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        Cx3cr1抗體玻璃體腔注射對視網(wǎng)膜缺血—再灌注損傷模型小鼠視網(wǎng)膜微循環(huán)的保護作用及其機制

        2021-08-20 03:34:30李娟娟陳晨李妍張利偉
        中華實驗眼科雜志 2021年7期
        關(guān)鍵詞:膠質(zhì)空白對照活化

        李娟娟 陳晨 李妍 張利偉

        云南大學附屬醫(yī)院眼科 云南省眼科疾病防治研究重點實驗室,昆明 650021

        視網(wǎng)膜缺血—再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion,RIR)是多種視網(wǎng)膜血管性疾病的共同病理過程。以往RIR的研究多集中于神經(jīng)細胞保護,而微循環(huán)作為神經(jīng)血管單元的重要組成部分,其損傷也是該類疾病的重要病理改變。神經(jīng)組織缺血研究發(fā)現(xiàn),活化的小膠質(zhì)細胞可直接吞噬血管內(nèi)皮細胞造成血管結(jié)構(gòu)崩解,也可誘導過度的炎癥反應(yīng)造成血管屏障功能破壞,從而導致微循環(huán)損傷[1-2]。本課題組前期研究已證實,活化的小膠質(zhì)細胞在RIR中對微循環(huán)產(chǎn)生破壞作用,抑制小膠質(zhì)細胞活化可減少視網(wǎng)膜中炎性因子的釋放[3]。因此,抑制小膠質(zhì)細胞的活化可能是保護缺血組織微循環(huán)的重要途徑。C-X3-C基序趨化因子受體1(C-X3-C motif chemokine receptor 1,cx3cr1)是主要表達于小膠質(zhì)細胞的一種趨化因子受體,cx3cr1抗體與cx3cr1結(jié)合后,可以抑制小膠質(zhì)細胞的活性[4]。本研究擬探討cx3cr1抗體對RIR過程中視網(wǎng)膜微循環(huán)的保護作用,以期為臨床上相關(guān)疾病的治療提供新的思路和方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1實驗動物及分組 選擇SPF級4~5周齡健康C57BL/6小鼠150只,雌雄不限,體質(zhì)量25~28 g。實驗動物由昆明醫(yī)科大學動物科提供,實驗動物的喂養(yǎng)及使用均遵循《實驗動物管理條例》,本實驗方案經(jīng)昆明醫(yī)科大學倫理委員會審核批準(批文號:20180106)。實驗前經(jīng)檢查實驗鼠雙眼前節(jié)和眼底均正常。采用隨機數(shù)字表法將實驗動物隨機分為空白對照組、模型組和cx3cr1抗體注射組,每組50只??瞻讓φ战M小鼠僅玻璃體腔注射無菌注射用水,模型組小鼠采用前房灌注升高眼壓法建立RIR模型,cx3cr1抗體注射組小鼠采用cx3cr1抗體玻璃體腔注射后4 h建立RIR模型,均以右眼為實驗眼。

        1.1.2主要試劑及儀器 多聚甲醛(美國Sigma公司);氯胺酮、鹽酸賽拉嗪(廣州深安科技有限公司);抗兔Iba-1抗體(013-26471,日本W(wǎng)ako公司);抗鼠cx3cr1抗體(377227,美國Santa Cruze公司);羊抗兔熒光二抗(AP510)、羊抗鼠熒光二抗(AP300P)、兔抗羊熒光二抗(AP106R)、驢血清(美國Millipore公司);Trizol試劑(美國Life Technologies公司);SYBR?Green Master Mix試劑(美國Roche公司);Prime Script RT reagent試劑盒(日本Takara公司);FITC-dextran、GS-Isolectin B4(美國Invitrogen公司)。Quant Studio 6 Flex Q-PCR儀(美國Life Technologies公司);顯微手術(shù)器械(美國WPI公司);激光掃描共焦顯微鏡(LSM710,德國Zeiss公司)。

