李娟娟 陳晨 李妍 張利偉

云南大學附屬醫(yī)院眼科 云南省眼科疾病防治研究重點實驗室，昆明 650021

視網(wǎng)膜缺血—再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion，RIR)是多種視網(wǎng)膜血管性疾病的共同病理過程。以往RIR的研究多集中于神經(jīng)細胞保護，而微循環(huán)作為神經(jīng)血管單元的重要組成部分，其損傷也是該類疾病的重要病理改變。神經(jīng)組織缺血研究發(fā)現(xiàn)，活化的小膠質(zhì)細胞可直接吞噬血管內(nèi)皮細胞造成血管結(jié)構(gòu)崩解，也可誘導過度的炎癥反應(yīng)造成血管屏障功能破壞，從而導致微循環(huán)損傷[1-2]。本課題組前期研究已證實，活化的小膠質(zhì)細胞在RIR中對微循環(huán)產(chǎn)生破壞作用，抑制小膠質(zhì)細胞活化可減少視網(wǎng)膜中炎性因子的釋放[3]。因此，抑制小膠質(zhì)細胞的活化可能是保護缺血組織微循環(huán)的重要途徑。C-X3-C基序趨化因子受體1(C-X3-C motif chemokine receptor 1，cx3cr1)是主要表達于小膠質(zhì)細胞的一種趨化因子受體，cx3cr1抗體與cx3cr1結(jié)合后，可以抑制小膠質(zhì)細胞的活性[4]。本研究擬探討cx3cr1抗體對RIR過程中視網(wǎng)膜微循環(huán)的保護作用，以期為臨床上相關(guān)疾病的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及分組 選擇SPF級4～5周齡健康C57BL/6小鼠150只，雌雄不限，體質(zhì)量25～28 g。實驗動物由昆明醫(yī)科大學動物科提供，實驗動物的喂養(yǎng)及使用均遵循《實驗動物管理條例》，本實驗方案經(jīng)昆明醫(yī)科大學倫理委員會審核批準(批文號：20180106)。實驗前經(jīng)檢查實驗鼠雙眼前節(jié)和眼底均正常。采用隨機數(shù)字表法將實驗動物隨機分為空白對照組、模型組和cx3cr1抗體注射組，每組50只?？瞻讓φ战M小鼠僅玻璃體腔注射無菌注射用水，模型組小鼠采用前房灌注升高眼壓法建立RIR模型，cx3cr1抗體注射組小鼠采用cx3cr1抗體玻璃體腔注射后4 h建立RIR模型，均以右眼為實驗眼。

1.1.2主要試劑及儀器 多聚甲醛(美國Sigma公司)；氯胺酮、鹽酸賽拉嗪(廣州深安科技有限公司)；抗兔Iba-1抗體(013-26471，日本W(wǎng)ako公司)；抗鼠cx3cr1抗體(377227，美國Santa Cruze公司)；羊抗兔熒光二抗(AP510)、羊抗鼠熒光二抗(AP300P)、兔抗羊熒光二抗(AP106R)、驢血清(美國Millipore公司)；Trizol試劑(美國Life Technologies公司)；SYBR?Green Master Mix試劑(美國Roche公司)；Prime Script RT reagent試劑盒(日本Takara公司)；FITC-dextran、GS-Isolectin B4(美國Invitrogen公司)。Quant Studio 6 Flex Q-PCR儀(美國Life Technologies公司)；顯微手術(shù)器械(美國WPI公司)；激光掃描共焦顯微鏡(LSM710，德國Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗鼠cx3cr1抗體玻璃體腔注射 小鼠腹腔內(nèi)注射氯胺酮和鹽酸賽拉嗪行全身麻醉，復方托吡卡胺滴眼液擴瞳后采用奧布卡因滴眼液點眼行表面麻醉，稍用力壓迫上下眼瞼使眼球突出眼眶，用微量注射器由角膜緣后1 mm進針至玻璃體腔，空白對照組小鼠注射無菌注射用水2 μl；cx3cr1抗體注射組注射用無菌注射用水稀釋的0.2 μg/μl cx3cr1抗體2 μl。如有角膜水腫等高眼壓表現(xiàn)行前房穿刺，并用妥布霉素滴眼液點眼，注射后放回飼養(yǎng)籠中。

