bacteriology, 2019, 201(14):766718.
[26HUSEBY M J,KRUSE A C,DIGRE J,et al.Beta toxin catalyzes formation of nucleoprotein matrix in staphylococcal biofilms[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(32):1440714412.
[27MUOZPLANILLO R,F(xiàn)RANCHI L,MILLER L S,et al.A critical role for hemolysins and bacterial lipoproteins in Staphylococcus aureusinduced activation of the Nlrp3 inflammasome[J].J Immunol,2009,183(6):39423948.
[28GUPTA R,GHOSH S,MONKS B,et al.RNA and βhemolysin of group B Streptococcus induce interleukin1β (IL1β) by activating NLRP3 inflammasomes in mouse macrophages[J].J Biol Chem,2014,289(20):1370113705.
[29THAPA A, ADAMIAK M, BUJKO K, et al. Dangerassociated molecular pattern molecules take unexpectedly a central stage in NLRP3 inflammasomecaspase1mediated trafficking of hematopoietic stem/progenitor cells[J]. Leukemia, 2021.[Online ahead of print].
[30魏春梅.牛源性重組金黃色葡萄球菌β溶血素亞單位疫苗對(duì)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳腺內(nèi)感染小鼠的保護(hù)研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.
[31李光超.牛源金黃色葡萄球菌β溶血素的真核表達(dá)及免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.
[32管玉,王曼,張蕾,等.牛源抗金黃色葡萄球菌β溶血素單鏈抗體的鑒定及其生物學(xué)特性[J].畜牧與獸醫(yī),2020,52(4):9197.
[33AQIB A I,ANJUM A A,IJAZ M,et al.Development and evaluation of vaccine against Staphylococcus aureus recovered from naturally occurring mastitis in shecamels[J].Microb Pathog,2018,117:341347.
(收稿日期:2021-03-03 修回日期:2021-03-30)
(編輯:潘明志)