        1.2 方法

        1.2.1實驗鼠cx3cr1抗體玻璃體腔注射 小鼠腹腔內(nèi)注射氯胺酮和鹽酸賽拉嗪行全身麻醉,復方托吡卡胺滴眼液擴瞳后采用奧布卡因滴眼液點眼行表面麻醉,稍用力壓迫上下眼瞼使眼球突出眼眶,用微量注射器由角膜緣后1 mm進針至玻璃體腔,空白對照組小鼠注射無菌注射用水2 μl;cx3cr1抗體注射組注射用無菌注射用水稀釋的0.2 μg/μl cx3cr1抗體2 μl。如有角膜水腫等高眼壓表現(xiàn)行前房穿刺,并用妥布霉素滴眼液點眼,注射后放回飼養(yǎng)籠中。

        1.2.2RIR動物模型建立 參照文獻[5-7]中的方法建立RIR模型。將全身麻醉的小鼠采取俯臥位,四肢固定于自制的固定器上,使用復方托吡卡胺滴眼液點眼擴瞳,將30G針頭與生理鹽水瓶連接,將針頭刺入前房并固定,緩慢升高生理鹽水瓶使液面提高150 cm,眼壓升高至110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),持續(xù)60 min后逐漸降低輸液瓶高度至動物眼球水平,拔出前房灌注針頭,恢復視網(wǎng)膜血供。眼壓升高后可見小鼠角膜逐漸水腫、角膜緣血管閉鎖、虹膜顏色變淺;眼底觀察可見視網(wǎng)膜血供減少,視網(wǎng)膜血管阻斷。針頭拔出后可見小鼠角膜水腫逐漸消失并恢復透明,角膜緣血管重新充血,虹膜顏色逐漸恢復,視網(wǎng)膜逐漸恢復紅潤,實現(xiàn)血液再灌注。實驗動物蘇醒后,回籠飼養(yǎng),模型誘導后72 h進行相應(yīng)指標檢測。

        1.2.3免疫熒光染色法觀察視網(wǎng)膜冰凍切片小膠質(zhì)細胞活化情況 每組任意選取10只小鼠過量麻醉法處死,剖取眼球,并進行OCT包埋,沿平行于晶狀體前后表面經(jīng)線方向行冰凍切片,切片厚4~5 μm。將切好備用的眼球冰凍切片從-80 ℃冰箱中取出,室溫條件下自然風干30 min;將切片浸入新鮮配制的質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛中固定20 min;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)漂洗,室溫下浸入體積分數(shù)0.1% TritonX-100溶液中破膜15 min;PBS漂洗3次,每次10 min,滴加體積分數(shù)5%驢血清室溫封閉1 h;滴加Iba-1抗體(1∶ 200)于濕盒中4 ℃孵育24 h;PBS漂洗3次,每次10 min,滴加相應(yīng)熒光二抗(1∶ 1 000)常溫下避光孵育1 h;PBS漂洗3次,每次10 min;用含DAPI的抗熒光淬滅油性封片劑封片;滴入少許指甲油增加蓋玻片和載玻片之間的穩(wěn)固性,待指甲油干后于熒光顯微鏡下計數(shù)每個視野(400倍視野下)視網(wǎng)膜各層中Iba-1陽性細胞數(shù)。

        1.2.4免疫熒光染色法觀察視網(wǎng)膜鋪片活化小膠質(zhì)細胞 每組任意選取10只小鼠,過量麻醉法處死后摘出眼球,4%多聚甲醛固定2 h。手術(shù)顯微鏡下去除角膜、虹膜、晶狀體,仔細清理玻璃體以防止玻璃體殘留影響染色效果,剝離鞏膜及脈絡(luò)膜,將視網(wǎng)膜朝視神經(jīng)方向剪成4瓣,可鋪平為原則。甲醇固定視網(wǎng)膜后15 min,使用含體積分數(shù)20%胎牛血清和體積分數(shù)0.5% Triton的100倍PBS進行封閉打孔1 h;抗Iba-1抗體(1∶ 200)4 ℃冰箱中孵育24 h,滴加相應(yīng)熒光二抗(1∶ 1 000)常溫下避光孵育1 h;用含DAPI的抗熒光淬滅油性封片劑封片。熒光顯微鏡200倍視野下計數(shù)任意3個區(qū)域每個視野范圍內(nèi)的呈阿米巴樣活化小膠質(zhì)細胞數(shù)。