1.2.2RIR動物模型建立 參照文獻[5-7]中的方法建立RIR模型。將全身麻醉的小鼠采取俯臥位，四肢固定于自制的固定器上，使用復方托吡卡胺滴眼液點眼擴瞳，將30G針頭與生理鹽水瓶連接，將針頭刺入前房并固定，緩慢升高生理鹽水瓶使液面提高150 cm，眼壓升高至110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，持續(xù)60 min后逐漸降低輸液瓶高度至動物眼球水平，拔出前房灌注針頭，恢復視網(wǎng)膜血供。眼壓升高后可見小鼠角膜逐漸水腫、角膜緣血管閉鎖、虹膜顏色變淺；眼底觀察可見視網(wǎng)膜血供減少，視網(wǎng)膜血管阻斷。針頭拔出后可見小鼠角膜水腫逐漸消失并恢復透明，角膜緣血管重新充血，虹膜顏色逐漸恢復，視網(wǎng)膜逐漸恢復紅潤，實現(xiàn)血液再灌注。實驗動物蘇醒后，回籠飼養(yǎng)，模型誘導后72 h進行相應(yīng)指標檢測。

1.2.3免疫熒光染色法觀察視網(wǎng)膜冰凍切片小膠質(zhì)細胞活化情況 每組任意選取10只小鼠過量麻醉法處死，剖取眼球，并進行OCT包埋，沿平行于晶狀體前后表面經(jīng)線方向行冰凍切片，切片厚4～5 μm。將切好備用的眼球冰凍切片從-80 ℃冰箱中取出，室溫條件下自然風干30 min；將切片浸入新鮮配制的質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛中固定20 min；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗，室溫下浸入體積分數(shù)0.1% TritonX-100溶液中破膜15 min；PBS漂洗3次，每次10 min，滴加體積分數(shù)5%驢血清室溫封閉1 h；滴加Iba-1抗體(1∶ 200)于濕盒中4 ℃孵育24 h；PBS漂洗3次，每次10 min，滴加相應(yīng)熒光二抗(1∶ 1 000)常溫下避光孵育1 h；PBS漂洗3次，每次10 min；用含DAPI的抗熒光淬滅油性封片劑封片；滴入少許指甲油增加蓋玻片和載玻片之間的穩(wěn)固性，待指甲油干后于熒光顯微鏡下計數(shù)每個視野(400倍視野下)視網(wǎng)膜各層中Iba-1陽性細胞數(shù)。

1.2.4免疫熒光染色法觀察視網(wǎng)膜鋪片活化小膠質(zhì)細胞 每組任意選取10只小鼠，過量麻醉法處死后摘出眼球，4%多聚甲醛固定2 h。手術(shù)顯微鏡下去除角膜、虹膜、晶狀體，仔細清理玻璃體以防止玻璃體殘留影響染色效果，剝離鞏膜及脈絡(luò)膜，將視網(wǎng)膜朝視神經(jīng)方向剪成4瓣，可鋪平為原則。甲醇固定視網(wǎng)膜后15 min，使用含體積分數(shù)20%胎牛血清和體積分數(shù)0.5% Triton的100倍PBS進行封閉打孔1 h；抗Iba-1抗體(1∶ 200)4 ℃冰箱中孵育24 h，滴加相應(yīng)熒光二抗(1∶ 1 000)常溫下避光孵育1 h；用含DAPI的抗熒光淬滅油性封片劑封片。熒光顯微鏡200倍視野下計數(shù)任意3個區(qū)域每個視野范圍內(nèi)的呈阿米巴樣活化小膠質(zhì)細胞數(shù)。

1.2.5免疫熒光染色法觀察視網(wǎng)膜鋪片血管和活化小膠質(zhì)細胞共染色 每組任意選取10只小鼠過量麻醉處死后取出眼球，參照1.2.4部分步驟進行視網(wǎng)膜鋪片，使用含體積分數(shù)20%胎牛血清和0.5% Triton的100倍PBS進行封閉打孔1 h；加入血管染色劑GS-Isolectin B4(1∶ 200)4 ℃孵育過夜，加入抗Iba-1抗體(1∶ 200)4 ℃冰箱中孵育24 h，分別滴加相應(yīng)熒光二抗(1∶ 1 000)常溫下避光孵育1 h后封片。熒光顯微鏡下觀察血管結(jié)構(gòu)損傷情況，采用multi-gauge軟件計算淺層及深層毛細血管密度，觀察小膠質(zhì)細胞活化與血管的關(guān)系。