        1.2.5免疫熒光染色法觀察視網(wǎng)膜鋪片血管和活化小膠質(zhì)細胞共染色 每組任意選取10只小鼠過量麻醉處死后取出眼球,參照1.2.4部分步驟進行視網(wǎng)膜鋪片,使用含體積分數(shù)20%胎牛血清和0.5% Triton的100倍PBS進行封閉打孔1 h;加入血管染色劑GS-Isolectin B4(1∶ 200)4 ℃孵育過夜,加入抗Iba-1抗體(1∶ 200)4 ℃冰箱中孵育24 h,分別滴加相應(yīng)熒光二抗(1∶ 1 000)常溫下避光孵育1 h后封片。熒光顯微鏡下觀察血管結(jié)構(gòu)損傷情況,采用multi-gauge軟件計算淺層及深層毛細血管密度,觀察小膠質(zhì)細胞活化與血管的關(guān)系。

        表1 PCR引物序列Table1 PCR primer sequences基因正向引物(5’-3’)反向引物(5’-3’)VEGF-ACAGAAGGAGAGCAGAAGTCCCTCCAGGGCTTCATCGTTAHIF-1αCCAGCAGACTCAAATACAAGAACCTGTATGTGGGTAGGAGATGGAGATTNF-αAAATGGGCTTTCCGAATTCACAGGGAAGAATCTGGAAAGGTIL-1βTGAAATGCCACCTTTTGACAGCCACAGCCACAATGAGTGATACβ-actinGGCACCAGGGCGTGATGGGTCTCAAACATGATCTGGGTC 注:PCR:聚合酶鏈式反應(yīng);VEGF:血管內(nèi)皮生長因子;HIF:缺氧誘導因子;TNF:腫瘤壞死因子;IL:白細胞介素;β-actin:β-肌動蛋白 Note:PCR:polymerase chain reaction;VEGF:vascular endothelial growth factor;HIF:hypoxia inducible factor;TNF:tumor necrosis factor;IL:interleukin

        圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜冰凍切片Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞表達分布(×200,標尺=50 μm) Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞呈紅色熒光(TRITC),細胞核呈藍色熒光(DAPI) A:空白對照組視網(wǎng)膜IPL內(nèi)可見極少量Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞 B:模型組IPL、INL及OPL可見較多Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞 C:cx3cr1抗體注射組視網(wǎng)膜各層Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)較模型組明顯減少Figure 1 The distribution of Iba-1 positive microglia in different layers of mice retina (×200,bar=50 μm) Iba-1 positive microglia showed red fluorescence (TRITC),and nucleus presented blue fluorescence (DAPI) A:A small amount of Iba-1 positive microglia were seen in the IPL of retina in the blank control group B:In the model group,more Iba-1 positive microglia were seen in the IPL,INL and OPL C:The number of Iba-1 positive cells was reduced in the cx3cr1 injection group in comparison with the model group

        1.2.6左心室FITC-dextran造影檢查視網(wǎng)膜血管滲漏情況 FITC-dextran溶于無菌生理鹽水中,質(zhì)量濃度為50 mg/ml,離心半徑15 cm,3 000 r/min離心10 min后取上清備用。將每組10只小鼠常規(guī)麻醉固定,剪開胸骨,打開胸腔,將1 ml FITC-dextran溶液注入左心室,觀察小鼠的口、鼻、耳廓變黃為灌注成功。摘取小鼠眼球并標記方向,于4%多聚甲醛中固定1 h;然后在手術(shù)顯微鏡下沿角膜緣剪開球壁,去除晶狀體、玻璃體,用虹膜恢復器將視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層與色素上皮層分離,取視網(wǎng)膜感覺層在PBS中漂洗,清除殘存玻璃體,最后將視網(wǎng)膜平鋪在玻片上,穿刺刀以視盤為中心放射狀切開,甘油封片,熒光顯微鏡下觀察并照像。采用ImageJ軟件測量滲漏面積,計算相對滲漏率。相對滲漏率=cx3cr1抗體注射組滲漏面積/空白對照組滲漏面積×100%。

        1.2.7實時熒光定量PCR法檢測視網(wǎng)膜中缺氧相關(guān)因子和炎性因子mRNA表達 每組任意選取10只小鼠過量麻醉處死后摘除眼球,分離出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層,在PBS液中漂洗,加入Trizol 1 ml,劇烈振蕩,溶解離心提取總RNA;逆轉(zhuǎn)錄生成模板cDNA。設(shè)計并合成缺氧相關(guān)因子血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及炎性因子表達腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),各目的基因引物序列見表1。反應(yīng)體系為:PCR Buffer 5 μl,MgCl25 μl,dNTP 1 μl,目的基因正反向引物各2 μl,Taq探針1 μl。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性50 s,55 ℃退火及延伸30 s,共45次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。