表1 PCR引物序列Table1 PCR primer sequences基因正向引物(5’-3’)反向引物(5’-3’)VEGF-ACAGAAGGAGAGCAGAAGTCCCTCCAGGGCTTCATCGTTAHIF-1αCCAGCAGACTCAAATACAAGAACCTGTATGTGGGTAGGAGATGGAGATTNF-αAAATGGGCTTTCCGAATTCACAGGGAAGAATCTGGAAAGGTIL-1βTGAAATGCCACCTTTTGACAGCCACAGCCACAATGAGTGATACβ-actinGGCACCAGGGCGTGATGGGTCTCAAACATGATCTGGGTC 注:PCR:聚合酶鏈式反應(yīng);VEGF:血管內(nèi)皮生長因子;HIF:缺氧誘導因子;TNF:腫瘤壞死因子;IL:白細胞介素;β-actin:β-肌動蛋白 Note:PCR:polymerase chain reaction;VEGF:vascular endothelial growth factor;HIF:hypoxia inducible factor;TNF:tumor necrosis factor;IL:interleukin

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜冰凍切片Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞表達分布(×200，標尺=50 μm) Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞呈紅色熒光(TRITC)，細胞核呈藍色熒光(DAPI) A：空白對照組視網(wǎng)膜IPL內(nèi)可見極少量Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞 B：模型組IPL、INL及OPL可見較多Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞 C：cx3cr1抗體注射組視網(wǎng)膜各層Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)較模型組明顯減少Figure 1 The distribution of Iba-1 positive microglia in different layers of mice retina (×200，bar=50 μm) Iba-1 positive microglia showed red fluorescence (TRITC)，and nucleus presented blue fluorescence (DAPI) A：A small amount of Iba-1 positive microglia were seen in the IPL of retina in the blank control group B：In the model group，more Iba-1 positive microglia were seen in the IPL，INL and OPL C：The number of Iba-1 positive cells was reduced in the cx3cr1 injection group in comparison with the model group

1.2.6左心室FITC-dextran造影檢查視網(wǎng)膜血管滲漏情況 FITC-dextran溶于無菌生理鹽水中，質(zhì)量濃度為50 mg/ml，離心半徑15 cm，3 000 r/min離心10 min后取上清備用。將每組10只小鼠常規(guī)麻醉固定，剪開胸骨，打開胸腔，將1 ml FITC-dextran溶液注入左心室，觀察小鼠的口、鼻、耳廓變黃為灌注成功。摘取小鼠眼球并標記方向，于4%多聚甲醛中固定1 h；然后在手術(shù)顯微鏡下沿角膜緣剪開球壁，去除晶狀體、玻璃體，用虹膜恢復器將視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層與色素上皮層分離，取視網(wǎng)膜感覺層在PBS中漂洗，清除殘存玻璃體，最后將視網(wǎng)膜平鋪在玻片上，穿刺刀以視盤為中心放射狀切開，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并照像。采用ImageJ軟件測量滲漏面積，計算相對滲漏率。相對滲漏率=cx3cr1抗體注射組滲漏面積/空白對照組滲漏面積×100%。

1.2.7實時熒光定量PCR法檢測視網(wǎng)膜中缺氧相關(guān)因子和炎性因子mRNA表達 每組任意選取10只小鼠過量麻醉處死后摘除眼球，分離出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，在PBS液中漂洗，加入Trizol 1 ml，劇烈振蕩，溶解離心提取總RNA；逆轉(zhuǎn)錄生成模板cDNA。設(shè)計并合成缺氧相關(guān)因子血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)及炎性因子表達腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，各目的基因引物序列見表1。反應(yīng)體系為：PCR Buffer 5 μl，MgCl25 μl，dNTP 1 μl，目的基因正反向引物各2 μl，Taq探針1 μl。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性50 s，55 ℃退火及延伸30 s，共45次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件(10034432，美國IBM SPSS公司)進行統(tǒng)計分析。本研究中計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。采用隨機分組單因素干預多水平研究設(shè)計，3個組各檢測指標總體差異比較均采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。采用雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1陽性細胞表達分布比較