        1.3 統(tǒng)計學方法

        采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件(10034432,美國IBM SPSS公司)進行統(tǒng)計分析。本研究中計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布,以mean±SD表示。采用隨機分組單因素干預多水平研究設(shè)計,3個組各檢測指標總體差異比較均采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗。采用雙側(cè)檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1陽性細胞表達分布比較

        空白對照組小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞稀少,分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層,視網(wǎng)膜外層未見Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞。模型組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)明顯增多,并向外叢狀層、外核層移動。Cx3cr1抗體注射組小鼠視網(wǎng)膜各層Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)較模型組明顯減少(圖1)。3個組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層活化小膠質(zhì)細胞數(shù)總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=92.98、125.22、33.51、28.18,均P<0.01),模型組小鼠視網(wǎng)膜各層活化小膠質(zhì)細胞數(shù)明顯多于空白對照組和cx3cr1抗體注射組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表2)。

        表2 3個組視網(wǎng)膜各層活化小膠質(zhì)細胞數(shù)比較(mean±SD,/視野)Table 2 Comparison of the number of activated microglial cells in different layers ofretina among the three groups (mean±SD,/field)組別樣本量視網(wǎng)膜各層活化小膠質(zhì)細胞數(shù)GCLIPLINLOPL空白對照組102.0±1.20.3±0.60.00.0模型組1010.2±1.5a15.6±2.8a4.1±1.5a3.9±1.5acx3cr1抗體注射組107.0±1.2ab11.9±2.6ab2.7±1.2b2.5±1.4abF值92.98125.2233.5128.18P值<0.01<0.01<0.01<0.01 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) GCL:神經(jīng)節(jié)細胞層;IPL:內(nèi)叢狀層;INL:內(nèi)核層;OPL:外叢狀層;cx3cr1:C-X3-C基序趨化因子受體1 Note:Compared with the blank control group,aP<0.05;compared with the model group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) GCL:ganglion cell layer;IPL:inner plexiform layer;INL:inner nuclear layer;OPL:outer plexiform layer;cx3cr1:C-X3-C motif chemokine receptor 1

        2.2 各組小鼠視網(wǎng)膜活化小膠質(zhì)細胞數(shù)量及形態(tài)變化

        Iba-1染色結(jié)果顯示,空白對照組小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1陽性細胞數(shù)量稀少,且細胞體小,呈長分枝狀。模型組小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1陽性細胞數(shù)量最多,且細胞體明顯膨大,分枝縮短呈阿米巴樣,甚至球形。Cx3cr1抗體注射組較模型組Iba-1陽性細胞和變形細胞數(shù)量減少??瞻讓φ战M、模型組和cx3cr1抗體注射組視網(wǎng)膜中Iba-1陽性細胞數(shù)分別為(13.8±3.6)、(62.2±4.8)和(34.8±2.6)/視野,組間總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=413.32,P<0.01);其中cx3cr1抗體注射組Iba-1陽性細胞數(shù)明顯少于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

        圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜鋪片Iba-1陽性細胞數(shù)量和形態(tài)變化 A:空白對照組視網(wǎng)膜中Iba-1陽性細胞數(shù)量稀少,且細胞體小,呈長分枝狀(FITC ×200,標尺=50 μm) B:模型組視網(wǎng)膜中可見大量Iba-1陽性細胞,且細胞體明顯膨大,呈阿米巴樣或球形(FITC ×200,標尺=50 μm) C:cx3cr1抗體注射組較模型組細胞數(shù)量減少(FITC ×200,標尺=50 μm) D:各組小鼠視網(wǎng)膜鋪片Iba-1陽性細胞量化比較 F=413.32,P<0.01與空白對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗,n=10)Figure 2 Quantitative and morphological changes of Iba-1 positive cells in mice retinal preparation of each group A:The Iba-1 positive cells in the blank control group were scarce,and the cell bodies were small,showing long branches (FITC ×200,bar=50 μm) B:A large number of Iba-1 positive cells were seen in the model group,and the cell bodies were obviously enlarged,presenting amoeba-like or spherical (FITC ×200,bar=50 μm) C:The number of Iba-1 positive cells in the cx3cr1 injection group was reduced in comparison with the model group (FITC ×200,bar=50 μm) D:Quantitative comparison of Iba-1 positive cells among the three groups F=413.32,P<0.01.Compared with the blank control group,aP<0.05;compared with the model group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=10)

        2.3 各組小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞與視網(wǎng)膜血管共同染色情況比較

        空白對照組可見視網(wǎng)膜血管管徑及走行正常,血管網(wǎng)間及各級血管附近僅見少量活化小膠質(zhì)細胞。模型組視網(wǎng)膜血管明顯擴張,血管周圍及血管表面可見大量阿米巴樣或球形小膠質(zhì)細胞。Cx3cr1抗體注射組血管周圍及血管壁表面變形小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯減少。各組視網(wǎng)膜深層血管網(wǎng)表現(xiàn)與淺層血管網(wǎng)接近(圖3)。3個組視網(wǎng)膜淺層血管密度總體比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.01,P=0.99),深層血管密度總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=9.53,P<0.01);其中模型組視網(wǎng)膜深層血管密度明顯低于空白對照組和cx3cr1抗體注射組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表3)。3個組間淺層、深層視網(wǎng)膜血管周圍活化小膠質(zhì)細胞數(shù)總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=134.02、84.88,均P<0.01);其中模型組視網(wǎng)膜血管周圍活化小膠質(zhì)細胞數(shù)明顯高于cx3cr1抗體注射組和空白對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表4)。

        圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜鋪片血管與活化小膠質(zhì)細胞共染色(×200,標尺=50 μm) 小鼠視網(wǎng)膜血管呈紅色熒光(GS-IB4),活化小膠質(zhì)細胞呈綠色熒光(FITC) A:空白對照組淺層毛細血管網(wǎng)管徑和血管走行正常,血管周圍僅有少量活化小膠質(zhì)細胞 B:模型組淺層視網(wǎng)膜血管擴張,血管附近可見大量阿米巴樣或球形活化小膠質(zhì)細胞 C:cx3cr1抗體注射組淺層視網(wǎng)膜血管附近活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量較模型組明顯減少 D:空白對照組深層視網(wǎng)膜血管網(wǎng)走行正常,僅見少量活化小膠質(zhì)細胞 E:模型組深層視網(wǎng)膜血管網(wǎng)周圍可見大量活化小膠質(zhì)細胞 F:cx3cr1抗體注射組深層視網(wǎng)膜血管網(wǎng)周圍活化小膠質(zhì)細胞數(shù)明顯少于模型組Figure 3 Co-staining of blood vessels and active microglia in retinal whole mounts of each group (×200,bar=50 μm) Mice retinal blood vessels showed red fluorescence (GS-IB4),and activated microglia presented green fluorescence (FITC) A:The diameter of the superficial capillary network and the running of the blood vessel were normal in the blank control group,and there were only a small amount of activated microglia around blood vessel B:The superficial blood vessels in the model group were significantly dilated,and a large number of amoebic or spherical activated microglia cells were present near the blood vessels C:The number of activated microglia near the superficial blood vessels in the cx3cr1 injection group was significantly reduced in comparison with the model group D:The deep retinal vascular network ran normally,and only a few activated microglia were seen in the blank control group E:A large number of activated microglia could be seen around the deep retinal network in the model groupF:The number of activated microglial cells around the deep retinal vascular network was significantly less in the cx3cr1 injection group than that in the model group

        表3 3個組視網(wǎng)膜不同層次血管數(shù)目比較(mean±SD,/視野)Table 3 Comparison of the number of vessels in differentretinal layers among the three groups(mean±SD,/field)組別樣本量不同層次視網(wǎng)膜血管數(shù)目淺層深層空白對照組10129.50±8.22a320.80±13.35a模型組10129.10±7.69301.50±7.89cx3cr1抗體注射組10129.20±6.60a313.50±7.65aF值0.019.53P值0.99<0.01 注:與各自模型組比較,aP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗) Note:Compared with respective model group,aP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test)