空白對照組小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞稀少，分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層，視網(wǎng)膜外層未見Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞。模型組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)明顯增多，并向外叢狀層、外核層移動。Cx3cr1抗體注射組小鼠視網(wǎng)膜各層Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)較模型組明顯減少(圖1)。3個組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層活化小膠質(zhì)細胞數(shù)總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=92.98、125.22、33.51、28.18，均P<0.01)，模型組小鼠視網(wǎng)膜各層活化小膠質(zhì)細胞數(shù)明顯多于空白對照組和cx3cr1抗體注射組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表2)。

表2 3個組視網(wǎng)膜各層活化小膠質(zhì)細胞數(shù)比較(mean±SD,/視野)Table 2 Comparison of the number of activated microglial cells in different layers ofretina among the three groups (mean±SD,/field)組別樣本量視網(wǎng)膜各層活化小膠質(zhì)細胞數(shù)GCLIPLINLOPL空白對照組102.0±1.20.3±0.60.00.0模型組1010.2±1.5a15.6±2.8a4.1±1.5a3.9±1.5acx3cr1抗體注射組107.0±1.2ab11.9±2.6ab2.7±1.2b2.5±1.4abF值92.98125.2233.5128.18P值<0.01<0.01<0.01<0.01 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) GCL:神經(jīng)節(jié)細胞層;IPL:內(nèi)叢狀層;INL:內(nèi)核層;OPL:外叢狀層;cx3cr1:C-X3-C基序趨化因子受體1 Note:Compared with the blank control group,aP<0.05;compared with the model group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) GCL:ganglion cell layer;IPL:inner plexiform layer;INL:inner nuclear layer;OPL:outer plexiform layer;cx3cr1:C-X3-C motif chemokine receptor 1

2.2 各組小鼠視網(wǎng)膜活化小膠質(zhì)細胞數(shù)量及形態(tài)變化

Iba-1染色結(jié)果顯示，空白對照組小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1陽性細胞數(shù)量稀少，且細胞體小，呈長分枝狀。模型組小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1陽性細胞數(shù)量最多，且細胞體明顯膨大，分枝縮短呈阿米巴樣，甚至球形。Cx3cr1抗體注射組較模型組Iba-1陽性細胞和變形細胞數(shù)量減少?？瞻讓φ战M、模型組和cx3cr1抗體注射組視網(wǎng)膜中Iba-1陽性細胞數(shù)分別為(13.8±3.6)、(62.2±4.8)和(34.8±2.6)/視野，組間總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=413.32，P<0.01)；其中cx3cr1抗體注射組Iba-1陽性細胞數(shù)明顯少于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜鋪片Iba-1陽性細胞數(shù)量和形態(tài)變化 A：空白對照組視網(wǎng)膜中Iba-1陽性細胞數(shù)量稀少，且細胞體小，呈長分枝狀(FITC ×200，標尺=50 μm) B：模型組視網(wǎng)膜中可見大量Iba-1陽性細胞，且細胞體明顯膨大，呈阿米巴樣或球形(FITC ×200，標尺=50 μm) C：cx3cr1抗體注射組較模型組細胞數(shù)量減少(FITC ×200，標尺=50 μm) D：各組小鼠視網(wǎng)膜鋪片Iba-1陽性細胞量化比較 F=413.32，P<0.01與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=10)Figure 2 Quantitative and morphological changes of Iba-1 positive cells in mice retinal preparation of each group A：The Iba-1 positive cells in the blank control group were scarce，and the cell bodies were small，showing long branches (FITC ×200，bar=50 μm) B：A large number of Iba-1 positive cells were seen in the model group，and the cell bodies were obviously enlarged，presenting amoeba-like or spherical (FITC ×200，bar=50 μm) C：The number of Iba-1 positive cells in the cx3cr1 injection group was reduced in comparison with the model group (FITC ×200，bar=50 μm) D：Quantitative comparison of Iba-1 positive cells among the three groups F=413.32，P<0.01.Compared with the blank control group，aP<0.05；compared with the model group，bP<0.05 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=10)

2.3 各組小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞與視網(wǎng)膜血管共同染色情況比較

空白對照組可見視網(wǎng)膜血管管徑及走行正常，血管網(wǎng)間及各級血管附近僅見少量活化小膠質(zhì)細胞。模型組視網(wǎng)膜血管明顯擴張，血管周圍及血管表面可見大量阿米巴樣或球形小膠質(zhì)細胞。Cx3cr1抗體注射組血管周圍及血管壁表面變形小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯減少。各組視網(wǎng)膜深層血管網(wǎng)表現(xiàn)與淺層血管網(wǎng)接近(圖3)。3個組視網(wǎng)膜淺層血管密度總體比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.01，P=0.99)，深層血管密度總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=9.53，P<0.01)；其中模型組視網(wǎng)膜深層血管密度明顯低于空白對照組和cx3cr1抗體注射組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表3)。3個組間淺層、深層視網(wǎng)膜血管周圍活化小膠質(zhì)細胞數(shù)總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=134.02、84.88，均P<0.01)；其中模型組視網(wǎng)膜血管周圍活化小膠質(zhì)細胞數(shù)明顯高于cx3cr1抗體注射組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表4)。

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜鋪片血管與活化小膠質(zhì)細胞共染色(×200，標尺=50 μm) 小鼠視網(wǎng)膜血管呈紅色熒光(GS-IB4)，活化小膠質(zhì)細胞呈綠色熒光(FITC) A：空白對照組淺層毛細血管網(wǎng)管徑和血管走行正常，血管周圍僅有少量活化小膠質(zhì)細胞 B：模型組淺層視網(wǎng)膜血管擴張，血管附近可見大量阿米巴樣或球形活化小膠質(zhì)細胞 C：cx3cr1抗體注射組淺層視網(wǎng)膜血管附近活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量較模型組明顯減少 D：空白對照組深層視網(wǎng)膜血管網(wǎng)走行正常，僅見少量活化小膠質(zhì)細胞 E：模型組深層視網(wǎng)膜血管網(wǎng)周圍可見大量活化小膠質(zhì)細胞 F：cx3cr1抗體注射組深層視網(wǎng)膜血管網(wǎng)周圍活化小膠質(zhì)細胞數(shù)明顯少于模型組Figure 3 Co-staining of blood vessels and active microglia in retinal whole mounts of each group (×200，bar=50 μm) Mice retinal blood vessels showed red fluorescence (GS-IB4)，and activated microglia presented green fluorescence (FITC) A：The diameter of the superficial capillary network and the running of the blood vessel were normal in the blank control group，and there were only a small amount of activated microglia around blood vessel B：The superficial blood vessels in the model group were significantly dilated，and a large number of amoebic or spherical activated microglia cells were present near the blood vessels C：The number of activated microglia near the superficial blood vessels in the cx3cr1 injection group was significantly reduced in comparison with the model group D：The deep retinal vascular network ran normally，and only a few activated microglia were seen in the blank control group E：A large number of activated microglia could be seen around the deep retinal network in the model groupF：The number of activated microglial cells around the deep retinal vascular network was significantly less in the cx3cr1 injection group than that in the model group

表3 3個組視網(wǎng)膜不同層次血管數(shù)目比較(mean±SD,/視野)Table 3 Comparison of the number of vessels in differentretinal layers among the three groups(mean±SD,/field)組別樣本量不同層次視網(wǎng)膜血管數(shù)目淺層深層空白對照組10129.50±8.22a320.80±13.35a模型組10129.10±7.69301.50±7.89cx3cr1抗體注射組10129.20±6.60a313.50±7.65aF值0.019.53P值0.99<0.01 注:與各自模型組比較,aP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗) Note:Compared with respective model group,aP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test)

表4 3個組視網(wǎng)膜不同層次血管周圍活化小膠質(zhì)細胞數(shù)比較(mean±SD,/視野)Table 4 Comparison of the number of perivascular activatedmicroglial cells in different retinal layers among the threegroups (mean±SD,/field)組別樣本量不同層次血管周圍活化小膠質(zhì)細胞數(shù)淺層深層空白對照組105.30±2.11a1.50±1.27a模型組1031.90±5.6318.40±3.60cx3cr1抗體注射組1019.20±1.87a12.20±3.36aF值134.0284.88P值<0.01<0.01 注:與各自模型組比較,aP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗) Note:Compared with respective model group,aP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test)