        表4 3個組視網(wǎng)膜不同層次血管周圍活化小膠質(zhì)細胞數(shù)比較(mean±SD,/視野)Table 4 Comparison of the number of perivascular activatedmicroglial cells in different retinal layers among the threegroups (mean±SD,/field)組別樣本量不同層次血管周圍活化小膠質(zhì)細胞數(shù)淺層深層空白對照組105.30±2.11a1.50±1.27a模型組1031.90±5.6318.40±3.60cx3cr1抗體注射組1019.20±1.87a12.20±3.36aF值134.0284.88P值<0.01<0.01 注:與各自模型組比較,aP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗) Note:Compared with respective model group,aP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test)

        2.4 各組小鼠視網(wǎng)膜血管滲漏面積比較

        空白對照組小鼠視網(wǎng)膜毛細血管呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),走行和排列規(guī)則,未見熒光素滲漏(圖4A);模型組毛細血管結(jié)構(gòu)紊亂,部分毛細血管形成異常吻合,可見明顯的熒光素滲漏,部分毛細血管閉塞,可見無灌注區(qū)(圖4B);cx3cr1抗體注射組毛細血管閉塞減少,血管滲漏減輕(圖4C)??瞻讓φ战M、模型組和cx3cr1抗體注射組視網(wǎng)膜血管相對滲漏率分別為(100.0±4.7)%、(162.1±10.6)%和(130.5±9.5)%,總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=128.66,P<0.01);模型組小鼠視網(wǎng)膜血管相對滲漏率明顯高于空白對照組和cx3cr1抗體注射組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖4D)。

        2.5 各組小鼠視網(wǎng)膜中缺氧相關(guān)因子及炎性因子mRNA表達

        各組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF-A、TNF-α、HIF-1α和IL-1β mRNA相對表達量總體比較,差異均有統(tǒng)計學意義(F=154.26、206.39、140.68、175.12,均P<0.01);模型組視網(wǎng)膜中VEGF-A、TNF-α、HIF-1α和IL-1β mRNA相對表達量明顯高于空白對照組和cx3cr1抗體注射組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表5)。

        圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜血管滲漏情況比較 A:空白對照組小鼠視網(wǎng)膜毛細血管網(wǎng)未見熒光素滲漏(FITC-dextran ×200,標尺=50 μm) B:模型組小鼠毛細血管結(jié)構(gòu)紊亂,可見毛細血管形成異常吻合及滲漏(FITC-dextran ×200,標尺=50 μm) C:cx3cr1抗體注射組小鼠血管滲漏有所減輕(FITC-dextran ×200,標尺=50 μm) D:各組視網(wǎng)膜血管相對滲漏率比較 F=128.66,P<0.01.與空白對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗,n=10)Figure 4 Comparision of mice retinal vascular leakage in each group A:No fluorescein leakage was observed in retinal capillary network of the blank control group (FITC-dextran ×200,bar=50 μm) B:The capillary structure in the model group was disordered,and abnormal capillary formation and vascular leakage was observed (FITC-dextran ×200,bar=50 μm) C:The mice retinal vascular leakage in the cx3cr1 injection group was reduced in comparison with the model group (FITC-dextran ×200,bar=50 μm) D:Comparison of relative retinal vascular leakage rate among the three groups F=128.66,P<0.01.Compared with the blank control group,aP<0.05;compared with the model group,bP <0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=10)

        表5 各組小鼠視網(wǎng)膜中缺氧相關(guān)因子和炎性因子mRNA相對表達量比較(mean±SD)Table 5 Comparison of relative mRNA expression of hypoxia related factor andinflammatory factor among the three groups(mean±SD)組別樣本量各因子mRNA相對表達量VEGF-ATNF-αHIF-1αIL-1β空白對照組101.00±0.14a1.00±0.14a1.00±0.14a1.00±0.14a模型組102.76±0.324.00±0.393.93±0.524.10±0.50cx3cr1抗體注射組102.02±0.18a2.47±0.40a3.11±0.45a2.52±0.38aF值154.26206.39140.68175.12P值<0.01<0.01<0.01<0.01 注:與各自模型組比較,aP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗) VEGF:血管內(nèi)皮生長因子;TNF:腫瘤壞死因子;HIF:缺氧誘導因子;IL:白細胞介素;cx3cr1:C-X3-C基序趨化因子受體1 Note:Compared with respective model group,aP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test) VEGF:vascular endothelial growth factor;TNF:tumor necrosis factor;HIF:hypoxia inducible factor;IL:Interleukin;cx3cr1:C-X3-C motif chemokine receptor 1