2.4 各組小鼠視網(wǎng)膜血管滲漏面積比較

空白對照組小鼠視網(wǎng)膜毛細血管呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，走行和排列規(guī)則，未見熒光素滲漏(圖4A)；模型組毛細血管結(jié)構(gòu)紊亂，部分毛細血管形成異常吻合，可見明顯的熒光素滲漏，部分毛細血管閉塞，可見無灌注區(qū)(圖4B)；cx3cr1抗體注射組毛細血管閉塞減少，血管滲漏減輕(圖4C)?？瞻讓φ战M、模型組和cx3cr1抗體注射組視網(wǎng)膜血管相對滲漏率分別為(100.0±4.7)%、(162.1±10.6)%和(130.5±9.5)%，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=128.66，P<0.01)；模型組小鼠視網(wǎng)膜血管相對滲漏率明顯高于空白對照組和cx3cr1抗體注射組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖4D)。

2.5 各組小鼠視網(wǎng)膜中缺氧相關(guān)因子及炎性因子mRNA表達

各組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF-A、TNF-α、HIF-1α和IL-1β mRNA相對表達量總體比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=154.26、206.39、140.68、175.12，均P<0.01)；模型組視網(wǎng)膜中VEGF-A、TNF-α、HIF-1α和IL-1β mRNA相對表達量明顯高于空白對照組和cx3cr1抗體注射組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表5)。

圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜血管滲漏情況比較 A：空白對照組小鼠視網(wǎng)膜毛細血管網(wǎng)未見熒光素滲漏(FITC-dextran ×200，標尺=50 μm) B：模型組小鼠毛細血管結(jié)構(gòu)紊亂，可見毛細血管形成異常吻合及滲漏(FITC-dextran ×200，標尺=50 μm) C：cx3cr1抗體注射組小鼠血管滲漏有所減輕(FITC-dextran ×200，標尺=50 μm) D：各組視網(wǎng)膜血管相對滲漏率比較 F=128.66，P<0.01.與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=10)Figure 4 Comparision of mice retinal vascular leakage in each group A：No fluorescein leakage was observed in retinal capillary network of the blank control group (FITC-dextran ×200，bar=50 μm) B：The capillary structure in the model group was disordered，and abnormal capillary formation and vascular leakage was observed (FITC-dextran ×200，bar=50 μm) C：The mice retinal vascular leakage in the cx3cr1 injection group was reduced in comparison with the model group (FITC-dextran ×200，bar=50 μm) D：Comparison of relative retinal vascular leakage rate among the three groups F=128.66，P<0.01.Compared with the blank control group，aP<0.05；compared with the model group，bP <0.05 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=10)

表5 各組小鼠視網(wǎng)膜中缺氧相關(guān)因子和炎性因子mRNA相對表達量比較(mean±SD)Table 5 Comparison of relative mRNA expression of hypoxia related factor andinflammatory factor among the three groups(mean±SD)組別樣本量各因子mRNA相對表達量VEGF-ATNF-αHIF-1αIL-1β空白對照組101.00±0.14a1.00±0.14a1.00±0.14a1.00±0.14a模型組102.76±0.324.00±0.393.93±0.524.10±0.50cx3cr1抗體注射組102.02±0.18a2.47±0.40a3.11±0.45a2.52±0.38aF值154.26206.39140.68175.12P值<0.01<0.01<0.01<0.01 注:與各自模型組比較,aP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗) VEGF:血管內(nèi)皮生長因子;TNF:腫瘤壞死因子;HIF:缺氧誘導因子;IL:白細胞介素;cx3cr1:C-X3-C基序趨化因子受體1 Note:Compared with respective model group,aP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test) VEGF:vascular endothelial growth factor;TNF:tumor necrosis factor;HIF:hypoxia inducible factor;IL:Interleukin;cx3cr1:C-X3-C motif chemokine receptor 1

3 討論

近年來，對于RIR損傷中微循環(huán)保護或治療的研究大多聚焦于VEGF的表達?？筕EGF藥物在治療RIR損傷性疾病過程中對于血管通透性損傷、組織水腫等微循環(huán)有一定的改善作用，但其仍未能從根本上解決微循環(huán)損傷，存在治療效果有限、治療時限性短等問題[8-9]，因此，仍需研究RIR微循環(huán)損傷發(fā)生的具體機制，以探索更為有效而持久的治療方法。

Cx3cr1是小膠質(zhì)細胞核神經(jīng)元之間的信號傳遞者，在小膠質(zhì)細胞的活化中發(fā)揮著調(diào)控作用，小膠質(zhì)細胞中豐富表達cx3cr1[10-11]。本課題組前期實驗結(jié)果及大量的文獻報道均證明，當RIR時，視網(wǎng)膜細胞及組織內(nèi)的cx3cr1表達升高，進而激活小膠質(zhì)細胞，因此推測阻斷cx3cr1與其配體結(jié)合，從而抑制小膠質(zhì)細胞活化，減少其對微循環(huán)的損傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體腔注射cx3cr1抗體能夠抑制RIR模型小鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細胞活化為阿米巴樣的形態(tài)，且活化細胞數(shù)量和遷移至視網(wǎng)膜深層的細胞數(shù)量均明顯減少。

Ebneter等[12]在激光誘導視網(wǎng)膜靜脈阻塞的動物模型中發(fā)現(xiàn)，阻塞的血管周圍活化小膠質(zhì)細胞密度明顯增加。Jolivel等[1]在腦部缺血—再灌注損傷模型中觀察到，活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)存在血管內(nèi)皮細胞的標志物，證實小膠質(zhì)細胞可以直接吞噬血管內(nèi)皮細胞而造成血管結(jié)構(gòu)的直接損傷。以上研究表明，抑制小膠質(zhì)細胞活化可能對缺血損傷中的微循環(huán)具有保護作用。Iba-1高度特異性表達于活化小膠質(zhì)細胞中，因此將其作為活化小膠質(zhì)細胞的標志物[12]。本研究還發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞活化被抑制后RIR模型小鼠微循環(huán)的損傷有所減少，視網(wǎng)膜深層血管密度有所增加，閉鎖的血管減少，血管滲漏率明顯下降，從結(jié)構(gòu)和功能2個方面研究證實了抑制小膠質(zhì)細胞活化可以保護RIR中的微循環(huán)。以往文獻報道，活化小膠質(zhì)細胞可對血管壁造成直接損傷，并通過調(diào)控炎癥反應(yīng)破壞視網(wǎng)膜—血管屏障[13-14]。本研究結(jié)果顯示，抑制小膠質(zhì)細胞的活性后小膠質(zhì)細胞向血管遷移的能力明顯下降，黏附于血管壁的細胞數(shù)量明顯減少；另一方面，小膠質(zhì)細胞活化受到抑制后，視網(wǎng)膜組織中與血管損傷密切相關(guān)的因子VEGF、HIF、TNF-α mRNA表達均明顯下調(diào)；其中VEGF和HIF的表達下調(diào)證明組織缺血缺氧的情況得到緩解，微循環(huán)功能得到改善[15-16]；炎性因子TNF-α表達下調(diào)，推測組織炎癥反應(yīng)得到控制，從而保護了微循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能。

綜上所述，本研究證實了活化小膠質(zhì)細胞對RIR中微循環(huán)的破壞作用，采用抗體中和的方法抑制小膠質(zhì)細胞活化可有效保護視網(wǎng)膜微循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能，為視網(wǎng)膜和其他組織缺血再灌注損傷的治療提供了新思路。本研究仍存在一些不足，如僅探討了抑制小膠質(zhì)細胞活化對視網(wǎng)膜微循環(huán)的影響，而缺血—再灌注損傷對組織微循環(huán)的損傷是一個復雜的過程，其中涉及許多細胞因子和信號通路[17-18]；此外，本研究僅檢測了缺氧反應(yīng)因子和炎性因子基因表達水平，各因子的蛋白表達水平及其在RIR中的作用還需要進一步驗證，RIR過程中神經(jīng)血管單元與膠質(zhì)細胞的互作具體機制等問題仍有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突