        3 討論

        近年來,對于RIR損傷中微循環(huán)保護或治療的研究大多聚焦于VEGF的表達??筕EGF藥物在治療RIR損傷性疾病過程中對于血管通透性損傷、組織水腫等微循環(huán)有一定的改善作用,但其仍未能從根本上解決微循環(huán)損傷,存在治療效果有限、治療時限性短等問題[8-9],因此,仍需研究RIR微循環(huán)損傷發(fā)生的具體機制,以探索更為有效而持久的治療方法。

        Cx3cr1是小膠質(zhì)細胞核神經(jīng)元之間的信號傳遞者,在小膠質(zhì)細胞的活化中發(fā)揮著調(diào)控作用,小膠質(zhì)細胞中豐富表達cx3cr1[10-11]。本課題組前期實驗結(jié)果及大量的文獻報道均證明,當RIR時,視網(wǎng)膜細胞及組織內(nèi)的cx3cr1表達升高,進而激活小膠質(zhì)細胞,因此推測阻斷cx3cr1與其配體結(jié)合,從而抑制小膠質(zhì)細胞活化,減少其對微循環(huán)的損傷作用。本研究發(fā)現(xiàn),玻璃體腔注射cx3cr1抗體能夠抑制RIR模型小鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細胞活化為阿米巴樣的形態(tài),且活化細胞數(shù)量和遷移至視網(wǎng)膜深層的細胞數(shù)量均明顯減少。

        Ebneter等[12]在激光誘導視網(wǎng)膜靜脈阻塞的動物模型中發(fā)現(xiàn),阻塞的血管周圍活化小膠質(zhì)細胞密度明顯增加。Jolivel等[1]在腦部缺血—再灌注損傷模型中觀察到,活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)存在血管內(nèi)皮細胞的標志物,證實小膠質(zhì)細胞可以直接吞噬血管內(nèi)皮細胞而造成血管結(jié)構(gòu)的直接損傷。以上研究表明,抑制小膠質(zhì)細胞活化可能對缺血損傷中的微循環(huán)具有保護作用。Iba-1高度特異性表達于活化小膠質(zhì)細胞中,因此將其作為活化小膠質(zhì)細胞的標志物[12]。本研究還發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞活化被抑制后RIR模型小鼠微循環(huán)的損傷有所減少,視網(wǎng)膜深層血管密度有所增加,閉鎖的血管減少,血管滲漏率明顯下降,從結(jié)構(gòu)和功能2個方面研究證實了抑制小膠質(zhì)細胞活化可以保護RIR中的微循環(huán)。以往文獻報道,活化小膠質(zhì)細胞可對血管壁造成直接損傷,并通過調(diào)控炎癥反應(yīng)破壞視網(wǎng)膜—血管屏障[13-14]。本研究結(jié)果顯示,抑制小膠質(zhì)細胞的活性后小膠質(zhì)細胞向血管遷移的能力明顯下降,黏附于血管壁的細胞數(shù)量明顯減少;另一方面,小膠質(zhì)細胞活化受到抑制后,視網(wǎng)膜組織中與血管損傷密切相關(guān)的因子VEGF、HIF、TNF-α mRNA表達均明顯下調(diào);其中VEGF和HIF的表達下調(diào)證明組織缺血缺氧的情況得到緩解,微循環(huán)功能得到改善[15-16];炎性因子TNF-α表達下調(diào),推測組織炎癥反應(yīng)得到控制,從而保護了微循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能。

        綜上所述,本研究證實了活化小膠質(zhì)細胞對RIR中微循環(huán)的破壞作用,采用抗體中和的方法抑制小膠質(zhì)細胞活化可有效保護視網(wǎng)膜微循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能,為視網(wǎng)膜和其他組織缺血再灌注損傷的治療提供了新思路。本研究仍存在一些不足,如僅探討了抑制小膠質(zhì)細胞活化對視網(wǎng)膜微循環(huán)的影響,而缺血—再灌注損傷對組織微循環(huán)的損傷是一個復雜的過程,其中涉及許多細胞因子和信號通路[17-18];此外,本研究僅檢測了缺氧反應(yīng)因子和炎性因子基因表達水平,各因子的蛋白表達水平及其在RIR中的作用還需要進一步驗證,RIR過程中神經(jīng)血管單元與膠質(zhì)細胞的互作具體機制等問題仍有待進一步研究。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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